В результате исследования гетерогенности пролактина (ПРЛ) идентифицированы 3 основные иммунореактивные формы гормона: мономерный, или низкомолекулярный, ПРЛ (монПРЛ), димерный ПРЛ (ПРЛ) и макропролактин. МонПРЛ — это 199-аминокислотный полипептид, являющийся продуктом гена пролактина и основным продуктом секреции гипофизарных лактотрофов. Исходно предполагалось, что так называемый димерный ПРЛ молекулярной массой (м.м.) около 50—60 кДа состоит из 2 молекул монПРЛ за счет формирования дисульфидных или нековалентных связей между аминокислотными цепями гормона [1]. Однако в последние годы было показано, что дПРЛ является комплексом монПРЛ и сывороточного связывающего белка 32 кДа.

При исследовании биохимической природы макропролактина (м.м. около 150 кДа) из сыворотки крови пациенток с преобладанием этой формы гормона был выделен белок, специфически и обратимо связывающий ПРЛ. Данный белок м.м. около 120—150 кДа взаимодействовал с глобулином А и распознавался поликлональными и моноклональными антителами против IgG человека. Таким образом, было показано, что преобладание в крови высокомолекулярной формы иммунореактивного ПРЛ обусловлено связыванием значительного количества монПРЛ с антипролактиновыми антителами [2, 3]. В целом ряде зарубежных исследований также было продемонстрировано, что данная форма гормона представлена комплексом монПРЛ и IgG [4—6].

В настоящее время существует целый ряд методов, позволяющих определить содержание макропролактина [7]. Стандартом в исследовании изоформ ПРЛ является гель-фильтрационная хроматография. Использование данной методики позволяет определить уровень не только мономерного ПРЛ, но также big- и big-big-форм. Недостатком его использования являются высокая трудоемкость и значительная стоимость, что не позволяет применять этот метод в повседневной лабораторной практике. Как правило, к гель-фильтрации обращаются при проведении научных исследований и при отработке того или иного метода скрининга для выявления макропролактина.

Наибольшее распространение в качестве повседневного метода скрининга для выявления макрополактина получила преципитация с полиэтиленгликолем (ПЭГ). L. Kavanagh и соавт. (2006), сравнивая целый ряд методов определения макропролактина, обнаружили, что именно преципитация с ПЭГ демонстрировала наибольшую корреляцию полученных результатов с гель-фильтрационной хроматографией [7].

В настоящее время именно метод ПЭГ-преципитации наиболее распространен в повседневной лабораторной практике для определения уровня big-big ПРЛ [8]. Он также может использоваться при проведении научных исследований в качестве метода скрининга для выявления макропролактинемии. При использовании метода ПЭГ-преципитации выявленный уровень макропролактина, как правило, несколько выше, чем при исследовании этой же сыворотки методом гель-фильтрационной хроматографии. Так, в исследовании L. Kavanagh и соавт. (2006 г.), выявляемый после соответствующей обработки раствором ПЭГ уровень монПРЛ составлял около 75% от уровня, определенного при гель-фильтрационной хроматографии [7]. Одной из причин этого может быть возможность преципитации мономерного ПРЛ с белками плазмы в процессе проведения ПЭГ, также не исключено получение ошибки из-за частичного реагирования с имеющимся в крови big-ПРЛ [9]. Согласно результатам, полученным А. Suliman и соавт. (2003), при сравнительном исследовании одних и тех же сывороток, содержащих по данным гель-фильтрационной хроматографии 2—9% макропролактина, после проведения ПЭГ-преципитации уровень макропролактина в них колебался от 30 до 36% [10, 11, 12].

Накопление данных о высокой частоте макропролактинемии у пациентов с гиперпролактинемией, а также широкое распространение метода ПЭГ-преципитиции в повседневной лабораторной практике привело к проблеме возможного пересмотра или установления для ПРЛ других норм, которые бы отражали его биологическую активность [13]. M. Fahie-Wilson и соавт. (1997) высказывали предложение об увеличении верхних границ нормы для общего ПРЛ [14]. В свою очередь L. Kavanagh-Wright и соавт. в сравнительном исследовании сывороток пациентов с гиперпролактинемией (в том числе при феномене макропролактинемии) и нормопролактинемией установили свои референсные значения для монПРЛ после ПЭГ-преципитации от 68 до 390 мЕд/л [15]. В другой работе были рассмотрены уровни ПРЛ у 110 здоровых женщин. Содержание макропролактина колебалось от 5 до 44% от общего количества. И если исходный уровень ПРЛ составил 78—564 мЕд/л, то после реакции ПЭГ-преципитации — 70—403 мЕд/л. Именно последние значения авторы рассматривали в качестве референсного интервала для монПРЛ при обследовании пациенток с гиперпролактинемией [10]. Подобная работа была выполнена и в гормональной лаборатории Эндокринологического научного центра (ЭНЦ) [16]. Согласно результатам сравнительного исследования сывороток здоровых добровольцев с нормальным уровнем общего ПРЛ, референсные значения для монПРЛ составили 27—390 мЕд/л у женщин (для общего ПРЛ 90—540 мЕд/л) и 74—385 мЕд/л у мужчин (для общего ПРЛ 40—510 мЕд/л).

В настоящее время принято констатировать макропролактинемию, если процентное содержание макропролактина, определенного при помощи гель-фильтрационной хроматографии, достигает 30—60%. В отношении метода ПЭГ-преципитации этот показатель принят за 60% [17]. В популяции пациентов, которые активно не предъявляют жалоб, характерных для гиперпролактинемии, макропролактинемия выявляется в 0,02—0,4% случаев и определяет развитие около ¼ общего числа выявленных случаев гиперпролактинемии [18, 19].

Несмотря на широкое распространение в клинической практике метода преципитации высокомолекулярных фракций ПРЛ (вмПРЛ) с ПЭГ, в некоторых иммуносистемах большая вариабельность результатов определения ПРЛ в сыворотках, обработанных ПЭГ, делает эту технологию непригодной для определения монПРЛ. Даже в случае, если ПРЛ может измеряться в обработанных ПЭГ сыворотках, необходимо использовать специальную калибровочную кривую. Хотя этот практичный скрининговый метод удовлетворяет работников лаборатории и клиницистов, несмотря на некоторую вариабельность результатов, он не всегда может быть использован для точного определения биологически активного монПРЛ в сыворотке крови.

Нами был апробирован и адаптирован опубликованный в последнее время в зарубежной литературе метод ультрафильтрации (УФ), который устраняет необходимость в построении отдельной калибровочной кривой после обработки крови ПЭГ и делает возможным определение монПРЛ в любых иммунологических системах [11].

Для отработки метода были отобраны 10 образцов сыворотки пациентов с гиперпролактинемией, у которых уровень общего ПРЛ был выше 900 мЕд/л. Все определения ПРЛ в исходных образцах, после осаждения 25% ПЭГ и УФ проводили с помощью системы Дельфия (Wallac Oy, Финляндия). Для УФ сыворотки применяли Centrifugal Filter Devices (Mellipore Cor., Billerica, США) Amicon Ultra-4 ultracel. Во всех исследуемых сыворотках при использовании метода преципитации с ПЭГ были определены исходная концентрация ПРЛ и концентрация монПРЛ [16]. При использовании метода УФ определяли концентрацию монПРЛ в фильтрате и концентрацию вмПРЛ в ретентате. Для определения ПРЛ методом УФ аликвоты (0,3 мл) 10 сывороток были центрифугированы в течение 45 мин (23°С, 560 g) в Amicon Ultra-4 ultracel 100 k. Полученный ретантат и фильтрат доводили до исходного объема (0,3 мл) фосфатным буфером для пептидных гормонов (0,1 N без BSA) и определяли содержание вмПРЛ в ретентате и монПРЛ в фильтрате. Полученные результаты после суммирования сравнивали с исходным содержанием ПРЛ, а также с содержанием вмПРЛ и монПРЛ после обработки ПЭГ.

После адаптации метода было исследовано содержание монПРЛ двумя методами в 41 сыворотке больных с гиперпролактинемией.

Набор пациенток проводили на базе ЭНЦ. Оценивали данные больных с синдромом гиперпролактинемии, обратившихся в ЭНЦ в 2008—2009 гг.

Критериями включения были возраст старше 18 лет, лабораторно подтвержденная гиперпролактинемия на момент обращения (уровень ПРЛ более 600 мЕд/л). Критерий исключения: беременность.

Возраст обследованных был в пределах от 18 до 51 года (в среднем 29 лет), интерквартильный размах 24; 32.

Согласно данным магнитно-резонансной томографии головного мозга, у 18 (43,9%) женщин (при 95% ДИ от 28,5 до 60,3%) была выявлена аденома гипофиза: у 8 — микроаденома, у 10 — макроаденома гипофиза. У 23 (56%) больных (при 95% ДИ от 39,7 до 71,5%) данных об объемном образовании гипоталамо-гипофизарной области получено не было. У одной из них был впервые выявлен синдром «пустого турецкого седла», у остальных состояние расценивалось как идиопатическая гиперпролактинемия.

При сборе анамнеза учитывали данные о сопутствующей терапии. На основании этого у всех пациенток был исключен вариант ятрогенной гиперпролактинемии.

Для последующего анализа брали образцы венозной крови из локтевой вены в утренние часы (с 9 до 11 ч). У пациенток с сохраненным менструальным циклом кровь для определения уровня ПРЛ брали на 5—7-й день менструального цикла.

Все пациентки прошли клиническое обследование, включавшее сбор жалоб, анамнеза жизни и заболевания, общеклинический осмотр, антропометрическое исследование. С целью уточнения генеза заболевания всем пациенткам проводили магнитно-резонансную томографию головного мозга.

Статистическую обработку полученных данных осуществляли с использованием пакета программ STATISTICA 6.0 (StatSoft, США). Количественные данные приведены в виде медианы и интерквартильного размаха. Для оценки значимости различий в независимых группах применяли U-критерий Манна—Уитни для количественных данных и двусторонний тест Фишера для качественных; в зависимых — критерий Вилкоксона для количественных данных. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05.

Результаты сравнения двух методов определения фракций ПРЛ с использованием 10 сывороток пациентов с гиперпролактинемией представлены на рис. 1.

Исходный уровень общего ПРЛ находился в интервале от 901 до 2714, медиана 1567 мМЕ/л. После обработки ПЭГ содержание монПРЛ составляло 260—2058, медиана — 983 мМЕ/л (см. рис. 1). Содержание вмПРЛ после вычитания содержания мПРЛ составляло 180—1478, медиана 583 мМЕ/л. После УФ содержание монПРЛ в фильтрате индивидуальных сывороток находилось в пределах 229—1207, медиана 704 мМЕ/л, что несколько меньше, чем по данным разделения ПЭГ. Содержание вмПРЛ в ретентате колебалось в пределах 525—1240, в среднем составляя 855 мМЕ/л, что незначительно выше, чем при использовании первого метода. При УФ сыворотки суммарная концентрация ПРЛ (концентрация ретентат + фильтрат) в среднем не отличалась от исходной. При сравнении общего ПРЛ индивидуальных сывороток суммарное содержание после УФ колебалось в пределах 93,9—119,6% от исходного. Коэффициент корреляции между исходным содержанием и суммарным после УФ равен 0,99. Необходимо отметить, что при анализе индивидуальных сывороток различие по содержанию монПРЛ и вмПРЛ при определении разными методами могло составлять иногда почти ±25%. Таким образом, как показали результаты сравнения двух методов, метод УФ можно использовать для определения монПРЛ у больных с гиперпролактинемией.

Клиническая характеристика пациенток с гиперпролактинемией. Ведущими клиническими проявлениями гиперпролактинемического гипогонадизма среди обследованных женщин были следующие: нарушение менструального цикла — у 16 пациенток (у 5 женщин аменорея, у 11 — олиго-опсоменорея), галакторея — у 14, бесплодие — у 8, головные боли — у 3, увеличение массы тела — у 6 больных. У пациенток старше 45 лет при нарушении менструального цикла в виде олиго-опсоменореи и вторичной аменореи с целью дифференциации с пери- и постменопаузальными изменениями исследовали уровень гонадотропинов, на основании которого из соответствующего статистического анализа нарушений менструальной функции была исключена одна пациентка.

Следует отметить, что среди 8 пациенток, предъявляющих жалобы на отсутствие наступления беременности в течение 12 мес и более, у 4 отсутствовали другие проявления гиперпролактинемии. Именно бесплодие послужило у них причиной обследования и определения уровня ПРЛ. В то же время большинство пар на момент обращения не прошли полноценного обследования, в том числе не был исключен мужской фактор, что затрудняет интерпретацию данной жалобы.

Такие специфичные для гиперпролактинемического гипогонадизма жалобы, как нарушения менструального цикла и галакторея, отмечались на момент обращения у 26 (63%) женщин. У 10 (24%) пациенток жалобы отсутствовали и гиперпролактинемия было выявлено случайно.

Среди 18 женщин с аденомами гипофиза у 2 клинические проявления гиперпролактинемии отсутствовали — у обеих имелись микроаденомы. Следует отметить, что частота инциденталом гипофиза по данным аутопсий достигает 25—30%. Следовательно, нельзя исключить сочетание идиопатической формы гиперпролактинемии и гормонально-неактивной аденомы гипофиза у обследуемых пациенток.

Лабораторная характеристика пациенток с гиперпролактинемией. Уровень общего ПРЛ до определения его фракций у обследованных женщин с гиперпролактинемией составил 1569 мЕд/л (медиана), интерквартильный размах 1194; 2216. Статистически значимого различия по уровню ПРЛ в зависимости от наличия аденомы гипофиза и специфичных для гиперпролактинемического гипогонадизма жалоб не выявлено (табл. 1).

Согласно данным исследования ПРЛ до и после ПЭГ-преципитации, макропролактинемия была выявлена у 22 пациенток. Высокая частота выявления макропролактинемии может быть обусловлена смещением выборки по следующим причинам: пациентки обследовались в специализированном эндокринологическом центре; в ряде случаев они направлялись на данное обследование в связи с расхождением в лабораторных результатах и клинической картине заболевания; частота выявления бессимптомных форм гиперпролактинемии была значимо выше среди больных с макропролактинемией (р=0,0033, критерий Фишера).

Были проанализированы результаты исследования монПРЛ и вмПРЛ с использованием метода ПЭГ-преципитации и УФ у обследованных больных. Как абсолютное содержание вмПРЛ, так и его доля были выше по результатам проведения УФ (табл. 2).

Как абсолютное содержание вмПРЛ, так и его доля были выше по результатам проведения УФ. Это соответствует данным ряда зарубежных исследований [20]. Объяснением этого факта может служить различие по составу вмПРЛ, отделяемой в процессе ПЭГ-преципитации и УФ. ПЭГ способен связывать комплекс IgG-монПРЛ, т.е. позволяет отделить именно макропролактин, а в диагностируемой в последующем сыворотке содержится как монПРЛ, так и big-ПРЛ. При проведении УФ использовались фильтры Amicon 100К, которые позволяют отфильтровать как макропролактин м.м. около 100—150 кДа, так и big-ПРЛ м.м. около 50 кДа. Таким образом, фильтрат предположительно содержит только монПРЛ м.м. 23 кДа.

У большинства пациенток уровень вмПРЛ по данным УФ был выше, чем по результатам ПЭГ-преципитации. Нам представлялось важным оценить выраженность этих различий. Максимальное расхождение составляло 9805 мЕд/л: вмПРЛ (ПЭГ) — 30 мЕд/л, вмПРЛ (УФ) — 9835 мЕд/л. Однако наибольший интерес представляли редкие случаи, когда уровень вмПРЛ после УФ был ниже, чем после ПЭГ-преципитации. У 5 пациенток содержание вмПРЛ (ПЭГ) на 100 мЕд/л и более превышало содержание вмПРЛ (УФ). Наибольший разброс значений при данном феномене составил 402 мЕд/л: вмПРЛ (ПЭГ) — 1625 мЕд/л, вмПРЛ (УФ) — 1223 мЕд/л. Причину такого состояния еще предстоит выяснить.

Учитывая, что у обследуемых женщин уровень общего ПРЛ и вмПРЛ значительно колебался, мы сочли целесообразным сравнить и относительное содержание вмПРЛ, рассчитанное после ПЭГ-преципитации и УФ. Расхождение результатов колебалось от 0,01 до 54% (рис. 2).

Различие между уровнями вмПРЛ по результатам ПЭГ-преципитации и УФ менее 10% от общего количества ПРЛ было отмечено у 22 пациенток. Расхождение в результатах более чем 40% от общего содержания ПРЛ было выявлено у 6 больных.

Соответствие клинических, лабораторных и данных нейровизуализации пациенток с учетом результатов ПЭГ-преципитации и УФ. Было проанализировано содержание монПРЛ в зависимости от генеза заболевания, а также наличия специфичных жалоб (табл. 3).

Следует отметить, что у всех 10 пациенток, не предъявляющих жалоб на момент обращения, уровень монПРЛ после ПЭГ-преципитации был в пределах референсных значений (менее 390 мЕд/л). В то же время среди 22 пациенток с гиперпролактинемией и нормальным содержанием монПРЛ (ПЭГ), у 7 (35%) были жалобы на нарушения менструального цикла либо галакторею: монПРЛ (ПЭГ) — 263 (198; 285), монПРЛ (УФ) — 205 (155; 394; p>0,05). У 3 пациенток из этих 7 обращало внимание различие по содержанию монПРЛ после ПЭГ-преципитации и УФ более чем 100 мЕд/л (131, 219 и 402 мЕд/л). При этом выше был именно уровень монПРЛ, исследованный после УФ. Можно предположить, что во время ПЭГ-преципитации у этих пациенток был осажден не только макропролактин, но и часть монПРЛ, что и привело к расхождению результатов лабораторного исследования с использованием методики ПЭГ-преципитации и имеющихся клинических проявлений.

Клинический пример. Пациентка Б., 1977 г.р., обратилась в январе 2008 г. с жалобами на нарушения менструального цикла, бесплодие в течение 3 лет. Из анамнеза: росла и развивалась соответственно возрасту. Менархе в 14 лет. Менструальный цикл до 22 лет был регулярным. В течение последних 7—8 лет отмечает периодически нарушения менструального цикла — задержки до 2 нед. С данными жалобами к врачам длительно не обращалась. В 2004 г. (26 лет) — неразвивающаяся беременность на сроке 6 нед. С 2005 г. — половая жизнь без предохранения. Супруг обследован — спермограмма соответствует норме. У пациентки исключены инфекционно-воспалительные заболевания органов малого таза. По данным гистеросальпингографии, маточные трубы проходимы с обеих сторон. По поводу нарушений менструального цикла и отсутствия беременности в январе 2007 г. обратилась к эндокринологу по месту жительства. При гормональном обследовании было выявлено повышение уровня ПРЛ — 2331 мЕд/л (норма до 375 мЕд/л). При рентгенографии черепа патологии не выявлено. Был назначен бромокриптин в дозе 2,5 мг/сут, на фоне чего отмечалась нормализация уровня ПРЛ. Кроме того, в течение первых 6 мес приема бромокриптина отмечалась нормализация менструального цикла, однако в последующем, несмотря на продолжение приема препарата и нормальные уровни ПРЛ, вновь стали беспокоить задержки менструаций до 10 дней. Беременность не наступала. С данными жалобами пациентка обратилась в ЭНЦ.

При обследовании в январе 2008 г.: по системам и органам — без патологии. Галактореи нет. Гормональное обследование: ПРЛ 1018 мЕд/л (норма 90—540 мЕд/л), монПРЛ (ПЭГ) 322 мЕд/л, ТТГ 3,0 мЕд/л (норма 0,25—3,5 мЕд/л), ФСГ 5,0 Ед/л (норма1,9—11,6 Ед/л), ЛГ 9,1 Ед/л (норма 2,5—12,0 Ед/л), тестостерон 2,4 нмоль/л. По данным магнитно-резонансной томографии головного мозга, патологии гипоталамо-гипофизарной области не выявлено. УЗИ малого таза (на 8-й день менструального цикла): без патологии. С учетом наличия у пациентки макропролактинемии, нормального уровня монПРЛ было рекомендовано динамическое наблюдение: контроль уровня ПРЛ и монПРЛ через 4—6 мес, исследование овуляторной функции яичников. При повторной консультации пациентка сообщила, что в течение 2 менструальных циклов проводила фолликулометрию, при этом данных, подтверждающих наличие доминантного фолликула, признаков овуляции и наличие желтого тела, выявлено не было. При повторном обследовании: ПРЛ 3083 мЕд/л, монПРЛ (ПЭГ) 285 мЕд/л, монПРЛ (УФ) 504 мЕд/л. Таким образом, у пациентки было отмечено значимое различие в содержании монПРЛ, исследованного с использованием двух различных методик, и имелся редкий феномен, при котором по результатам ПЭГ уровень монПРЛ был ниже. Было принято решение о назначении терапии каберголином по 0,5 мг в неделю с последующим контролем уровня ПРЛ.

Резистентность к терапии агонистами дофамина. Среди 41 обследованных 24 ранее получали терапию агонистами дофамина. При этом у 7 (25%) пациенток, согласно данным анамнеза, отмечалась полная (у 3) либо частичная (у 4) резистентность к проводимой терапии (табл. 4).

При сравнении пациенток с резистентностью к терапии агонистами дофамина и нормальным ответом на лечение было выявлено значимое различие по уровню монПРЛ после как ПЭГ, так и УФ (р=0,017 и р=0,045 соответственно). По уровню общего ПРЛ группы не различались. Согласно данным, представленным в табл. 4, у 5 пациенток было выявлено различие по уровню монПРЛ (УФ) и монПРЛ (ПЭГ) более 10% от общего количества ПРЛ, а у 2 из них — более 50%. Этих пациенток отличает, по-видимому, большее содержание димерной формы ПРЛ. Малое число пациентов не позволяет на данном этапе делать выводы о зависимости между содержанием различных фракций ПРЛ и ответом на терапию агонистами дофамина. Однако выявляемые тенденции обусловливают необходимость дальнейшего изучения.

Необходимость исследования изоформ ПРЛ в повседневной лабораторной практике не вызывает сомнения. При этом методы определения фракций ПРЛ могут быть различными. В данном исследовании впервые в России было проведено изучение фракций ПРЛ в сыворотках пациентов с гиперпролактинемией с применением как метода ПЭГ-преципитации, так и УФ, и было показано, что метод УФ можно использовать для определения монПРЛ.

Кроме того, продемонстрировано, что при использовании УФ и ПЭГ-преципитации определяемые в последующем уровни монПРЛ сыворотки крови пациента различаются. Предположительно это связано с возможностью отсепарировать в процессе УФ не только макропролактин, но и big-ПРЛ. В то же время при изучении взаимосвязи уровня монПРЛ и генеза заболевания, а также клинической картины гиперпролактинемического гипогонадизма как метод ПЭГ-преципитации, так и УФ дали сходные результаты. Это позволяет сделать вывод о возможности использования обоих методик в качестве скрининга для выявления макропролактинемии.

Представляется важным дальнейшее изучение тех редких ситуаций, когда уровень монПРЛ, выявленный после ПЭГ-преципитации, значимо ниже, чем после УФ. Изучение данного феномена может позволить исключить случаи ошибки в диагностике феномена макропролактинемии у пациентов с выраженной клинической картиной заболевания. Так же, дальнейшее изучение фракций ПРЛ при гиперпролактинемии может помочь в раскрытии феномена резистентности к терапии агонистами дофамина.