Медицинское и социальное значение сахарного диабета (СД) возрастает в течение последних десятилетий в связи с угрожающим увеличением частоты и тяжестью сердечно-сосудистых осложнений данной патологии [1]. Поэтому, наряду с изучением гипогликемизирующего действия сахароснижающих препаратов, в последнее время значительное внимание уделяется влиянию этих лекарственных форм на систему гемостаза, состояние которой неразрывно связано с проблемой артериальных тромбозов, определяющих исход сосудистых осложнений СД [2]. Одним из наиболее значимых показателей состояния данной системы является функциональная активность тромбоцитов [3]. Кроме того, доказано прямое и косвенное участие гемореологических факторов в развитии микрососудистых и атеросклеротических осложнений СД [4, 5]. При данной патологии повышается агрегация эритроцитов и вязкость крови, снижается способность мембраны эритроцитов к деформации, увеличивается адгезия эритроцитов к эндотелиальным клеткам. В основе этих гемореологических нарушений лежит изменение структурно-функциональных свойств клеточной мембраны, а именно дестабилизация ее липидного бислоя [6]. Изменения гемостаза обусловливают ускоренное прогрессирование атеросклероза, что повышает риск тромбозов и микроциркуляторных нарушений [7]. Поэтому антитромбогенная защита (помимо самостоятельного положительного эффекта коррекции гликемии) может и должна приниматься во внимание при лечении СД [8].

Новое гипогликемическое средство лимиглидол относится к классу производных бензимидазола. Соединениям этого класса свойственны различные биологические эффекты, в том числе ингибирование функциональной активности тромбоцитов и эритроцитов [9, 10], улучшение гемореологических свойств крови [11].

Цель данного исследования — комплексная оценка воздействия лимиглидола на показатели агрегации тромбоцитов, вязкости крови и способность предотвращать артериальный тромбоз, вызванный электрическим током в условиях аллоксанового диабета.

Эксперименты выполнены на 96 белых нелинейных крысах-самцах массой 300—350 г, содержащихся в условиях вивария (температура 22—24 °С, относительная влажность воздуха 40—50%) на стандартной диете (ГОСТ Р 50258−92) в условиях естественного светового режима. Исследования выполнялись согласно методическим руководствам и нормативным документам (ГОСТ 3 51000.3−96 и 51000.4−96; правилам и Международным рекомендациям Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997); правилам лабораторной практики (GLP) в РФ (приказ Минздрава Р.Ф. № 267 от 19.06.03). Забой животных производили с соблюдением требований «Международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1997). В течение 24 ч до начала экспериментов все животные находились в условиях полной пищевой депривации со свободным доступом к воде. Протокол экспериментальной части исследования согласован с Региональным этическим комитетом (Протокол № 94−2009).

Применяли субстанцию лимиглидола [дигидрохлорид-9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо (1,2-а)бензимидазол] (НИИ ФОХ РГМУ), прошедшего III фазу клинических испытаний [12]. Экспериментальный С.Д. вызывали внутрибрюшинным введением свежеприготовленного на 0,01 М ацетатном буфере раствора аллоксана («Меrck», США) в дозе 150 мг/кг [13]. Эксперименты проводили через 2 мес на животных со стойкой гипергликемией (содержание глюкозы >15 ммоль/л). Уровень глюкозы в крови определяли глюкозооксидазным методом с использованием набора Глюкоза ФКД (Россия).

Изучали влияние лимиглидола (17 мг/кг) и препарата сравнения гликлазида (20 мкг/кг) на агрегацию тромбоцитов и время образования тромба под действием электротока. При изучении реологических свойств крови лимиглидол также вводили в дозе 17 мг/кг, а препарат сравнения пентоксифиллин — в дозе 4 мг/кг [14]. Все соединения вводились ежедневно в течение 1 нед до начала определений.

Действие лимиглидола на агрегацию тромбоцитов крыс in vivo изучали на двухканальном лазерном анализаторе агрегации (модель 220 LA фирмы «Биола», Москва). Определение агрегации тромбоцитов проводили по методу G. Born в модификации З.А. Габбасова [15]. Степень агрегации тромбоцитов оценивали по величине максимальной амплитуды агрегатограммы. Пробы крови для исследования агрегации тромбоцитов и вязкости крови отбирали из брюшного отдела аорты животных, наркотизированных хлоралгидратом (400 мг/кг). Вязкость крови определяли с помощью вискозиметра ротационного типа-анализатора крови реологического (АКР-2) при шести скоростях сдвига (10^с–1, 20^с–1, 50^с–1, 100^с–1, 200^с–1, 300^с–1), моделирующих различную интенсивность кровотока в сосудах [16]. Величины вязкости в области малых скоростей сдвига служат числовой характеристикой агрегации эритроцитов, а в области более высоких скоростей сдвига — показателем их деформируемости. Для изучения влияния веществ на агрегациюию эритроцитов последние отмывали для исключения влияния углеводов. Агрегацию оценивали по индексу агрегации эритроцитов (ИАЭ), рассчитываемому как отношение вязкости крови при скорости сдвига 10^с–1 к вязкости крови при 300^с–1 [17], которая определялась при стандартизированном гематокрите (40%). Величину гематокрита определяли центрифугированием капилляров с образцами крови на Hematocrit Centrifuge GM-70 («Elmi», Латвия) (8000 об/мин, 3 мин) как отношение протяженности в центрифужном капилляре столбика эритроцитов к столбику плазмы.

Артериальный тромбоз индуцировали электрическим током, согласно методу G. Guglielmi и соавт. [18]. Индукция тромбоза сонной артерии крыс, наркотизированных хлоралгидратом (400 мг/кг), проводилась постоянным током напряжением 12 В и силой 50 мА. Сосуд стимулировали до момента полной окклюзии. Артериальный кровоток регистрировали с помощью ультразвукового допплерографа Минимакс-Доплер-К («СП Минимакс», Cанкт-Петербург, Россия).

Статистическая обработка данных проводилась с помощью программы Statistica 6.0 с использованием критерия Манна—Уитни и программного обеспечения Microsoft Excell 2006.

Формирование тяжелой формы экспериментального СД сопровождалось изменением состояния крыс. Животные худели, у них развивалась полиурия, полидипсия, полифагия. Уровень глюкозы в крови увеличивался в 4 раза по сравнению с интактными животными. При 7-дневном введении лимиглидола и гликлазида уровень глюкозы снижался соответственно на 29 и 27% (табл. 1).

Амплитуда агрегации тромбоцитов возрастала в 2 раза по сравнению с таковой у интактных животных. Лимиглидол и гликлазид значимо ингибировали функциональную активность тромбоцитов у крыс с экспериментальным диабетом на 30 и 27% соответственно (рис. 1). У животных со стойкой гипергликемией (не менее 15 мМ) обнаруживалось повышение вязкости крови при различных скоростях сдвига (рис. 2).

Лимиглидол снижал вязкость крови крыс с экспериментальным С.Д. Наибольший эффект наблюдался при низкосдвиговых скоростях. Так, при скорости сдвига 10^с–1 и 20^с–1 лимиглидол уменьшал вязкость крови на 31,7 и 22,7% соответственно. Пентоксифиллин оказывал менее выраженное действие на вязкость крови при низкосдвиговых скоростях. Так, при скорости сдвига 10^с–1 и 20^с–1 препарат сравнения снижал вязкость крови крыс с аллоксановым диабетом на 16 и 9,2% соответственно. При этом индекс агрегации эритроцитов животных с аллоксановым диабетом составил 2,31 (рис. 3), что на 33% больше данного показателя у интактных животных. Лимиглидол снижал этот показатель на 28,5%, а пентоксифиллин — на 10,4%.

Среднее время наступления полной окклюзии сонной артерии при индуцировании тромбоза электротоком у интактных крыс составило 15,4 мин. У животных с аллоксановым диабетом данный показатель уменьшался до 11,5 мин (рис. 4). Наиболее эффективным в отношении профилактики окклюзии сонной артерии у крыс с аллоксановым диабетом оказался лимиглидол. Полная окклюзия сонной артерии на фоне введения данного вещества наблюдалась на 21-й минуте, т. е. время образования тромба увеличивалось на 78,5% (р<0,001). Гликлазид в изученной дозе увеличивал время наступления полной окклюзии сосуда на 61,2% (р<0,001).

Мы нашли, что лимиглидол помимо сахароснижающего действия оказывает выраженное антиагрегантное влияние у крыс с аллоксановым диабетом. Эффект лимиглидола несколько превосходил действие гликлазида. В физиологических условиях важнейшая роль в инициации первых этапов активации кровяных пластинок принадлежит АДФ, которая активирует фосфолипазы гранулярной и плазматической мембран, что ведет к высвобождению арахидоновой кислоты, последняя превращается в лабильный циклический эндопероксид, а затем в ТХА2 стимулирующий высвобождение и агрегацию тромбоцитов [19]. Нарушение реактивности тромбоцитов при СД связывают именно с нарушением баланса простагландинов (т.е. с повышением уровня проагреганта и вазоконстриктора ТХА2) и снижением концентрации антиагреганта и вазодилататора простациклина. Одним из механизмов антитромбоцитарного действия исследованных препаратов, возможно, является их способность подавлять агрегацию тромбоцитов, вызываемую АДФ in vitro и in vivo, и таким образом снижать уровень ТХА2 [20]. Снижение агрегации тромбоцитов у крыс с аллоксановым диабетом на фоне введения лимиглидола и гликлазида свидетельствует о повышении чувствительности клеток к инсулину, что может сопровождаться повышением продукции NO в тромбоцитах и индуцировать образование цГМФ, блокирующего кальциевые каналы [21].

В области сосудистого дефекта нарушается геометрия потока крови с явлениями турбулентности, которые являются одним из основных гидродинамических факторов сосудистого тромбоза. Эти процессы могут усиливаться при повышеннии вязкости, крови, наблюдаемом при СД [22]. Вязкость крови при различных скоростях сдвига неодинакова, характеризует кровоток в разных областях гемоциркуляции и суммарно отражает агрегатное состояние эритроцитов, их деформируемость, содержание фибриногена крови. При оценке влияния лимиглидола на вязкость крови у крыс с аллоксановым диабетом было выявлено значимое снижение этого показателя при различных скоростях сдвига, превосходящее эффект пентоксифиллина. Следует отметить, что наибольшее действие лимиглидов оказывал при низкосдвиговых значениях вязкости крови, характеризующих агрегацию эритроцитов в венулярных отделах микроциркуляторного русла. Корригирующее воздействие лимиглидола на данный реологический показатель при повышении скоростей сдвига, которые свидетельствуют о способности эритроцитов к деформации, оказалось незначительным.

Таким образом, можно предположить, что лимиглидол при курсовом введении крысам с экспериментальным СД ликвидирует синдром повышенной вязкости крови за счет снижения способности эритроцитов к агрегации и тем самым улучшает реологические свойства крови.

Нарушения гемостаза при СД обусловливают ускоренное прогрессирование атеросклероза, что сопровождается риском тромбозов. Нами была изучена антитромботическая активность лимиглидола на модели артериального тромбоза, вызываемого повреждением стенки артерий электрическим током. Установлена высокая антитромботическая активность этого препарата, превосходящая эффект гликлазида. Пролонгирование времени образования тромба под действием исследуемых соединений может быть связано с их споcобностью не только устранять глюкозотоксичность, но и ингибировать агрегацию тромбоцитов и эритроцитов (данная модель тромбоза относится к тромбоцитзависимым моделям).

Гипогликемическое соединение лимиглидол обладает антитромбогенным действием и способностью улучшать реологические свойства крови у крыс с экспериментальным диабетом. Применение лимиглидола в лечении СД может не только нормализовать уровень глюкозы крови, но и предупреждать развитие осложнений СД.

Авторы декларируют отсутствие конфликтов интересов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.А. Cпасов, А.Ф. Кучерявенко

Сбор и обработка материала — А.Ф. Кучерявенко, Л.В. Науменко

Статистическая обработка данных — А.Ф. Кучерявенко, Л.В. Науменко

Написание текста — А.Ф. Кучерявенко

Редактирование — А.А. Cпасов

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект №  14−25−00139 ) с использованием вычислительной техники и оборудования кафедры фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета.