- Издательство «Медиа Сфера»
Ключевую роль в функционировании гипоталамо-гипофизарно-гонадной (ГГГ) оси играют рецепторы лютеинизирующего гормона (ЛГР), с которыми специфически связываются как ЛГ, так и его структурный и функциональный гомолог — хорионический гонадотропин человека (ХГЧ). Функционально активный ЛГ представляет собой гетеродимер с высококонсервативной α-субъединицей и вариабельной β-субъединицей, определяющей специфичность связывания с ЛГР. Практическое применение ЛГ и ХГЧ ограничено необходимостью их парентерального введения, быстрым снижением чувствительности тканей-мишеней к ним, иммуногенностью, высокой стоимостью. Одной из актуальных задач современной эндокринологии является разработка новых регуляторов ЛГР, в том числе отличающихся от ЛГ по механизму действия на ткани репродуктивной системы.
ЛГР относится к семейству рецепторов серпантинного типа с семью трансмембранными доменами, пронизывающими плазматическую мембрану клетки [1—3]. Эти домены соединены между собой тремя внеклеточными и тремя цитоплазматическими петлями. Первому трансмембранному домену предшествует эктодомен (около 400 аминокислотных остатков), в котором локализуется сайт, отвечающий за связывание с ЛГ или ХГЧ. Это отличает ЛГР и родственные ему рецепторы фолликулостимулирующего (ФСГ) и тиреотропного гормонов (ТТГ) от других рецепторов серпантинного типа, в которых лигандсвязывающий сайт расположен внутри трансмембранного канала. В ЛГР внутри трансмембранного канала также имеется сайт, который вовлечен в аллостерическую регуляцию активности ЛГР, но не участвует в связывании гонадотропинов [2, 4].
Аллостерический сайт рецептора ЛГ оказался в центре внимания фармакологов и эндокринологов в 2002 г., когда в результате скрининга тысяч органических соединений были открыты тиенопиримидиновые производные (ТП) с активностью агонистов ЛГР [5]. Они, минуя эктодомен, проникают внутрь трансмембранного канала и специфически взаимодействуют с расположенным там аллостерическим сайтом, регулируя тем самым активность ЛГР [6—8]. Десять лет назад были начаты исследования по созданию и изучению низкомолекулярных регуляторов ЛГР. Настоящий обзор посвящен достижениям в области разработки ТП, являющихся в настоящее время наиболее активными низкомолекулярными регуляторами ЛГР, и перспективам их использования в клинической эндокринологии.
In vitro изучали связывание ТП с ЛГР, их способность влиять на активность ферментов, генерирующих вторичные посредники (аденилатциклазу (АЦ) и фосфолипазу С (ФЛС), функционально связанные с ЛГР гетеротримерными G
Среди первых ТП с активностью агонистов ЛГР наиболее активным было соединение Org 41841, N-трет-бутил-5-амино-4-(3-метоксифенил)-2-(метилтио)тиено[2,3-D]пиримидин-6-карбоксамид [5]. Путем его модификации был получен более активный аналог Org 43553, который до сих пор считают «золотым стандартом» низкомолекулярных агонистов ЛГР [9, 10]. Соединение Org 43553 с высокой аффинностью (K
ТП стимулируют и ФЛС, но для этого требуются более высокие их концентрации. Так, Org 43553 влиял на ФЛС только в концентрациях 10–6 и 10–5 М, но при этом в 20 раз слабее, чем ЛГ [11]. Таким образом, ТП сравнительно слабо и только в микромолярных концентрациях активируют Ca2+-зависимые пути, регулируемые через G
В пользу этого свидетельствуют данные о влиянии синтезированных нами ТП на активность АЦ и G
In vivo ТП усиливают стероидогенез и вызывают овуляцию как при парентеральном, так и при пероральном введении, что обусловлено их устойчивостью к действию пищеварительных ферментов и всасыванием в желудочно-кишечном тракте [14—17]. Сохранение высокой активности при пероральном введении является уникальной особенностью ТП и открывает широкие перспективы для их практического использования в клинике.
Еще в 2009 г. было показано, что пероральное введение Org 43553 вызывает овуляцию у мышей и крыс [14]. В дозе 50 мг/кг Org 43553 вызывал овуляцию у 80% неполовозрелых BDFI-мышей при среднем числе овулировавших яйцеклеток 9,3 на животное. Следует, однако, отметить, что по эффективности Org 43553 заметно уступал ХГЧ, который при подкожном введении в дозе 500 МЕ/кг вызывал овуляцию у 100% мышей со средним числом овулировавших яйцеклеток, равным 58. В то же время при использовании физиологически более адекватной модели (половозрелые крысы, получавшие антагонист люлиберина) индукция овуляции (10—15 овулировавших яйцеклеток), вызываемая пероральным введением Org 43553 (25 мг/кг), была сопоставимой с таковой для ХГЧ. Овуляцию наблюдали и при более низких концентрациях Org 43553 (5 и 10 мг/кг), а в концентрации 50 мг/кг эффективность Org 43553 превосходила таковую ХГЧ [14]. Полученные при этом яйцеклетки были хорошего качества, характеризовались высокой фертильностью, при имплантации давали нормальные эмбрионы. В этой связи следует отметить, что при овуляции, вызываемой ХГЧ, яйцеклетки плохо имплантировались и давали очень низкий выход нормальных эмбрионов [14, 18].
Пероральное введение Org 43553 в дозе 10 мг/кг самцам крыс через 4 ч приводило к двукратному повышению у них уровня тестостерона. В более высоких дозах, 50 и 250 мг/кг, Org 43553 повышал уровень тестостерона в 5 раз и более в период от 1 до 8 ч после введения [14]. В этих дозах эффект Org 43553 был сопоставимым с эффектом ХГЧ. Динамика уровня тестостерона при длительном (7 сут) пероральном введении Org 43553 в дозе 250 мг/кг была сходной с таковой для эффекта ХГЧ. В первые сутки Org 43553 значительно повышал уровень гормона, через 48 ч следовал сильно выраженный спад (до исходного уровня), затем вновь повышение в 2—3 раза. Высокая эффективность Org 43553 при пероральном введении обусловлена его биодоступностью, которая у крыс составила 79%. Биодоступность препарата у собак также была значительной и достигала 44%, что сопоставимо и даже превосходит биодоступность препарата при парентеральном введении [14].
Мы сравнили активность TP01 и TP02 у самцов крыс in vivo при различных способах введения препаратов [15]. При внутрибрюшинном введении TP01 в дозах 15 и 27 мг/кг через 5 ч уровень тестостерона возрастал на 339 и 325%, что составило 45% от соответствующего эффекта ХГЧ (250 МЕ/крыса). При пероральном введении в дозе 50 мг/кг TP01 через 3 и 5 ч повышал концентрацию тестостерона на 230 и 417%. TP02, активный в экспериментах in vitro, в дозах 15 и 45 мг/кг при внутрибрюшинном введении и в дозе 50 мг/кг при пероральном введении, не влиял на уровень тестостерона. В то же время при интратестикулярном введении, которое обеспечивает доставку препарата непосредственно к клеткам Лейдига, TP02 в дозе 8 мг/кг через 1, 3 и 5 ч после инъекции повышал уровень тестостерона на 115, 84 и 37% соответственно [15]. Отсутствие у TP02 влияния на уровень тестостерона при внутрибрюшинном и пероральном введении, как мы полагаем, связано с быстрой его деградацией в кровяном русле. Таким образом, нами разработано новое соединение TP01, которое сопоставимо по активности in vivo с гонадотропинами, а также с соединением Org 43553 и его активными аналогами и может быть применено для стимуляции стероидогенеза и контроля других физиологических и биохимических процессов, регулируемых ЛГ.
Важной особенностью ТП является их более высокая в сравнении с гонадотропинами скорость деградации. У крыс период полувыведения Org 43553 составил 3,4—4,5 ч, что в 3 раза меньше, чем для ХГЧ [17]. Уменьшение времени полувыведения ТП снижает риск синдрома гиперстимуляции яичников (ГСЯ), который часто развивается при индукции суперовуляции с помощью ХГЧ или рекомбинантного ЛГ (при проведении экстракорпорального оплодотворения и при других вспомогательных репродуктивных технологиях). Однократная обработка половозрелых крыс ХГЧ или ЛГ значительно увеличивала размеры яичников, повышала проницаемость сосудов, приводила к гиперсекреции зернистыми клетками фактора роста эндотелия сосудов, что является характерными чертами синдрома ГСЯ. При однократном пероральном введении Org 43553 в дозах от 25 до 250 мг/кг не наблюдали заметного увеличения размеров яичников и проницаемости сосудов. Даже многократная обработка ТП не приводила к синдрому ГСЯ. Это связано с отсутствием влияния Org 43553 на продукцию фактора роста эндотелия сосудов, важнейшего регулятора ангиогенеза, который повышает проницаемость сосудов. В то же время при обработке крыс даже сравнительно низкими дозами гонадотропинов концентрация фактора роста эндотелия сосудов достоверно повышалась [17].
Успехи, достигнутые при изучении стимулирующего влияния ТП на овуляцию у грызунов, позволили перейти к их клиническим испытаниям на людях, для чего были выбраны соединение Org 43553 и его аналог Org 43902 [16]. Препараты вводили перорально женщинам-добровольцам репродуктивного возраста в широком диапазоне доз (Org 43553 — от 5 до 2700 мг, Org 43902 — от 10 до 600 мг). Максимальные концентрации Org 43553 достигались через 0,5—1 ч после введения с последующим плавным снижением в течение 2—3 ч. В случае Org 43902 максимальные концентрации достигались в те же сроки, за исключением высокой дозы препарата (600 мг), при которой пик концентрации достигался через 3 ч. Период полувыведения Org 43902 составил 17—22 ч и был заметно короче такового для Org 43553 (30–47 ч) и чХГ (32—33 ч). Частота овуляции при возрастании дозы препаратов повышалась, и в дозе 300 мг ТП вызывали овуляцию у 82—83% женщин. Признаков синдрома ГСЯ при приеме ТП выявлено не было. Отсутствовали изменения в функционировании тиреоидной системы и надпочечников [16]. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности применения ТП для индукции овуляции в клинике.
Способность ТП повышать уровень тестостерона, выявленная в опытах на животных, может быть использована для компенсации андрогенной недостаточности, а также для увеличения объема и силы мышц у атлетов в качестве анаболических препаратов. Косвенным указанием на это является предложение внести ТП (в первую очередь Org 43553) в список препаратов, которые должны определяться у спортсменов при доппинг-контроле [19].
Одной из причин снижения или потери чувствительности клеток Лейдига и фолликулярных клеток яичников к ЛГ являются мутации в ЛГР. Мутантные рецепторы не способны к транслокации в плазматическую мембрану, несмотря на сохранение способности связываться с Л.Г. Вследствие мутаций нарушается конформация ЛГР, необходимая для его правильного процессинга и транслокации, что в конечном итоге приводит к его деградации в протеосомах. Мутантные ЛГР выявлены у пациентов с нарушениями репродуктивной функции, вызванными гипоплазией клеток Лейдига [20, 21]. Выраженность таких нарушений зависит от того, насколько мутация меняет функциональную активность ЛГР и его способность встраиваться в плазматическую мембрану. Как правило, заместительная терапия гонадотропинами пациентов с мутациями в ЛГР не дает эффекта.
Ситуация казалась безвыходной, пока не было обнаружено, что ТП, достаточно липофильные молекулы, легко проникают в клетку через мембрану и там связываются с еще не зрелыми формами мутантных ЛГР. Это приводит к стабилизации биологически активной конформации ЛГР, нормализует их процессинг в клетке, позволяет мутантному рецептору в комплексе с низкомолекулярным агонистом достичь плазматической мембраны [22]. Поскольку во многих случаях способность активироваться гонадотропином у мутантного ЛГР сохранена, чувствительность клетки к ЛГ или ХГЧ в этом случае восстанавливается. Важно и то, что сам низкомолекулярный агонист переводит ЛГР в активированное состояние. Способность Т.П. восстанавливать чувствительность репродуктивных тканей к гонадотропинам является одной из самых важных их фармакологических характеристик.
Установлено, что соединение Org 42599, трифторацетатная соль Org 43553, восстанавливает активность мутантных ЛГР с аминокислотными заменами A593P и S616Y [22]. Инкубация клеток, в которых экспрессированы мутантные рецепторы, с Org 42599 приводила к повышению их экспрессии, увеличивала долю мутантных ЛГР с правильной укладкой и топологией в мембране и повышала число рецепторов на поверхности клетки. Переход ЛГР в функционально активное состояние при связывании с Org 42599 препятствовал деградации мутантного рецептора в протеосомах. В основе этого лежит неспособность мутантного ЛГР в связанном с Org 42599 состоянии взаимодействовать с 94 кДа глюкоза-регулируемым и Ig-связывающим белками, которые осуществляют транспорт неправильно свернутых форм белков к протеосоме. Инкубация имеющих низкую чувствительность к ЛГ HEK-клеток с экспрессированным в них мутантным ЛГР с заменой S616Y с Org 42599 (в достаточно низкой концентрации 0,1 мкМ) приводила к двукратному усилению стимулирующего эффекта ЛГ на А.Ц. При этом эффект самого ТП был выражен сильнее, чем в клетках, где был экспрессирован нормальный ЛГР [22].
Соединение Org 41841, которое было открыто первым среди низкомолекулярных агонистов ЛГР, характеризовалось сравнительно невысокой селективностью по отношению к ЛГР и активировало рецептор ФСГ, хотя и с низкой эффективностью [5]. Это послужило основанием для поиска высокоселективных его аналогов, не действующих на рецептор ФСГ, что в конечном итоге привело к открытию Org 43553 и других высокоселективных Т.П. Казалось, что Org 41841 стал достоянием истории. Однако при изучении его влияния на рецептор ФСГ было показано, что он усиливает экспрессию и транслокацию рецептора с заменой A189V в эктодомене [23]. Это связано с тем, что Org 41841, как и Org 42599, стабилизирует биологически активную конформацию мутантного рецептора и препятствует его деградации в протеосомах, т. е. ведет себя как фармакологический шаперон. Поскольку Т.П. при связывании с мутантными рецепторами ЛГ и ФСГ нормализуют их активность, эти препараты можно использовать для стимуляции стероидогенеза, сперматогенеза, оогенеза и других зависимых от гонадотропинов процессов в репродуктивных тканях с дефектными формами рецепторов, что является наиболее перспективным подходом для терапии заболеваний репродуктивной системы, связанных с мутациями генов, кодирующих рецепторы гонадотропинов.