Экспрессия эстрогеновых и андрогеновых рецепторов в тканях наружных половых органов у девочек с врожденной дисфункцией коры надпочечников

Врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН, адреногенитальный синдром - АГС) - аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное патологией ферментов или транспортных белков, участвующих в синтезе кортизола. Самый распространенный вариант ВДКН, связанный с недостаточностью 21-гидроксилазы и встречающийся в классическом варианте с частотой приблизительно 1:10 000-1:18 000 новорожденных, приводит у девочек к различной степени вирилизации наружных половых органов (НПО) при рождении вследствие пренатального избытка надпочечниковых андрогенов [1, 2]. Внутренние половые органы (матка, фаллопиевы трубы, проксимальная часть влагалища) у таких девочек имеют правильное строение, тогда как маскулинизация наружных гениталий может варьировать от незначительной гипертрофии клитора до полностью мужского строения НПО (по шкале Прадера 2-5). Феминизирующую пластику гениталий проводят в 1 или 2 этапа в зависимости от степени вирилизации гениталий [1, 3-6]. Первый этап заключается в резекции клитора и рассечении урогенитального синуса, второй (интроитопластика) - в создании входа во влагалище (интроитуса). Достаточно большой процент пациенток после интроитопластики (несмотря на хороший косметический результат) имеют узкий для возможности полового акта диаметр влагалища, что связано с рубцеванием постоперационной поверхности, приводящим к стенозу. Это осложнение встречается чаще ( в 36-100% случаев) после одноэтапной пластики в раннем детском возрасте [3, 7-9]. Неудовлетворительные результаты интроитопластики требуют повторных оперативных вмешательств или многократных бужирований [9, 10]. В РФ феминизирующую пластику проводят в два этапа: I - в раннем детском возрасте, II - в пубертатном, когда завершается формирование влагалища и достигается оптимальная эстрогенизация его слизистой оболочки (обычно через 1-2 года после начала менструаций). Обоснованием для интроитопластики именно в этот период служат исследования, доказывающие влияние эстрогенов на процесс эпителизации тканей. Известно, что под воздействием эстрогенов происходит стимуляция моторики кератиноцитов, усиливается ангиогенез, происходит вазодилятация, предотвращается избыточное образование коллагеновой ткани [11-13]. У пациенток с ВДКН гипоэстрогения обусловлена снижением продукции эстрогенов яичниками. Это происходит вследствие подавления секреции гонадотропинов избытком надпочечниковых андрогенов. Большинство авторов связывают возникновение постоперационного стеноза интроитуса со снижением эстрогеновой насыщенности вагинальной слизистой вследствие декомпенсации заболевания в период пубертата. Однако данных, подтверждающих роль одной только компенсации в достижении оптимальной эстрогенизации НПО, в литературе до сих пор нет. Остается нерешенным вопрос: возможно ли снижение местной чувствительности наружных гениталий к эстрогенам вследствие избыточной продукции андрогенов еще в пренатальном периоде? В литературе отсутствуют данные о влиянии внутриутробной гиперандрогении на распределение и экспрессию эстрогеновых и андрогеновых рецепторов в вульве и влагалище, первоначальное количественное изменение которых могло бы послужить одним из объяснений снижения эстрогенизации тканей гениталий.

Кожа малых половых губ (МПГ) является производным эктодермы, поэтому, как и кожа других анатомических участков, состоит из эпидермиса, представляющего собой многослойный плоский ороговевающий эпителий, и дермы с волосяными фолликулами, потовыми и сальными железами. Толщина кожи и степень ороговения уменьшается по направлению к передней части клитора и при переходе от наружной поверхности МПГ к внутренней. Поверхностный слой слизистой оболочки преддверия влагалища (интроитуса) и влагалища представлен плоским неороговевающим эпителием, чувствительным к циклическим изменениям уровня стероидных гормонов, продуцируемых яичниками [14]. Эпителий стенки влагалища состоит из трех слоев (базально-парабазального (Б-ПБ), промежуточного (ПР) и поверхностного с кариопикнотичными клетками), отделенных от субэпителиальной ткани (стромы) базальной мембраной. В норме в тканях НПО экспрессируются как АР, так и ЭР, относящиеся к семейству ядерных [15-17]. АР определяются преимущественно в эпидермальных кератиноцитах, сальных и потовых железах, волосяных фолликулах и фибробластах кожи МПГ, а также в эпителии и фибробластах стромы влагалища. ЭР преобладают в базальных и парабазальных клетках вагинального эпителия, что объясняет стимулирующее воздействие эстрогенов на пролиферацию и дифференцировку клеток вагинального эпителия. ЭР присутствуют также в фибробластах и гладких мышцах влагалища, в эпидермисе кожи МПГ. Число ЭР снижается, а АР возрастает по направлению от шейки матки к коже надлобковой области и от внутренней поверхности малых половых губ к наружной [15]. Действие двух изоформ эстрогеновых рецепторов (ЭРα и ЭРβ) неодинаково в различных тканях [18]. Изменения их экспрессии в одной и той же ткани при различных физиологических состояниях свидетельствуют о различной ответной реакции ткани-мишени на воздействие эстрогенов.

В литературе отсутствуют данные о распределении и экспрессии этих рецепторов в тканях наружных гениталий у здоровых девочек допубертатного и пубертатного возрастов, что связано с невозможностью получения у них полноценного биоматериала в силу морально-этических аспектов. Подобные исследования проводились в основном у женщин пре- и менопаузального возраста, пациенток на фоне заместительной терапии эстрогенами или андрогенами и на животных [15-17, 19, 20].

Цель настоящей работы - определение чувствительности наружных половых органов девочек с ВДКН к эстрогенам посредством изучения количества и распределения ЭР и АР в зависимости от формы заболевания, степени вирилизации наружных гениталий при рождении и уровня андрогенов.

В исследование были включены девочки с классическими формами ВДКН [n=21, сольтеряющая форма (СТ) - 7 девочек, простая вирильная форма (ПВ) - 14], которым было показано проведение I или II этапов феминизирующей пластики НПО. Все пациентки регулярно наблюдались в детском отделении ФГБУ ЭНЦ. В зависимости от этапа пластики и материала для исследования девочки были разделены на две группы (таблица).

Перед оперативным лечением у всех пациенток определяли антропометрические показатели, оценивали степень вирилизации наружных гениталий и стадию полового созревания по Таннеру (1968) и проводили гормональное обследование с определением уровней тестостерона, 17-гидроксипрогестерона (17-ОПГ), активности ренина плазмы. Содержание общего тестостерона в сыворотке определяли методом усиленной хемилюминесценции с помощью автоматического иммунохимического анализатора Vitros 3600 («Ortho Clinical Diagnoxtics», «Johnson & Johnson»). Для оценки концентрации 17-ОПГ в сыворотке использовали радиоиммунный анализ (Immunotech, ISO 9001-13485). Все девочки, вошедшие в исследование, находились в состоянии компенсации ВДКН.

Феминизирующая пластика НПО проводилась в отделении гинекологии ИДГКБ №3. Для определения ЭР и АР был использован операционный материал, полученный в ходе проведения I и II этапов пластики. В первом случае образцы ткани были представлены тканью малых половых губ, во втором - тканями дистальной части влагалища вблизи преддверия (интроитуса). Иммуногистохимическое исследование проведено на базе Центра коллективного пользования факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова. Операционный материал фиксировался в 4% растворе формалина в течение 24-72 ч и затем помещался в парафин. Исследование локализации АР, ЭРα и ЭРβ проведено на парафиновых срезах толщиной 3 мкм по стандартной иммуногистохимической методике на иммуностейнере Autostainer Link 48 («Dako», США) с использованием коммерческих мышиных моноклональных антител против ЭРα [(клон 6F11), разведение 1:80]; ЭРβ [(клон EMR02), разведение 1:50]; АР (клон AR27), разведение 1:100) («Novocastra») с предварительной демаскировкой антигенов в соответствии с протоколом производителя. Время инкубации с первичными антителами составило 1 ч для эстрогеновых и 2 ч для андрогеновых рецепторов при комнатной температуре. Проявление реакции осуществлялось системой визуализации Peroxidase Detection System («Novocastra», Великобритания). В качестве негативного контроля использованы ткани миндалин, в качестве положительного - ткани эндометрия (для ЭРα), кожи (для ЭРβ), карциномы простаты (для АР), рекомендованные в описании к коммерческим антителам. Для серо-негативного контроля был использован мышиный IgG (FLEX Negative Control Mouse Cocktail; «Dako»). Морфометрический анализ проведен на микроскопе Zeiss Axioscop 40, оснащенном камерой AxioCam MRc5 Zeiss. Процент окрашенных клеток оценивали в 6-10 полях зрения при увеличении х40 для каждого маркера в образце. В ткани МПГ, помимо общего уровня рецепторов, оценивалось количество иммунореактивных клеток отдельно в эпидермальном и дермальном слоях, а в слизистой влагалища - отдельно в Б-ПБ и ПР слоях эпителия и в строме.

Статистический анализ полученных данных проводился с использованием программы Statistica («StatSoft Inc.», США, версия 8.0). Данные представлены в виде медианы, с указанием 25-75 процентилей. Оценка достоверности различий между группами проводилась с помощью теста Манна-Уитни. Связь двух признаков анализировалась с помощью ранговой корреляции по Спирмену. Критический уровень значимости различий принимался равным 0,05.

В МПГ ЭРα были локализованы в ядрах фибробластов и гладкомышечных клеток дермы, ядрах клеток Б-ПБ слоя эпидермиса (рис. 1-3 и далее см. на цв. вклейке).

Интенсивное ядерное окрашивание ЭРβ отмечалось в клетках всех слоев эпидермиса, фибробластах дермы, в эндотелии сосудов, эпителиальных клетках протоков апокринных желез и гладкомышечных клетках кожи малых половых губ (рис. 5, 6).

Интенсивное окрашивание ЭРβ было выявлено также в вульве здоровых женщин репродуктивного возраста [20]. Биологическая роль ЭРβ в этих тканях недостаточно изучена. Известно, что при некоторых онкологических заболеваниях в случае коэкспрессии ЭРα и ЭРβ, ЭРβ оказывает ингибирующее действие на ЭРα-опосредованную экспрессию генов и регулирует ответ ткани-мишени на воздействие эстрогенов [21, 22]. Нами не выявлено корреляции между количеством ЭРα и ЭРβ в коже малых половых губ девочек с ВДКН (rs=0,64; р>0,05).

АР в коже МПГ девочек с ВДКН экспрессировались преимущественно в ядрах клеток эпидермиса, прилежащих к базальному слою, в эпителиальных клетках протоков желез. В дерме отмечалось незначительное ядерное окрашивание АР (рис. 7, 8).

Не было выявлено статистически значимой зависимости между количеством ЭР и АР в МПГ и степенью вирилизации наружных гениталий, а также между числом клеток, экспрессирующих ЭР и АР, и уровнем андрогенов в крови (тестостерон, 17-ОПГ). Количество данных рецепторов не различалось при различных формах ВДКН как у пациенток моложе 4 лет (n=10), так и у девочек старше 6 лет с начавшимся адренархе (n=3).

Во влагалище ЭРЭРα были локализованы в ядрах клеток Б-ПБ слоя вдоль базальной мембраны и в ПР слое эпителия, а также в фибробластах стромы (рис. 9, 10).

Данные литературы о наличии и распределении ЭРβ в слизистой влагалища противоречивы. Одни авторы не находили экспрессии ЭРβ в тканях влагалища [23], другие подтверждали их наличие [17, 20]. Исследования на нокаутных по ЭР мышах показали, что ЭРα является основным рецептором, опосредующим вагинальный ответ на 17β-эстрадиол [24]. У мышей, нокаутных по ЭРα, при гистологическом анализе выявлено полное отсутствие эстрогенизации влагалища под воздействием экзогенного эстрадиола [25, 26]. С другой стороны, слизистая оболочка влагалища у нокаутных по ЭРβ мышей претерпевает нормальные циклические изменения, связанные с яичниковым стероидогенезом, указывая на то, что это ЭРβ-опосредованный процесс [25]. По нашим данным, доля клеток, экспрессирующих ЭРα в ткани влагалища, составила 48,1% (34,5; 67,7%).

ЭРβ были выявлены в клетках Б-ПБ, ПР и в единичных случаях поверхностного слоя эпителия, а также в фибробластах стромы (рис. 13, 14).

Доля клеток, экспрессирующих АР составила 6,6% (3,6; 16,5%), что существенно ниже по сравнению с другими исследованными рецепторами. АР были локализованы в базальном слое эпителия вдоль базальной мембраны и в единичных клетках стромы (рис. 15, 16).

Полученные данные о наличии и распределении рецепторов стероидных гормонов в эпителии влагалища сопоставимы с результатами, полученными при исследовании этой ткани у здоровых женщин репродуктивного возраста [15, 20].

Среди пациенток пубертатного возраста, нуждающихся в проведении II этапа феминизирующей пластики, были 2 девочки, у которых интроитопластика проводилась повторно. В течение 1 мес перед оперативным лечением они получали местную терапию эстрогенами (крем Овестин). Еще одна пациентка в течение 4 мес перед операцией получала комбинированные пероральные контрацептивы (Новинет) по поводу нарушений менструального цикла. При иммуногистохимическом исследовании количество клеток, экспрессирующих ЭРα, у этих пациенток было статистически значимо ниже, чем у девочек, не получавших предоперационно эстрогенотерапию, у которых интроитопластика проводилась впервые (р=0,045) (рис. 17, 18).

Удалении яичников у животных, т.е. в отсутствии эстрогенов, сопровождается увеличением ЭРα-позитивных клеток и снижением прогестероновых рецепторов в вагинальном эпителии, а при инфузии эстрадиола отмечается обратный дозозависимый эффект [27]. Предполагается, что подобный механизм регуляции предотвращает избыточную пролиферацию вагинального эпителия при колебании уровня эстрадиола в ходе менструального цикла. Данные о влиянии заместительной гормональной терапии (ЗГТ) эстрогенами на экспрессию эстрогеновых рецепторов во влагалище женщин постменопаузального возраста достаточно противоречивы. В большинстве работ отмечено увеличение экспрессии и иммунореактивности ЭРα и ЭРβ в вагинальных тканях как при лечении комбинированными пероральными контрацептивами (КОК), так и при местной эстрогенотерапии [19, 28, 29]. Тем не менее есть данные, что интравагинальное введение эстрогенов в отличие от КОК не влияет на экспрессию этих рецепторов [30]. Полученные в нашем исследовании результаты могут свидетельствовать либо о первоначальном снижении местной чувствительности к эстрогенам у девочек с ВДКН, что привело к послеоперационному стенозу интроитуса и потребовало повторного хирургического вмешательства, либо о снижении экспрессии ЭР в тканях влагалища непосредственно после проведения интроитопластики. В некоторых исследованиях на животных отмечалось снижение экспрессии мРНК АР после удаления яичников и ее увеличение после введения физиологических доз эстрадиола [31, 32]. В других работах не находили изменений в экспрессии АР [27]. Нами не было выявлено статистически значимой разницы в экспрессии АР в вагинальных тканях у девочек, получавших и не получавших интравагинально крем Овестин.

При иммуногистохимическом исследовании ЭР и АР у женщин-транссексуалов, готовящихся к операции по смене пола на мужской, было показано, что длительный прием препаратов тестостерона приводит к истончению и снижению пролиферации вагинального эпителия (отсутствие в эпидермисе клеток поверхностного слоя, истончение промежуточного слоя), а также к снижению в тканях влагалища экспрессии мРНК ЭРα и ЭРβ и к увеличению экспрессии мРНК АР [33, 34]. По нашим данным, статистически значимой корреляции между количеством рецепторов ЭРα, ЭРβ, АР и уровням андрогенов (тестостерон, 17-ОПГ) выявлено не было. Этот результат может объясняться и тем фактом, что все пациентки перед проведением II этапа феминизирующей пластики находились в состоянии компенсации в течение 6-12 мес, т.е. имели низкий уровень тестостерона в сыворотке. Доля клеток, несущих рецепторы, и их локализация во влагалище не различались между пациентками с СТ и ПВ формами с различной вирилизацией гениталий, а также с регулярным и нерегулярным менструальным циклом. Последнее подтверждается данными литературы, свидетельствующими об отсутствии изменений экспрессии ЭР и АР в зависимости от возраста, фазы и характера менструального цикла [16].

В тканях наружных половых органов девочек с адреногенитальным синдромом определяется экспрессия как ЭР, так и АР. Их количество и распределение в МПГ у допубертатных пациенток и во влагалище у девочек в период полового созревания не зависит от формы ВДКН, степени вирилизации наружных половых органов и уровня андрогенов в крови. У пациенток с ВДКН, подвергающихся повторной интроитопластике, отмечается снижение экспрессии рецепторов к эстрогенам в слизистой влагалища при неизмененной экспрессии АР, что может указывать на снижение у них чувствительности к местной терапии эстрогенами.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования - И.В. Копылова, Т.М. Глыбина, М.А. Карева

Сбор и обработка материала - И.В. Копылова, Т.М. Глыбина, В.Ю. Сысоева

Статистическая обработка данных - И.В. Копылова

Написание текста - И.В. Копылова

Редактирование - М.А. Карева, В.Ю. Сысоева