Экспрессия гена адипонектина (ADIPOQ) в подкожной и висцеральной жировой ткани и уровень адипонектина в сыворотке крови у детей

В последние годы активно обсуждается самостоятельная роль жировой ткани в патогенезе ожирения и связанных с ним осложнений. Жировая ткань является ключевым фактором в развитии и прогрессировании инсулинорезистентности (ИР). Среди множества адипокинов, секретируемых жировой тканью и влияющих на развитие ИР и метаболических нарушений, наибольший интерес вызывает адипонектин — уникальный адипокин, обладающий антидиабетической, противовоспалительной и антиатерогенной активностью.

Адипонектин — белок с молекулярной массой 30 кД, продукт гена ADIPOQ (3q27), обладающий высокой степенью сродства к коллагену VIII и X типов и C1q-компоненту комплемента. Этот адипокин был идентифицирован четырьмя независимыми группами исследователей в 1995 и 1996 гг., использовавших различные методы его выделения, поэтому ему были даны различные названия: apM1 (Adiрose Most abundant Gene transcript 1), Acrp30 (Аdipocyte complement related protein), adipoQ и GBP28 (gelatine binding protein 28) [1—4].

Адипонектин экспрессируется зрелыми адипоцитами. По данным ряда авторов [5], у взрослых людей ген ADIPOQ экспрессируется преимущественно в подкожной жировой ткани, и его экспрессия снижена при ожирении. В недавнем исследовании [6] было выявлено, что у детей с избыточной массой тела экспрессия адипонектина снижена в висцеральной жировой ткани.

В крови адипонектин циркулирует в виде нескольких изоформ (тример, гексамер, мультимер); при этом наибольшей биологической активностью обладает именно высокомолекулярная форма адипонектина [7]. У взрослых людей содержание циркулирующего адипонектина в кровотоке составляет около 10—16 мкг/мл (0,1% от общего количества белка в сыворотке крови) [8].

Снижение уровня адипонектина в сыворотке крови выявляется у людей, страдающих ожирением, сахарным диабетом 2-го типа (СД2), артериальной гипертонией, дислипидемией и ишемической болезнью сердца. Более того, низкий уровень адипонектина является независимым фактором риска развития СД2 и дислипидемий [9—15].

В исследование включили 62 ребенка (31 мальчик и 31 девочка, в возрасте от 2,5 до 18 лет (в среднем 13,6 года (8,5—15,1 года), подвергшихся плановым лапароскопическим вмешательствам (герниотомия, холецистэктомия, пластика пищеводного отверстия диафрагмы и др.). Критериями исключения являлись сопутствующая хроническая патология, острые воспалительные заболевания (аппендицит, острый холецистит). Все дети, включенные в исследование, не имели патологических отклонений в общеклиническом и биохимическом анализах крови и анализе мочи.

Антропометрические измерения включали измерение роста, массы тела, окружности талии (ОТ). Антропометрические данные обрабатывали с учетом пола и возраста пациента и оценивали в стандартных отклонениях (SD) от среднего. Индекс массы тела (ИМТ) рассчитывали как отношение массы тела (кг) к длине тела (м), возведенной в квадрат. ИМТ оценивали индивидуально по нормативам для конкретного возраста и пола и представляли в виде числа SD от среднего. Половое развитие оценивали согласно классификации Таннера (1968). Объем тестикул измеряли с помощью орхидометра Prader. Клиническая характеристика обследованных пациентов представлена в табл. 1.

С целью исследования особенностей экспрессии гена ADIPOQ в жировой ткани был произведен интраоперационный забор парных образцов висцеральной (ВЖТ) и подкожной жировой ткани (ПЖТ) объемом около 1 мл. Образцы крови для гормонального исследования забирали перед операцией в утреннее время, натощак.

Гормональные исследования включали определение общего адипонектина (Human Adiponectin ELISA, BioVendor, США) в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа.

Определение экспрессии гена ADIPOQ в ВЖТ и ПЖТ проводили методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. РНК из жировой ткани выделяли с помощью набора SV Total RNA Isolation System (Promega). После выделения РНК обрабатывали ДНКазой (RQ1 RNase-Free DNase, Promega) и еще раз очищали с помощью набора SV Total RNA Isolation System (Promega). Полученную РНК хранили при температуре –70°С до проведения анализа. Синтез кДНК проводили из полученной РНК с помощью набора First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) (в реакцию брали 2 мкг РНК, полученную кДНК разводили до 200 мкл). Реакцию проводили в объеме 25 мкл.

Программа для проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени: 1 цикл: 95°C — 3 мин; 45 циклов: 95°C — 15 с; 60 °C — 1 мин (измерение флуоресценции).

Последовательности ген-специфичных праймеров и зондов для ADIPOQ указаны в табл. 2.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica (StatSoft Inc., США, версия 8.0). Так как большинство изучаемых показателей не имело приближенно-нормального распределения, все данные представлены в виде медианы и интерквартильных размахов — Ме [25; 75]. Статистическую обработку данных выполняли с помощью непараметрических критериев статистического анализа. Для оценки статистической значимости различий между изучаемыми группами пациентов использовали критерий Манна—Уитни и дисперсионный анализ Краскела—Уоллиса с дальнейшим последующим сравнением групп методом множественных парных сравнений. Уровни экспрессии гена ADIPOQ в ВЖТ и ПЖТ сравнивали с использованием критерия Вилкоксона. Корреляционный анализ проводили с использованием непараметрического критерия Спирмена и гамма-корреляции. Критический уровень статистической значимости различий принимали равным 0,05.

Экспрессия гена ADIPOQ в ПЖТ и ВЖТ. Экспрессия гена ADIPOQ в ПЖТ и ВЖТ была проанализирована у 51 пациента (28 мальчиков и 23 девочки, средний возраст 13,6 года (8,5—15,1 года). У всей группы обследованных детей не выявлено статистически значимых различий между уровнями экспрессии в ПЖТ и ВЖТ (табл. 3),

По результатам сравнения групп детей с нормальной и с избыточной массой тела, уровень экспрессии гена ADIPOQ как в ПЖТ, так и в ВЖТ был статистически незначимо выше у детей с избыточной массой тела и ожирением на 22 и 22,6% соответственно (см. табл. 3).

Исследуя особенности экспрессии гена ADIPOQ в жировой ткани, мы выявили, что наиболее высокий уровень экспрессии гена как в ВЖТ, так и в ПЖТ, отмечается у детей на стадии полового развития Таннер 2—3. Дисперсионный анализ позволил выявить статистически значимые различия уровня экспрессии гена адипонектина в зависимости от стадии полового развития: p=0,0044 для экспрессии ADIPOQ в ВЖТ и p=0,035 для ADIPOQ в ПЖТ (рис. 1).

Корреляционный анализ по Спирмену не выявил статистически значимых корреляций экспрессии гена ADIPOQ с возрастом обследованных детей. Однако была обнаружена статистически значимая корреляция между уровнем экспрессии гена ADIPOQ в ПЖТ и такими показателями, как рост (R=0,31; р=0,02), масса тела (R=0,33; р=0,01), ОТ (R=0,3; р=0,027), ИМТ (R=0,36; р=0,007), SD ИМТ (R=0,33; р=0,01).

Кроме того, выявлена корреляция между уровнем экспрессии ADIPOQ в ВЖТ и ростом (R=0,39; р=0,002), массой тела (R=0,34; р=0,008), ОТ (R=0,33; р=0,009), ИМТ (R=0,3; р=0,02).

Уровень экспрессии гена ADIPOQ в ВЖТ положительно, но статистически незначимо коррелировал с SD ИМТ (R=0,22; р=0,09).

Адипонектин в сыворотке крови у детей. Уровень адипонектина в сыворотке крови был исследован у 62 детей. Его средняя концентрация составила 9,15 (6,43; 11,0) мкг/мл. У мальчиков уровень адипонектина был статистически незначимо выше, чем у девочек — 9,7 (8,2; 11,1) и 7,9 (6,3; 10,1) мкг/мл соответственно (р=0,085).

Наиболее высокий уровень адипонектина отмечается у детей в препубертатном периоде, при этом он отрицательно коррелирует со стадией полового развития по Таннеру (R=–0,34; р=0,0006, где R — коэффициент корреляции). При проведении дисперсионного анализа статистически значимые различия концентрации адипонектина в сыворотке в зависимости от стадии полового развития были отмечены между группами Таннер 1 и Таннер 4—5 (р=0,04). При проведении анализа отдельно для группы мальчиков и группы девочек тенденция к снижению уровня адипонектина по мере полового созревания сохранялась (табл. 5).

Концентрация адипонектина в сыворотке крови у детей с нормальной массой тела составила 9,6 (7,78; 12,1 мкг/мл), в то время как в группе с избыточной массой тела — 8,1 (6,06; 10,2 мкг/мл) (р=0,15).

Корреляционный анализ по Спирмену позволил выявить отрицательную взаимосвязь между уровнем адипонектина в сыворотке крови и возрастом обследованных детей (R=–0,3; р=0,015), ростом (R=–0,35; р=0,005), массой тела (R=–0,41; р=0,0008), ОТ (R=–0,36; р=0,004), ИМТ (R=–0,38; р=0,002), SD ИМТ (R=–0,35; р=0,004).

Исследуя взаимосвязь экспрессии гена ADIPOQ в жировой ткани с содержанием адипонектина в сыворотке крови, мы обнаружили, что уровень мРНК ADIPOQ в ПЖТ отрицательно коррелирует с содержанием адипонектина в кровотоке (R=–0,47; р=0,0003), в то время как экспрессия гена в ВЖТ не ассоциирована с данным показателем (R=–0,1; р=0,4).

Таким образом, не выявлена зависимость экспрессии гена ADIPOQ от возраста и пола обследованных детей. Не найдено также статистически значимых различий по уровню экспрессии гена ADIPOQ между ПЖТ и ВЖТ, хотя отмечалась тенденция к более высокой экспрессии гена адипонектина в ВЖТ у мальчиков. У детей с избыточной массой тела ген адипонектина экспрессировался на 22% выше в ПЖТ и на 22,6% в ВЖТ по сравнению с группой детей с нормальной массой тела. Кроме того, была выявлена положительная корреляция уровня экспрессии гена адипонектина с основными антропометрическими показателями. Установлено, что наиболее высокий уровень мРНК ADIPOQ как в ВЖТ, так и в ПЖТ отмечается у детей на стадии полового развития Таннер 2—3. Известно, что в пубертатный период в значительной мере изменяются гормональный профиль и биохимический состав организма. В этот период увеличивается общее количество жировой ткани, особенно ее висцеральный компонент, развивается так называемая пубертатная ИР. В генезе данного феномена немаловажную роль играют физиологические изменения в оси гормон роста — инсулиноподобный фактор роста 1-го типа, а также изменение уровней кортикостероидов и половых стероидов в сыворотке крови. Вполне вероятно, что эти же факторы могут влиять и на уровень экспрессии генов адипокинов. Так, в недавно проведенном исследовании было выявлено, что у детей по мере полового созревания в ВЖТ увеличивается экспрессия 11b-гидроксистероидде-гидрогеназы 1-го типа — фермента, участвующего в биосинтезе кортизола, и вследствие этого повышается локальная концентрация кортизола, что может влиять на экспрессию и секрецию адипонектина [16]. Экспрессия гена ADIPOQ в ПЖТ отрицательно коррелирует с содержанием адипонектина в сыворотке крови, что указывает на сложные механизмы регуляции секреции адипонектина жировой тканью и подтверждает данные предыдущих исследований [17, 18].

Средняя концентрация адипонектина в сыворотке крови у детей составила 9,15 (6,43; 11,0 мкг/мл). Не было выявлено статистически значимых различий содержания адипонектина в завистимости от пола обследованных детей, хотя отмечена тенденция к более высокому содержанию его у мальчиков. Выявлено, что уровень адипонектина прогрессивно снижается по мере полового созревания у детей. Это подтверждает данные литературы о непосредственном влиянии половых стероидов на секрецию адипонектина. В работе A. Bottner и соавт. было показано, что снижение уровня адипонектина в пубертатном периоде ассоциировано с повышением концентраций андрогенов в сыворотке крови — тестостерона и ДЭА-С. При проведении регрессионного анализа в группе мальчиков с нормальной массой тела стадия полового развития была более сильным, чем ИМТ, прогностическим фактором снижения содержания адипонектина в сыворотке крови [19]. В другом исследовании [20] были получены данные о том, что тестостерон ингибирует секрецию адипонектина адипоцитами, не изменяя уровень мРНК гена ADIPOQ, что предполагает посттранскрипционный характер регуляции продукции адипонектина тестостероном.

В результате проведенного исследования мы не обнаружили статистически значимых различий концентрации адипонектина между группами детей с нормальной и избыточной массой тела, что может быть следствием недостаточного числа обследованных детей. Тем не менее сильная отрицательная корреляция уровня адипонектина в сыворотке крови с показателями ИМТ, SD ИМТ и ОТ указывает на необходимость дальнейшего изучения патофизиологической роли адипонектина в развитии ожирения и связанных с ним метаболических осложнений.

1. Не обнаружено статистически значимых различий по уровню экспрессии гена ADIPOQ в ПЖТ и ВЖТ, наиболее высокий уровень экспрессии отмечается у детей на стадии полового развития Таннер 2—3.

2. Экспрессия гена ADIPOQ в ПЖТ отрицательно коррелирует с содержанием адипонектина в сыворотке крови.

3. Уровень адипонектина в сыворотке крови отрицательно коррелирует с показателями ИМТ, SD ИМТ, ОТ и степенью полового созревания.