Фазы раневого процесса. Для того чтобы оценить изменения, происходящие в заживающих ранах, необходимо проводить исследования, включающие цитологические исследования раневого экссудата в ранние сроки (первые 3 сут) и гистологические исследования формирующейся грануляционной и рубцовой тканей в первые 5—15 дней после возникновения раны. Для этих целей подходят лабораторные животные, кожа которых имеет параметры заживления (этапы и сроки), сопоставимые с таковыми у человека. Этим требованиям соответствуют лабораторные мыши [1]. Раневой процесс и регенерация у мышей с детальным гистологическим разбором подробно описаны в различных статьях [2, 3]. Процесс заживления раны состоит из нескольких последовательных фаз:

— экссудация и воспаление (некоторые авторы выделяют фазу гемостаза, предшествующую фазе воспаления);

— пролиферация;

— реорганизация или ремоделирование [4].

Первая фаза (фаза экссудации и воспаления) характеризуется активацией системы свертывания крови и образованием белого тромба в месте повреждения для первичной остановки кровотечения. В эту же фазу формируется матрица для дальнейшего синтеза соединительной ткани. Этот каркас состоит из гиалуроновой кислоты, гликопротеинов и протеогликанов.

Доказана связь между популяционным составом клеток воспалительного инфильтрата и интенсивностью формирования фиброза. Эта связь опосредована межклеточными взаимодействиями, которые обеспечиваются цитокинами, факторами роста и некоторыми другими биологически активными соединениями, о чем свидетельствуют результаты независимых исследований [5—9]. Так, обнаружено, что первыми в очаг воспаления мигрируют нейтрофилы, и их представительство в ране максимально в первые 2 дня после травмы. Роль этих клеток — очищение раны от бактерий и мертвых клеток посредством фагоцитоза. В рубцовой грануляционной ткани длительно незаживающих ран наблюдается повышенное количество нейтрофилов, что косвенно подчеркивает их роль в стимуляции формирования фиброза [5]. У мышей с нейтропенией закрытие и реэпетилизация раны проходили быстрее [6]. Согласно исследованию это явление связано с тем, что выделяемые нейтрофилами протеазы и эластаза расщепляют эластин и различные белки внеклеточного матрикса (ВКМ), такие как фибронектин, ламинин, витронектин и коллаген IV. Протеолиз этих структурных матриксных белков препятствует образованию соединительнотканного каркаса, необходимого для заживления раны.

Внутриутробное заживление ран без рубцов у плода характеризуется слабой выраженностью или отсутствием воспалительной реакции вследствие незрелости иммунной системы [7]. Во внутриутробном периоде нейтрофилы и тромбоциты слабо дегранулируют и выделяют меньше хемоаттрактантов, чем те же клеточные популяции во взрослом организме. К тому же кожный покров плода имеет отличное от взрослого организма соотношение компонентов межклеточного вещества: коллагена, протеогликанов и гиалуроновой кислоты. Это соотношение также влияет на процессы ранозаживления.

Моноцитарный хемотаксический белок-1, фрагменты белков ВКМ, TGF-β, на 2—3-и сутки привлекают в рану моноциты, которые в ней превращаются в макрофаги. Они фагоцитируют пришедших ранее апоптотических нейтрофилов и способствуют как заживлению ран, так и формированию рубцов [8]. Макрофаги выполняют не только функцию очищения раны, они играют также синтетическую роль, выделяя фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), факторы роста фибробластов (FGFs), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), трансформирующий фактор роста (TGF-β), необходимые для реэпителизации, роста грануляционной ткани и рубцевания [9].

В ответ на сигналы, исходящие из некротизированных участков ран, формируется грануляционная ткань, основа которой — новообразованные капилляры.

Затем наступает вторая фаза раневого процесса, во время которой интенсивно пролиферируют фибробласты и эндотелий капилляров, в результате чего формируется грануляционная ткань. Коллагеногенез и формирование белково-полисахаридных комплексов соединительнотканного матрикса непосредственно связан с процессом новообразования капилляров [10]. Формирующиеся элементы микроциркуляторного русла (МЦР) представляют собой своеобразный биологический матрикс, из которого и происходит миграция фибробластов, продуцирующих коллаген. Одновременно с этим миофибробласты продуцируют актин и десмин, которые обеспечивают сближение краев раны и уменьшают площадь раневой поверхности, а вновь образованные сосуды обеспечивают доставку кислорода к клеткам, активно участвующим в процессе ранозаживления [11]. Именно поэтому крайне сложно, но очень важно выявить «золотую середину» в параметрах воздействия на ангиогенез в заживающей ране: не перевести ее в хроническую или длительно незаживающую рану, с одной стороны, и эффективно предотвратить избыточный рост коллагена зреющего рубца, — с другой. По мере того как грануляционная ткань заполняет раневой дефект, она становится более плотной. Число микрососудов уменьшается, частично вновь образованные сосуды запустевают, уменьшается количество клеточных элементов: макрофагов, тучных клеток и фибробластов.

Третья фаза (фаза реорганизации), представляет собой завершающий этап раневого процесса, который выражается в формировании рубца. В ходе этой фазы фибробласты активно синтезируют сократительные белки и компоненты ВМК. Одним из ключевых процессов синтеза ВМК и, следовательно, рубцов, является трансформация фибробластов в ране взрослой особи в миофибробласты, чувствительные к химическим сигналам (цитокины, хемокины и факторы роста) [12]. Во время безрубцового заживления доля матриксных металлопротеиназ (ММП) выше, чем активность ингибиторов, в частности, тканевых ингибиторов металлопротеиназ. Это соотношение фермент—ингибитор способствует ремоделированию ВКМ с меньшим содержанием коллагена [13]. Хотя синтез коллагена и ВКМ необходим для эффективного закрытия раны, его результатом может быть развитие фиброза и образование кожных рубцов [14].

Стадии формирования соединительнотканного рубца. Наиболее изученными и достоверными причинами образования патологических рубцов являются следующие [15, 16]:

1) длительное повышение интенсивности синтеза коллагена в ране часто наблюдается при послеоперационных процессах;

2) развитие гипертрофических рубцов обусловлено активными процессами ингибирования деградации цитоплазматического матрикса, ангиогенеза, пролиферации фибробластов, которые активно продуцируют коллаген, под действием факторов роста (TGF-β) [17];

3) повышение активности ингибиторов ММП, приводящее к образованию избытка коллагена и фибронектина;

4) супрессия белка p53, приводящая к нарушению апоптоза фибробластов, часто наблюдается в послеоперационных ранах.

Вызывают интерес работы по изучению раневого процесса и его связи с ангиогенезом и последующим рубцеванием. Так, Т.В. Шмакова и соавт. [18] описывают основные этапы заживления кожных ран млекопитающих и их особенности в случаях безрубцового или минимального заживления. В статье также приведен анализ процессов, сопровождающих процесс заживления ран, и описаны факторы, приводящие к минимизации выраженности рубца или его полному отсутствию.

Методы профилактики рубцевания. В настоящее время многие авторы стали уделять большое значение косметическому виду послеоперационных рубцов. Пациенты предъявляют высокие требования к оперирующему хирургу, который должен обеспечить как оптимальный результат операции, так и отсутствие следов ее проведения, т.е. видимого рубца.

Среди авторов публикаций, посвященных профилактике грубых патологических рубцов, можно выделить сторонников разных точек зрения:

1. Выбор области разреза (соответствие линий разреза линиям Лангера), сама хирургическая техника, выбор подходящего режущего инструмента, оптимальный гемостаз во время операции (применение коагуляторов), дренаж раны (удаление коагулированных тканей и крови) и точное сопоставление краев раны во время закрытия, а также их сшивание современными инертными синтетическими биополимерными нитями снижают интенсивность воспаления и, следовательно, минимизируют иммунный ответ. Все эти факторы влияют на течение раневого процесса, результатом которого является характер сформировавшегося рубца [19].

2. Ведение раневого процесса в послеоперационном периоде: заживление раны первичным натяжением, а также стремление к максимальному сведению краев служит одним из главных критериев профилактики патологических рубцов [20], в противном случае сформируется грубый широкий рубец. Для того чтобы этот критерий был соблюден, необходимо отсутствие натяжения краев раны, что является результатом как хирургической техники, так и профилактики послеоперационной отечности раны [21]. Кроме того, есть сторонники применения дополнительных методов локального расслабления мышц путем введения ботулотоксина типа A в планируемую зону разреза (с его последующей диффузией в подкожные мышцы и реализацией длительной химической миорелаксации) за 10—14 дней до операции [22], введения ботулотоксина типа A после наложения или снятия швов [23] профилактики локального воспалительного процесса с помощью применения современных противовоспалительных хирургических повязок, силиконовых пластырей и лекарственных средств [24].

3. Применение физических методов воздействия на раневой процесс, в частности, — низкоинтенсивная лазерная терапия раневого процесса как в фазу экссудации (7—10-е сутки), так и в фазы пролиферации (10—30-е сутки), в конце которой формируется непрочный нежный рубец, и реорганизации или созревания рубца (30—90-е сутки), завершающейся формированием прочного рубца. Сторонники такой точки зрения полагаются на биологический эффект сфокусированного света в определенных диапазонах на течение раневого процесса, а именно на усиление и ускорение регенерации, более ранние сроки завершения фазы экссудации и формирования грануляций. По наблюдениям некоторых из этих авторов, в результате такого воздействия формируется тонкий, косметически приемлемый рубец, который при гистологическом исследовании близок по своему строению с неизменной нормальной кожей.

Поскольку на физические методы воздействия на раневой процесс в настоящее время возлагаются большие надежды, нами проведен обзор литературы, в которой описаны исследования по ранозаживлению у лабораторных животных с помощью различных световых технологий, проводимые в 2017—2020 гг. за рубежом.

Аппаратные методы профилактики рубцевания. Luis Flavio Duraes Gomes Olivia и соавт. [25] проводили гистологическую оценку процесса заживления кожных ран в области спины у крыс между терапией витамином C, низкоинтенсивным лазерным излучением и их сочетанием. Животные были рандомизированы на четыре группы по 12 особей: 1-я группа — контрольная, получала в качестве лечения изотонический раствор хлорида натрия; 2-я группа получала местно аппликации витамина C; 3-я группа подвергалась воздействию лазерным излучением низкой интенсивности; 4-я группа — комбинацией этих двух методов. Настоящее исследование было направлено на проверку влияния сочетания низкоинтенсивной лазерной терапии (НИЛТ) с терапией витамином C на скорость заживления ран, поскольку оба метода состоят из терапевтических подходов, которые ранее использовались в процессе заживления ран. Предыдущие исследования показали, что и витамин C, и НИЛТ ускоряют и облегчают заживление ран [26—30]. Данное исследование показало, что через 3 дня концентрации коллагена III типа были выше у крыс, получавших комбинацию витамина C и низкоинтенсивного лазерного облучения, по сравнению с другими группами. Авторы исследования пришли к выводу, что полученные результаты указывают на эффективность всех видов лечения в отношении заживления кожных ран по сравнению с контрольной группой. При этом изолированное использование терапевтического лазера низкой интенсивности и его комбинированное использование с аппликациями витамина C приводит к наиболее благоприятным результатам, что указывает на перспективность дальнейшего применения данного метода в лечении кожных ран.

B. Zhao, и соавт. [31] разработали многофункциональную платформу (ТГ-NO-Б, где ТГ — тиолированный графен, NO — оксид азота, Б — борная кислота) с инфракрасным (ИК) лазером. Данная платформа предназначена для инициации фототермических реакций и высвобождения NO в целях синергического воздействия на грамотрицательные бактерии с множественной лекарственной устойчивостью и их биопленки. По мнению исследователей, фототермическая терапия (ФТТ) с использованием наноматериала, поглощающего энергию лазерного излучения в ближнем ИК-диапазоне, может считаться одной из наиболее перспективных стратегий борьбы с бактериальными инфекциями [29, 31]. При облучении NIR-лазером (лампа излучает свет в ИК-диапазоне с длиной волны до 1300 нм, глубоко прогревая дерму, стимулируя неоколлагеногенез) фототермический наноматериал преобразует световую энергию в тепло, локально повышая температуру, что может вызвать разрушение мембраны бактериальной клетки, денатурацию белка и диспергирование биопленок [32—36]. У ФТТ есть множество преимуществ, таких как глубокое проникновение в ткани, небольшое поглощение света и пространственно-временная управляемость [37], усиление кровоснабжения и противовоспалительный эффект [38], что важно для заживления ран. К настоящему времени исследованы различные типы фототермических наноматериалов для применения в антибактериальной терапии, включая наночастицы на основе углерода [39], наночастицы металлов [40, 41] и полимерные наночастицы [42], графен [43]. По результатам данного исследования оказалось, что подавление роста бактериальной флоры и разрушение биопленок происходит именно благодаря одновременному выделению NO и непосредственно фототермической реакции (ФТР) на графеновой матрице. В результате данного исследования авторы успешно разработали многофункциональную платформу (ТГ-NO-Б) для одновременного действия ФТТ и выделения NO, генерируемых одним источником света NIR. Разработанная антибактериальная система способна селективно воздействовать на участки ран, инфицированные грамотрицательными бактериями, за счет эффекта ковалентного связывания и демонстрирует заметное синергетическое химио-(NO) и фототермальное-(TG) терапевтическое воздействие на инфицированную рану и подкожный абсцесс, что приводит к эффективному уничтожению бактерий и биопленок, ускорению заживления ран и уменьшению повреждений окружающих здоровых тканей.

J. Cunha и соавт. [44] исследовали три протокола низкоуровневой лазерной терапии (НИЛТ) на GA-AL-AS-лазере в заживлении открытых ран у крыс. Животные были разделены на четыре группы по 15 особей в каждой: CTR (необлученные животные), LT1 (20 Дж/см², 660 нм, ежедневно), LT2 (16 Дж/см², 660 нм, ежедневно) и LT3 (20 Дж/см², 780 нм, ежедневно). Через 7, 14 и 21 день 5 животных в день выводили из эксперимента путем эвтаназии и проводили гистологическое исследование раны. НИЛТ во всех протоколах способствовала уменьшению воспаления, а синтез коллагена значительно усиливался (p<0,05). Авторы сделали вывод, что все протоколы индуцируют синтез коллагена, однако протокол LT2 (16 Дж/см², ежедневное применение) способствовал максимальному увеличению синтеза коллагена и его ускоренному созреванию, а также лучшей структуре созревающего рубца. Отмечаемый вид формирования фибрилл коллагена обеспечивает основу, через которую эндотелиальные клетки мигрируют, образуя сеть капилляров, обычно наблюдаемую в грануляционной ткани [45]. На 14 и 21-й дни расположение волокон коллагена было более рыхлым и параллельным на поверхности, но более плотным и переплетенным с базальной стороны, подобно исходной структуре нативной соединительной ткани дермы, поскольку структура коллагена в поверхностном сосочковом слое дермы менее плотная и имеет тенденцию к параллельному расположению, в отличие от более плотного и переплетенного коллагена в более глубоких ретикулярных слоях дермы [46]. Авторы считают, что эти данные подтверждают теорию о том, что НИЛТ играет важную биомодулирующую роль в динамике воспалительного ответа, активности фибробластов и синтеза коллагена. Авторы подчеркивают, что во всех протоколах НИЛТ уменьшает воспаление и значительно увеличивает синтез коллагена, и все используемые протоколы способствуют достоверным изменениям в динамике образования рубца.

В важном, на наш взгляд, для клинической практики исследовании J. Tatmatsu-Rocha и соавт. [47] проанализировано влияние опосредованной лазером и светодиодом (LED) фотобиомодуляции (ФБМ), на синтез и организацию коллагеновых волокон в эксцизионной ране при сахарном диабете (СД) у животных, а также корреляция с интенсивностью воспаления и митохондриальной динамикой (делением и слиянием). ФБМ используется для улучшения заживления ран, облегчения боли и улучшения работы мышц. Один из основных механизмов — стимуляция функции митохондрий, при которой красный или ближний инфракрасный свет поглощается цитохром-C-оксидазой. Известно, что при СД в организме наблюдается гипергликемия из-за недостатка инсулина. СД приводит к угнетению синтеза коллагена, может приводить к нарушению регуляции экспрессии VEGF. Низкие уровни VEGF в диабетических ранах нарушают ангиогенез при заживлении кожных ран. Целью этого исследования было изучение процесса синтеза коллагена в кожной ране у крыс с СД, получавших лечение либо с помощью импульсного лазера (904 нм), либо непрерывного светодиода (805 нм). В исследовании 20 крыс линии Вистар были рандомизированы на 4 группы по 5 животных. Группы: (SHAM) контрольная группа: рана (+); СД (–); лечение (–); (DC)-группа: рана (+); СД (+), лечение (–); (DLASER)-группа: СД (+); лечение импульсным лазером 904 нм (40 мВт, 9500 Гц, 1 мин, 2,4 Дж); (DLED)-группа: СД (+); лечение светодиодом непрерывной волны 850 нм (48 мВт, 22 с, 1,0 Дж). СД у крыс спровоцировали за 1 мес до начала исследования инъекцией стрептозотоцина (70 мг/кг). Лечение проводили ежедневно в течение 5 дней с последующей эвтаназией животных и получением материала для исследования. Результаты: синтез коллагеновых волокон в коже с наличием диабетических ран был увеличен в группе DLASER, в отличие от группы DLED. Усиление окислительного стресса при СД приводит к чрезмерному делению митохондрий, вызывая митохондриальные повреждения и в итоге повреждение и гибель клеток [48]. В более ранних исследованиях [49] обнаружено снижение экспрессии митофузина (MFN2) в тучных скелетных мышцах при СД 2-го типа. Предполагается, что дефицит MFN2 вызывает дисфункцию митохондрий, увеличивает продукцию H₂O₂ и окислительный стресс, в итоге вызывает инсулинорезистентность в печени и скелетных мышцах [50]. По результатам исследования авторы предположили, что существуют различия между механизмами воздействия на биологические процессы у лазерного и светодиодного излучателей в диабетических ранах, но в целом оба источника света оказывают положительное действие на раневой процесс при СД, а регуляция митохондриального гомеостаза может быть важным механизмом эффектов данного метода лечения при СД.

В Колледже ветеринарной медицины Государственного университета Миссисипи группой ученых проводилось исследование на собаках [51]: 12 собак были разделены на три группы: 3 собаки для формирования шкалы оценки рубцов, 5 собак без лечения лазером (К) и 4 собаки, получавшие лазерную терапию (Л). Большинство (67%) собак получали глюкокортикостериоды (ГКС) во время операции и в послеоперационном периоде: некоторым собакам из группы без лечения лазером (n=4) и собакам с лечением лазером (n=2) вводили ГКС. Согласно полученным результатам сочетание ГКС и лазеротерапии в дозе 8 Дж/см² ежедневно в течение 1-й недели после операции привело к улучшению результатов хирургического лечения у собак, перенесших открытые операции на спинном мозге. Согласно данным Всемирной ассоциации лазерной терапии для индуцирования клеточных изменений требуется энергия не менее 5—7 Дж/см², исходя из предположения о том, что это нижний предел терапевтических дозировок [52]. Авторы отметили, что у собак из группы К на 21-й день наблюдался широкий рубец и все еще имелся струп, отсутствовал рост шерсти в области разреза, но авторы не исключали, что в итоге рубцы в обеих группах могут выглядеть одинаково с течением времени. Это было неясно на момент завершения исследования, поскольку наблюдали за пациентами не дольше 21 дня. Авторами был сделан вывод, что хирургические разрезы в группе Л зажили быстрее и эстетичнее, благодаря фотобиомодуляции, индуцированной лазерной терапией с мощностью 8 Дж/см² ежедневно в течение 7 дней.

Заключение

Обзор опубликованных за последние 4 года (2017—2020 гг.) данных по аппаратным методам лечения различных ран у лабораторных животных сформировал общее представление о тенденциях и направлениях в хирургии ран. Согласно результатам исследований низкоэнергетические тепловые воздействия на раневой процесс обладают противовоспалительной, коллагенстимулирующей активностью, ускоряют процессы грануляции и эпителизации, улучшают регенерацию. Однако остается открытым вопрос о том, как эти методы влияют на конечный вид рубца, поскольку фаза реорганизации раны длится от 3 до 6 мес, а происходящие в это время процессы являются не менее значимыми, чем в первую и вторую фазы. Кроме того, отсутствуют исследования по оценке воздействия неодимового лазера на раневой процесс, что оставляет не вполне ясным влияние энергии данного лазера на процесс ангиогенеза в репарации и регенерации. В целом аппаратные методы лечения ран демонстрируют эффективность и представляются перспективными для внедрения в клиническую практику. Однако для более глубокого изучения влияния лазерных технологий на процесс заживления ран необходимы исследования воздействия неодимового лазера на раневой процесс у лабораторных животных.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Э.Н. Праздников, Ф.А. Фархат, З.А. Евсюкова

Сбор и обработка материала — Ф.А. Фархат, З.А. Евсюкова

Статистическая обработка — Ф.А. Фархат, З.А. Евсюкова

Написание текста — З.А. Евсюкова

Редактирование — Э.Н. Праздников, Ф.А. Фархат

Participation of authors:

Concept and design of the study — E.N. Prazdnikov, F.A. Farhat, Z.A. Evsyukova

Data collection and processing — F.A. Farhat, Z.A. Evsyukova

Statistical processing of the data — F.A. Farhat, Z.A. Evsyukova

Text writing — Z.A. Evsyukova

Editing — E.N. Prazdnikov, F.A. Farhat

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The author declares no conflicts of interest.