Влияние гипогликемического средства гликоразмулина на функциональное состояние митохондрий при стрептозотоцин­индуцированном диабете

Несмотря на разнообразие средств лечения сахарного диабета, остается востребованным поиск новых фармакологических средств и их «мишеней». Такими «мишенями» могут быть мембраны митохондрий и локализованные в них структуры, в первую очередь дыхательная цепь и митохондриальная мегапора (митохондриальная пора перехода проницаемости, mitochondrial permeability transition pore, MPTP) [1, 2]. Роль MPTP в развитии различных патологий, в частности сахарного диабета, активно обсуждается [3]. Образования активных форм кислорода в клетке и чрезмерная активация процессов свободнорадикального окисления лежат в основе развития сахарного диабета [4, 5]. Эти процессы рассматривают в качестве универсального механизма, объединяющего основные биохимические пути токсичного влияния гипергликемии на организм. Известно также, что дыхательная цепь митохондрий служит основным источником активных форм кислорода [6]. С другой стороны, воздействие активных форм кислорода переводит MPTP в открытое состояние, митохондрии набухают, и инициируются процессы некроза или апоптоза [7]. Наряду с синтезом АТФ митохондрии играют важную роль в нормальном метаболизме: например, эти органеллы переключают пути, приводящие к секреции инсулина ß-клетками в ответ на поступление в клетку глюкозы [4, 8].

Ранее на основе мумие и экстракта корней и корневищ растения родиолы Rhodiola Semenovii A. был разработан комбинированный лекарственный препарат гипогликемического действия - гликоразмулин [9], который при аллоксановом диабете у крыс оказывал выраженный гипогликемический эффект, положительно влиял на липидный обмен и нормализовал функциональное состояние печени [10]. Кроме того, гликоразмулин восстановил иммунологическую реактивность организма при остром токсическом гепатите и лучевой болезни [11].

Цель настоящей работы - изучение состояния митохондрий печени и поджелудочной железы при экспериментальном диабете (ЭА), а также возможности коррекции обнаруженных нарушений с помощью гликоразмулина.

Эксперименты проводили на 90 белых беспородных крысах-самцах с массой тела 180-200 г. Животных разделили на три группы: 1-я группа - интактная, 2-я - животные, которым однократно внутрибрюшинно вводили водный раствор стрептозотоцинa в дозе 50 мг на 1 кг массы тела в 0,5 мл 0,9% раствора NaCl, и 3-я - стрептозотоциновый диабет + гликоразмулин (перорально в дозе 50 мг на 1 кг на массы тела) в течение 8 сут, начиная с 12 дня после введения стрептозотоцина и достижения заданного уровня гипергликемии.

Митохондрий печени и поджелудочной железы выделяли методом дифференциального центрифугирования [12, 13] через 12 дней после инъекции стрептозотоцина, когда уровень глюкозы в крови достигал 11 ммоль/л. Состав среды выделения митохондрий печени: 250 мМ сахарозы, 1 мМ ЭДТА,

10 мМ трис-НСl, рН 7,4; для выделения митохондрий поджелудочной железы использовали ту же среду, но добавляли бычий сывороточный альбумин 2 мг/г массы ткани. Митохондрии из обоих органов ресуспендировали в среде выделения без ЭДТА. Са2+-зависимое набухание митохондрий регистрировали по изменению светорассеяния суспензии митохондрий (0,5 мг белка /мл) при 540 нм [14].

Определение скорости дыхания митохондрий в различных метаболических состояниях и величин коэффициентов дыхательного контроля (ДК) и АДФ/О проводили по методу Чанса [15]. При расчете скоростей дыхания и параметров окислительного фосфорилирования содержание кислорода в

1 мл среды принимали равным 500 нг-атомам кислорода при 26 °С.

Уровень глюкозы в крови определяли глюкозооксидазным методом с помощью набора Glucose - enzymatic-colorimetric test («Cypress diagnostic», Бельгия). Содержание митохондриального белка определяли по Лоури в модификации Петерсона [16]. Для статистической обработки результатов использовали программу Оrigin 6.1. Величину p>0,05 рассматривали как показатель достоверных различий.

В условиях нашего эксперимента (инкубационная среда содержала Са-ЭГТА буфер) набухание митохондрий можно рассматривать как результат открытого состояния МРТР, а подавление набухания - как закрытое, т.е. с помощью этой методики можно оценить состояние МРТР при ЭД и действии гликоразмулина. Внесение в инкубационную среду 10 мкМ Са2+ приводило к набуханию митохондрий печени и поджелудочной железы крыс 1-й группы. При этом скорости набухания митохондрий печени и поджелудочной железы составили 0,32 0xC4;Е540/10 мин и 0,31 0xC4;Е540/10 мин соответственно.

В тех же условиях скорость набухания митохондрий, выделенных из печени крыс 2-й группы (стрептозотоцининдуцированный диабет), была равна 0,59 0xC4;Е540/10 мин, что на 84,3% выше показателя контрольной группы. Скорость набухания митохондрий поджелудочной железы (2-я группа животных) составила 0,48 0xC4;Е540/10 мин, что выше контроля на 54,8%. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при стрептозотоцининдуцированном диабете МРТР печени и поджелудочной железы находятся в открытом состоянии.

Фармакотерапия гликоразмулином крыс со стрептозотоцининдуцированным диабетом приводила к ингибированию отмеченного набухания митохондрий печени и поджелудочной железы. Так, скорость набухания митохондрий, выделенных из печени крыс 3-й группы (ЭД + гликоразмулин), составила 0,46 0xC4;Е540/10 мин, что на 40,5% меньше скорости набухания митохондрий печени крыс 2-й группы. Скорость набухания митохондрий поджелудочной железы крыс (3-я группа) была равна 0,38 0xC4;Е540/10 мин, что на 32,2% меньше скорости набухания митохондрий поджелудочной железы крыс 2-й группы. Таким образом, применение комбинированного препарата гликоразмулина в условиях стрептозотоцининдуцированного диабета значимо ингибировало открытие митохондриальной поры (рис. 1).

В следующей серии опытов изучали дыхательную и фосфорилирующую активность митохондрий печени и поджелудочной железы крыс со стрептозотоцининдуцированным диабетом и при воздействии гликоразмулина. При интоксикации стрептозотоцином скорость дыхания митохондрий печени крыс в состоянии V3 увеличивалась на 43,5% по сравнению с таковой митохондрий печени интактных животных (см. таблицу).

Корригирующее действие гликоразмулина в опытах с митохондриями поджелудочной железы выражалось в восстановлении состояния сопряжения: ДК оказался только на 4,0% ниже показателя в интактной группе, а эффективность фосфорилирования достигала возраста до 92,8% нормы (см. таблицу). При ЭД увеличивалась также скорость дыхания митохондрий поджелудочной железы в состоянии V4 на 82,1% по сравнению с контролем, а коэффициенты ДК и АДФ/О снижались на 19,2 и 21,7% соответственно.

Результаты экспериментов указывают на разобщение окислительного фосфорилирования в митохондриях печени и поджелудочной железы при стрептозотоцининдуцированном диабете; при этом развивается дефицит АТФ в тканях крыс и переход МРТР в открытое состояние, т.е. наблюдается пермеабилизация митохондриальных мембран. Гликоразмулин уменьшает влияние стрептозотоцинового диабета на функцию митохондрий.

Ранее было показано, что интоксикация стрептозотоцином увеличивает скорость пероксидации липидов в митохондриях печени, вызывает гиперкомпенсированный низкоэнергетический сдвиг с повышением скоростей дыхания во всех метаболических состояниях и разобщением окислительного фосфорилирования [17]. Терапия янтарем-антитоксом нормализовала процессы сукцинат- и НАД-зависимой энергопродукции в митохондриях с восстановлением сопряжения окисления и фосфорилирования; уменьшалась также липидопероксидация в печени [17].

В наших экспериментах гликоразмулин влиял на систему энергообеспечения клеток подобно янтарю-антитоксу. Известно, что входящие в состав гликоразмулина компоненты - мумие и экстракт родиолы oбладают антиоксидантными свойствами [18, 19]. В связи с этим нами было изучено действие различных концентраций гликоразмулина на процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ) митохондриальных мембран в системе Fe2++аскорбат in vitro. Внесение в инкубационную среду Fe²⁺+аскорбат индуцирует ПОЛ, в результате чего нарушается барьерная функция митохондриальных мембран и органеллы резко набухают по сравнению с контролем(рис. 2)

При внесении в инкубационную среду гликоразмулина, начиная с концентрации 1 мкг/мл, наблюдается ингибирование набухания митохондрий, что свидетельствует об ингибировании процесса ПОЛ в мембранах и переходе МРТР в закрытое состояние. Влияние гликоразмулина на ПОЛ в мембранах митохондрий зависит от концентрации препарата, т.е. с ее увеличением в СИ процент ингибирования возрастает. Полное ингибирование набухания митохондрий печени, т.е. процесса ПОЛ и возврат МРТР в закрытое состояние, отмечалось при концентрации гликоразмулина 14 мкг/мл. Концентрация, вызывающая полумаксимальное ингибирование процесса ПОЛ (IC50), для гликоразмулина составила 3,1±0,2 мкг/мл. Аналогичные результаты, свидетельствующие об антиоксидантных свойствах гликоразмулина, были получены и в экспериментах in vitro с митохондриями поджелудочной железы крысы (данные не приведены).

По-видимому, генерация активных форм кислорода под действием стрептозотоцина ускоряет процессы ПОЛ в мембранах митохондрий, в результате чего МРТР переходит в открытое состояние, дыхание и окислительное фосфорилирование разобщаются. Гликоразмулин, реализуя свои антиоксидантные свойства, препятствует образованию перекисей липидов, стабилизирует мембраны митохондрий и таким образом восстанавливает их энергосинтезирующие функции.

1. В условиях стрептозотоцининдуцированного диабета МРТР печени и поджелудочной железы переходит в открытое состояние, что может являться одним из механизмов повреждения функции митохондрий, а также клеток при ЭД.

2. При стрептозотоцининдуцированном диабете наблюдается увеличение скоростей дыхания в состояниях V3 и V4, приводящее к разобщению окислительного фосфорилирования в митохондриях печени и поджелудочной железы и дефициту АТФ в тканях крыс.

3. Гипогликемическое средство гликоразмулин (препарат на основе мумие и экстракта растения родиола Rhodiola Semenovii A.) эффективно корригирует нарушения функций митохондрий печени и поджелудочной железы, вызванные стрептозотоцином.

4. Гликоразмулин эффективно ингибирует индуцированное системой Fe²⁺+аскорбат набухание митохондрий с IC50 3,1±0,2 мкг/мл, что свидетельствует о наличии у исследуемого препарата антиоксидантных свойств.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования - М.И. Асраров

Сбор и обработка материала - М.К. Позилов, Н.А. Эргашев, М.М. Рахматуллаева

Статистическая обработка данных - М.К. Позилов

Написание текста - М.К. Позилов, Н.А. Эргашев

Редактирование - М.И. Асраров

Конфликт интересов отсутствует.

Работа выполнена в рамках гранта фундаментальных исследований АН РУз №ФА-Ф5-Т084. Авторы выражают благодарность ст.н.с. ИБОХ им. акад. А.С. Садыкова АН РУз, к.б.н. Шкиневу А.В. за ценные советы, оказавшие существенную помощь при написании настоящей статьи.