Спорные вопросы фармакологии ботулотоксина типа A

Ботулинические токсины (БТ) — наиболее сильнодействующие белковые токсинаы среди бактериальных, животных, растительных и химических отравляющих веществ, являющиеся причиной развития ботулизма [1]. Вместе с тем лекарственные средства на основе БТ имеют огромные перспективы в лечении различных заболеваний. До сих пор продолжается изучение многих вопросов фармакологии БТ, имеющих большое значение в перспективе создания и лекарственных препаратов на их основе, и противоботулинических средств.

В настоящем обзоре описаны уникальные молекулярные механизмы, лежащие в основе различных этапов фармакологического действия БТ типа A (БТА), и возможные факторы, влияющие на чувствительность организма к БТ.

БТ представляет собой белок-димер с молекулярной массой 150 кДА с химической формулой C6760H10447N1743O2010S32, состоящий из двух цепей: легкой (L) и тяжелой (H). L-цепь составляет приблизительно ¹/₃ молекулярного веса и связана с H-цепью дисульфидной связью [2].

L-цепь является протеазой, разрушающей транспортные белки внутри клетки, она образует каталитический домен молекулы БТ. H-цепь содержит 2 домена: домен связывания соединяется с рецепторами на поверхности клетки-мишени, домен транслокации участвует в процессе транслокации L-цепи, формируя канал в мембране. Молекула БТ представляет собой диполь, она имеет электрический заряд, который уменьшается от связывающего домена к каталитическому [3]. Это играет большую роль при ориентации молекулы относительно мембраны клетки для облегчения связывания с рецепторами.

В природной среде БТ синтезируются бактериями в виде комплекса с несколькими белками: одним нетоксичным негемагглютинином (NTNHA) и несколькими гемагглютининами [1].

NTNHA имеет молекулярную массу 130 КДА и обладает очень высокой степенью гомологии аминокислотных последовательностей с БТ, отличаясь от молекулы БТ только отсутствием протеазного мотива. Взаимодействуя с молекулой БТ по типу «рука в перчатке», он защищает ее от агрессивного действия факторов окружающей среды, в том числе протеолитических ферментов пищеварительного тракта [4].

Существует три класса гемагглютининов: с молекулярной массой 33—35, 15—18 и 70 КДА [5]. Они напрямую не контактируют с молекулой БТ, присоединяются к NTNHA и играют роль молекулы адгезии при абсорбции токсинового комплекса.

Нетоксичный гемагглютинин и белки гемагглютинины могут образовывать с БТ большое разнообразие мультимерных комплексов, называемых комплексами БТ. Каждый из них содержит только одну молекулу БТ, которая может высвобождаться из комплекса при изменении pH среды [2].

БТ могут поступать в организм и через поврежденные, и через неповрежденные ткани. В медицинских целях препараты БТА вводят локально, преимущественно инъекционно, в максимальной близости от клеток-мишеней. Уже разработаны препараты для аппликационного применения БТА, без повреждения покровных тканей, однако пока они не прошли третью фазу клинических исследований [6, 7].

В природных условиях БТ действует системно, вызывая ботулизм, и поступает в организм в основном через неповрежденные мембраны.

В зависимости от пути поступления токсина в организм можно выделить следующие формы ботулизма: пищевой (возникающий после приема пищи, загрязненной ботулотоксином), детский (после приема пищи, загрязненной спорами бактерий), ингаляционный (после вдыхания БТ-содержащих аэрозолей), раневой (в большинстве случаев связан с применением инъекционных наркотиков), ятрогенный [8].

В природных условиях БТ, для того чтобы попасть к клеткам-мишеням, должен пересечь эпителиальные барьеры и достигнуть общей циркуляции, этот процесс называется абсорбцией.

Проникновение БТ через кишечный или легочный эпителий возможно с помощью двух механизмов: через клетку и через межклеточные контакты.

При трансцитозе (проникновении через клетку эпителия) БТ связывается ганглиозидными рецепторами на поверхности эпителиоцита и подвергается эндоцитозу (заключению в везикулу). Транспортные везикулы переносят токсин по всей длине клетки и выпускают в общую циркуляцию. При трансцитозе не происходит ни изменения структуры токсина, ни выхода его цепей в цитозоль клетки, что отличает связывание БТ с эпителиоцитами от связывания с нейронными клетками [9, 10].

Парацеллюлярный путь (через межклеточные контакты) может происходить как с помощью комплексообразующих белков, так и без них. Комплексообразующие гемагглютинины способны связываться с E-кадгерином межклеточных соединений эпителия и разрушать их, позволяя БТ проникнуть в общий кровоток [4]. Однако молекула БТ может разрушать эпителиальные барьеры и без помощи комплексообразующих белков. A. Maksymowych и соавт. (1999), F. Al-Saleem и соавт. (2012) [11, 12] экспериментально доказали, что введение эквимолярных количеств свободного БТА и комплекса БТА приводит к эквивалентным титрам БТ в общей циркуляции, одинаковой токсичности и эффективности. Однако предполагается, что гемагглютинины увеличивают скорость транспорта БТ через эпителий.

При транспорте через кишечную стенку БТ может связываться с холинергическими и серотонинергическими нейронами энтеральной (кишечной) нервной системы, находящимися в подслизистом пространстве кишки и регулирующими моторную и секреторную активность кишечника, и блокировать их. Этим объясняется появление нарушения моторики кишечника (запоры) как одного из ранних симптомов пищевого и детского ботулизма [13].

Проникнув через эпителиальный барьер, БТ попадает в кровоток и распределяется по всем отделам внеклеточной жидкости в организме, за исключением тех, которые находятся в центральной нервной системе.

K. Eisele и соавт. (2011) провели серию экспериментов [14], показывающих, что при значениях pH, близких к нейтральному (pH артериальной крови 7,37—7,43 [15, 16]), комплекс БТ диссоциирует на активный БТ и комплексообразующие белки с периодом полураспада <1 мин. С момента диссоциации токсинового комплекса комплексообразующие белки перестают иметь клиническое значение.

F. Al-Saleem и соавт. (2008) [17] экспериментально доказали, что токсин достигает общей циркуляции без явных изменений в структуре и биологической активности. Общая циркуляция действует как отсек для хранения токсина до тех пор, пока БТ не попадет к клеткам-мишеням. Во время нахождения в общей циркуляции БТ подвергается незначительной биотрансформации, не накапливается в клетках крови и остается в основном в свободном активном состоянии. Концепцию «общая циркуляция — отсек для хранения БТ» подтверждают различные исследования. R. Fagan и соавт. (2009) [18] описали наличие активного БТА в сыворотке крови человека через 11 сут после приема зараженной пищи, A. Sheth и соавт. (2008) [19] — через 25 сут, L. Delbrassinne и соавт. (2018) [20] — через 29 сут.

Из внутрисосудистого жидкого компартмента БТ попадает во внесосудистый компартмент, а затем в межклеточную жидкость. При инъекционном локальном применении в медицинских целях БТ сразу попадает во внесосудистый (или во внутрисосудистый при инъекции в сосуд) компартмент вблизи клеток-мишеней, минуя стадию абсорбции. Из межклеточного компартмента БТ должен попасть к мишени — периферическому холинергическому нервному окончанию и связаться с рецепторами на нем.

Для понимания механизма связывания БТ с рецепторами необходимо представлять, как проходит нейротрансмиссия в синапсе в норме.

Нейромедиаторы синтезируются в цитозоле нейронов и хранятся в пресинаптическом нервном окончании внутри синаптических пузырьков (везикул). В мембране синаптических пузырьков расположен протонный насос (везикулярная АТФаза), работа которого вызывает повышение концентрации протонов внутри везикулы [8]. Электрохимический градиент протонов обусловливает поступление медиатора из цитозоля в везикулу и накопление в ней. Везикулы с медиатором располагаются в цитоплазме нейрона и связываются со специализированными участками пресинаптической мембраны (активными зонами [21]) в процессе, известном как стыковка [22]. Стыковка везикул с мембраной клетки происходит только в активных зонах и регулируется большим набором транспортных белков [23].

Вследствие прохождения нервного импульса пресинаптическая мембрана аксона деполяризуется, открываются кальциевые каналы и ионы Ca²⁺ поступают внутрь аксона [24]. В ответ на приток Ca²⁺ везикула с медиатором сливается с пресинаптической мембраной в активной зоне. Эта стадия называется праймингом, в ее регуляции участвуют два интегральных мембранных белка синаптической везикулы (синаптобревин и синаптотагмин), а также два белка в пресинаптической мембране (SNAP25 и синтаксин) и цитозольные белки, включая комплексин [25—28].

Быстрое конформационное изменение везикулы с помощью регуляторных белков приводит к полному слиянию синаптической везикулы с пресинаптической мембраной и образованию поры, через которую нейромедиатор высвобождается в синаптическую щель [29].

Нейромедиатор диффундирует из нервного окончания и связывается с постсинаптическим рецептором, который запускает сигнализацию в постсинаптической клетке. В случае нейромышечного соединения ацетилхолин связывается с рецептором на плазматической мембране миоцита, что влечет за собой деполяризацию мембраны мышечной клетки. Деполяризация мембраны приводит к поступлению Ca²⁺ внутрь миоцита и сокращению мышцы.

Во время высвобождения нейромедиатора просвет синаптической везикулы временно открывается наружу в синаптическую щель, но позже интернализуется в нервные окончания в процессе эндоцитоза. После эндоцитоза везикула вновь наполняется нейромедиатором — и начинается следующий цикл нейротрансмиссии [30].

Связывание активных молекул БТА с клетками-мишенями происходит через рецепторы на поверхности клеток [31]. Для связывания с пресинаптической мембраной аксона необходимо взаимодействие активной молекулы БТА с комбинацией высоко- и низкоаффинных рецепторов [32]. В настоящий момент в этой комбинации описаны 3 рецептора и несколько корецепторов.

Эндоцитоз активной молекулы токсина и дальнейшие ее изменения возможны только после связывания со всей комбинацией рецепторов на поверхности аксона [5]. Связывание с одним рецептором без взаимодействия с другими не приведет к интернализации токсина. Такой многоступенчатый механизм связывания БТА с рецепторами компенсирует низкую концентрацию БТА в циркулирующих жидкостях, высокую скорость движения внеклеточной жидкости вокруг клеток и малую площадь поверхности аксонов.

Первым рецептором к БТА на поверхности аксона является полисиалоганглиозид GT1b (ПСГ).

Ганглиозиды — это гликозилированные липиды, входящие в состав мембран клеток. Хотя ганглиозиды присутствуют во всех тканях позвоночных, они более распространены в мембранах нейронов [33], где участвуют в оптимальном образовании миелина, аксон-миелиновых взаимодействиях, периферической и центральной стабильности аксонов [32].

Плотность расположения ПСГ на пресинаптической мембране велика. ПСГ организованы в микродомены вблизи активных зон пресинаптической мембраны [34]. Расположение ПСГ-рецепторов в этих зонах имеет большое значение в процессе связывания БТ с остальными рецепторами.

Олигосахаридная (БТ-связывающая часть) ПСГ выступает далеко за пределы поверхности мембраны в синаптическую щель и имеет отрицательный электрический заряд [8]. Молекула БТА представляет собой диполь, в котором домен связывания заряжен положительно [3]. Эта разница электрических зарядов домена связывания БТА и ПСГ-рецепторов (и других анионных липидов мембраны аксона) позволяет переориентировать молекулу БТА по мере продвижения его к мембране, увеличивая вероятность связывания с рецептором.

В настоящее время предполагается, что ПСГ являются начальными связующими участками, которые выводят токсин из сравнительно большого трехмерного пространства межклеточной жидкости и перемещают в двухмерное пространство плоскости мембраны [5]. Это в свою очередь необходимо для связывания токсина с последующими рецепторами. С одной стороны, связывание с ПСГ необратимо, так как БТА извлекается из межуточного вещества и закрепляется на мембране аксона. С другой стороны, на этом этапе токсин все еще подвержен воздействию и доступен для нейтрализующих антител.

Вместе с тем ПСГ являются мембранными рецепторами как для БТ, так и для ассоциированных с нейропатией человека антиганглиозидных аутоантител. Выработка аутоантител к ПСГ при нейропатии может играть роль в снижении чувствительности к БТ и возникновении резистентности [35].

Субдомен НС БТА имеет структурную гомологию с основным фактором роста фибробластов (FGF) [36]. Это сходство структуры дает возможность БТА связываться с белковым рецептором фактора роста фибробластов 3 (FGFR3b) на поверхности аксона с высокой аффинностью [37].

Однако FGFR3b тропен не только к БТА, но и ко многим факторам роста фибробластов. Причем тропность этого рецептора к факторам роста выше, чем к БТ. Нативные лиганды для FGFR3 — факторы роста FGF1, FGF2 и FGF9 — конкурируют за связывание с FGFR3 и, занимая рецепторы, способны блокировать поглощение БТА клетками [8].

Кроме того, активность рецепторов FGFR3b регулируют несколько низкоаффинных кофакторов, включая гепарансульфат, нейропилин-1, аносмин и др. [38]. Неспецифичность рецептора FGFR3, конкуренция за него между БТА и факторами роста фибробластов, влияние кофакторов на активность рецептора могут объяснить уязвимость этого рецепторного механизма и соответственно переменную чувствительность к БТ. Кроме того, при некоторых состояниях, связанных с мутацией FGFR3 (скелетные дисплазии, эпидермальные невусы, себорейный кератоз, гиперинсулинемия), может экспрессироваться дефектный FGFR3 [39—43]. Влияние мутации FGFR3 на чувствительность к БТ еще предстоит изучить.

SV2 — белковый рецептор, расположенный в мембране везикул [44] всех периферических и центральных нейронов, а также в мембранах секреторных гранул эндокринных клеток [45]. SV2 экспрессируется мембранами везикул клеток, накапливающих не только ацетилхолин, но и ГАМК, дофамин, глутамат, субстанцию Р и некоторые другие медиаторы [46].

В отличие от ПСГ-рецептора, экспрессируемого в синаптическую щель, БТА-связывающий сайт SV2-рецептора выступает в просвет синаптической везикулы и недоступен для токсина, пока везикула находится в цитозоле аксона [47]. SV2 становится доступен для БТА в момент слияния везикулы с пресинаптической мембраной и экзоцитоза ацетилхолина [48].

Таким образом, связывание БТА со всей комбинацией рецепторов происходит в активных зонах только после слияния синаптической везикулы с пресинаптической мембраной и открытия просвета везикулы в синаптическую щель, что облегчает последующий эндоцитоз БТА. После связывания с комбинацией рецепторов и эндоцитоза БТ становится недоступен влиянию нейтрализующих антител.

Связывание молекулы БТА с рецепторами приводит к рецептор-опосредованному эндоцитозу как рецепторов, так и токсина [49].

Просвет везикулы сразу после эндоцитоза имеет нейтральный pH. Протонный насос везикулярной АТФазы управляет повторным поглощением нейромедиатора [50] и накачивает протоны в синаптическую везикулу, в результате чего pH просвета везикулы постепенно уменьшается [51].

Закисление среды везикулы приводит к необратимым конформационным изменениям как H-цепи, так и L-цепи БТА. В результате этих изменений H-цепь, оставаясь связанной через рецепторы с мембраной везикулы, формирует в ней трансмембранный H-канал [52, 53], через который из везикулы в цитозоль выходит конформационно измененная L-цепь [54], после чего разрушается связывающая цепи дисульфидная связь.

Транслокация L-цепи происходит между pH 4,5 и 6. Снижение pH приводит к протонированию карбоксилатных аминокислотных остатков, входящих в состав H-цепей и L-цепей БТА. Карбоксилатные остатки располагаются на одной стороне молекулы токсина, и их протонирование приводит к значительным изменениям формы молекулы [55]. Молекула БТА положительно заряженной поверхностью взаимодействует с анионной поверхностью мембраны везикулы, образуя белково-липидный комплекс [56]. Предполагается, что L-цепь становится «расплавленной белковой глобулой», которая приобретает гидрофобность [8]. С одной стороны, гидрофобность L-цепи обеспечивает ее прохождение через мембранный канал, сформированный H-цепью. С другой стороны, при снижении pH более гидрофобной становится та поверхность молекулы, где располагается дисульфидная связь. Это обеспечивает сохранение целостности дисульфидной связи до полной транслокации L-цепи.

Для того чтобы пересечь мембрану везикулы, L-цепь должна быть дисульфидно связана с H-цепью на всем протяжении процесса транслокации [55]. Преждевременный разрыв дисульфидной связи на любой стадии до ее выхода в цитозоль прерывает транслокацию L-цепи [57].

В завершение процесса транслокации дисульфидная связь разрушается под действием системы тиоредоксинредуктаза (TrxR)—тиоредоксин (Trx), высвобождая L-цепь для экспрессии ее каталитической активности в цитозоле [58].

Система TrxR—Trx — основная окислительно-восстановительная система клетки. TrxR и Trx являются белками цитозольной стороны мембраны везикулы, и их ингибирование может блокировать развитие эффекта БТА на той стадии, где токсин уже недоступен действию нейтрализующих антител [59]. G. Zanetti и соавт. (2015) в экспериментах in vitro показали, что ингибиторы ферментной пары TrxR—Trx препятствуют протеазной активности L-цепи всех известных серотипов БТ в культивируемых нейронах, а in vivo предотвращают токсин-индуцированный паралич у мышей независимо от серотипа БТ [60].

В модели жизненного цикла разрыв дисульфидной связи означает конец внутриклеточного существования интактной активной молекулы БТА (голотоксина). Даже если бы L-цепь или H-цепь были экспортированы из клетки, ни одна из них сама по себе не могла бы нарушить функцию клетки. Только голотоксин обладает способностью проходить множество стадий, которые завершаются блокадой передачи [61]. С другой стороны, конформационные изменения, связанные с pH-индуцированной транслокацией L-цепи в цитозоль, создают «ловушку», которая делает невозможной как ретротранслокацию в эндосому, так и возвращение активной молекулы токсина во внешнюю среду клетки [5].

Измененная L-цепь через H-канал выходит в цитозоль нейрона, где действует как металлопротеаза. Она ферментативно расщепляет девять аминокислот из C-конца растворимого N-этилмалеимидочувствительного рецептора прикрепления фактора (SNARE) белка SNAP25 (SNAP25206), в результате чего образуется SNAP25197 [62, 63]. Интактный SNAP25 необходим для прикрепления везикулы с медиатором и последующего высвобождения нейротрансмиттера, также он непосредственно участвует в регуляции работы Ca-каналов пресинаптической мембраны [64]. Расщепление SNAP25 нарушает экзоцитоз медиаторов, вызывая блокаду передачи нервного импульса [65].

Синаптическая активность очень чувствительна к расщеплению минимального количества SNAP25. Выдвигаются гипотезы, что SNAP25 в цитозоле нейронов существует в виде различных пулов и лишь небольшое количество SNAP25 активно участвует в процессе экзоцитоза и доступно действию L-протеазы [66]. Это подтверждают эксперименты, показывающие, что расщепление 10—15% от общего внутриклеточного пула SNAP25 достаточно для полной блокады высвобождения нейромедиатора [67—69]. Расщепление L-протеазой всего 2—3% пула SNAP25 приводит к блокированию миниатюрных постсинаптических потенциалов клеток (слабой деполяризации постсинаптических мембран в состоянии нейромышечного покоя) [70].

Вместе с тем белок SNAP25197, продукт протеолиза SNAP25, самостоятельно выступает ингибитором экзоцитоза [71]. F. Meunier и соавт. [72] описали, что SNAP25197 способен долгое время сохраняться в цитозоле в составе непроизводительного комплекса SNARE, увеличивая продолжительность действия БТА. Тогда как удаление нескольких аминокислот из SNAP25197 приводит быстрому восстановлению экзоцитоза.

Цинк необходим для каталитической активности L-цепи. Одна молекула ботулинического голотоксина содержит один атом цинка, удерживаемый цинксвязывающей аминокислотной последовательностью L-цепи, и это связывание обратимо [73].

Закисление везикулы вызывает протонирование цинксвязывающих участков молекулы БТ. При транслокации происходит денатурация L-цепи, при которой теряется целостность хелатного сайта. Это приводит к диссоциации связанного цинка и его присоединению к пулу цитозольного цинка.

L. Simpson и соавт. [74] в эксперименте in vitro установили, что удаление цинка из активной молекулы БТ приводило к потере каталитической активности L-цепи в бесклеточных препаратах, но сохранению активности в интактных нервно-мышечных соединениях вследствие того, что интернализованный токсин связывал цитозольный цинк. Таким образом, цинк, который удерживается голотоксином (неповрежденной активной молекулой), не является тем же самым цинком, который связан с каталитически активной L-цепью. L-цепь связывает цитозольный цинк.

Основной мишенью БТА являются периферические нейроны, где БТ ингибирует высвобождение ацетилхолина [75].

Большое количество исследований, проведенных на клетках, показало, что БТА не только блокирует высвобождение ацетилхолина, но и предотвращает высвобождение многих других нейромедиаторов, если они накапливаются и хранятся в везикулах [32]. К ним относятся адреналин, норадреналин, дофамин [76, 77], глутамат [78], глицин [79], серотонин [80], субстанция Р [81] и др. Исходя из этого, БТ должен рассматриваться не как специфический блокатор выделения ацетилхолина, а как блокатор экзоцитоза различных медиаторов, что имеет огромные перспективы в лечении и профилактике многих заболеваний.

Дальнейшее изучение уникальных механизмов фармакологии БТ открывает перспективы поиска возможностей влиять на его действие: пролонгировать или уменьшать длительность эффекта, повышать или понижать чувствительность к БТ определенных групп пациентов, а также поможет разработать протоколы оптимального сочетания применения БТ с различными видами эстетических процедур. Более глубокое понимание множественных аспектов не только нейрональной селективности БТ, но и взаимодействия БТА с ненейрональными клетками позволит найти новые направления терапевтического применения препаратов на основе БТ в разных сферах медицины.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.