PLGA-наночастицы как средство доставки противоопухолевых средств

Эффективность противоопухолевого лекарственного средства обусловлена не только его фармакокинетическими параметрами, но прежде всего биодоступностью в целевом месте действия, которая определяется в значительной степени способом его доставки [1]. Соответственно, одной из основных проблем в создании противоопухолевых препаратов, которая стоит перед фармацевтами, является создание лекарственных форм, которые способны преодолеть внутритканевые и внутриклеточные барьеры, затрудняющие эффективное достижение препаратами конечной цели — опухолевой клетки и снижающие эффективность ее поражения. Создание систем доставки лекарственных средств, которые обладали бы способностью проникать в опухолевую ткань и избирательно повреждать различные типы опухолевых клеток, тем самым увеличивая эффективность лечения, является важной задачей современной фармацевтики [2, 3]. Однако объективные причины — высокое давление интерстициальной жидкости и внеклеточные элементы матрицы, препятствующие проникновению противоопухолевых препаратов в ткань солидных опухолей, существенно затрудняют решение этой задачи [4].

Одним из способов увеличить накопление лекарственных средств в опухолевой клетке является создание наноразмерных систем доставки, которые обладают необходимыми поверхностными свойствами. Иными словами, создание комплексных препаратов, система доставки которых увеличивает их водорастворимость, стабильность и обеспечивает контроль выхода в клетку, — один из подходов к повышению эффективности лечения [5—7].

В настоящее время полимерные наночастицы субмикронного размера приобрели широкое распространение как системы доставки лекарственных средств, в том числе противоопухолевых. Наиболее часто в качестве фармацевтических полимеров используют хитозан, полимолочную кислоту и поли-1-капролактон.

В последние годы одно из ведущих мест среди полимерных систем для направленной доставки противоопухолевых препаратов заняли наночастицы на основе полимолочно-гликолевой кислоты (PLGA — сополимера молочной кислоты (LA) и гликолевой кислоты (GA)). PLGA одобрена FDA в качестве носителя в фармацевтике, пригодного для клинического и биологического применения благодаря слабо выраженной токсичности и иммуногенности в сочетании с хорошей биосовместимостью и высокой биодеградируемостью [8—10].

Как синтетический полимер PLGA является одним из наиболее широко применимых носителей для доставки белков, пептидов, бактериальной или вирусной ДНК и большого количества противоопухолевых препаратов (65% носителей) [11].

PLGA-наночастицы получают различными методами, среди которых наиболее активно используют две основные группы методов [12]. Первая включает диспергирование предварительно полученных полимеров с последующим удалением растворителя, вторая — полимеризацию мономеров.

Обычно PLGA получают методом катализируемой сополимеризации молочной и гликолевой кислот с раскрытием кольца [13]. Полигликолид PGA (poliglycolide) является простейшим полиэфиром — гидрофильным кристаллическим полимером с высокой температурой плавления (~300 °C), быстро деградирующим при физиологических условиях.

Молочная кислота образует бесцветные кристаллы, гигроскопична, легко образует циклический димер лактид, который существует в виде оптически активных L- и D-форм и неактивного рацемата. Может полимеризоваться с образованием высокомолекулярных полимеров (polylactide — PLA).

Как сополимер обоих этих мономеров PLGA наследует свойства этих мономеров, вследствие чего скорость его деградации и соответственно способность обеспечить выход лекарственного средства существенно зависят от соотношения LA/GA и молекулярной массы [14]. Физико-химические свойства PLGA могут быть легко изменены путем варьирования соотношения молочной и гликолевой кислот, молекулярной массы, концентрации и концевых групп [15, 16]. Чем больше соотношение между лактидом и гликолидом, тем более гидрофобным будет PLGA-полимер. В результате получаются микросферы с изменяющимися свойствами — различной способностью к инкапсулированию и кинетикой выхода лекарственного средства. Показано, что при соотношении молочной (LA) и гликолевой (GA) кислот 1:1 полимер имеет наиболее кристаллическую структуру и наивысшую гидрофильность, что способствует более легкому проникновению воды в полимерную матрицу. PLGA-полимеры с высокой молекулярной массой способны быстрее деградировать вследствие более высокой структурной организации.

В свою очередь молекулярная масса, скорость деградации и кинетика выхода препарата коррелируют с размером полученных наночастиц. Это принципиальный фактор терапевтического действия PLGA-наночастиц. Меньший размер играет важную роль в обеспечении способности наночастиц преодолевать биологические барьеры и достигать мишени — опухолевой ткани [17]. Однако частицы большего размера способны сорбировать большее количество препарата, что тоже важно с точки зрения терапевтического эффекта.

Интересно, что терапевтические свойства PLGA-наночастиц, нагруженных лекарственным препаратом, зависят не только от размера наночастиц, но и от их формы. Были синтезированы наночастицы цилиндрической формы, а также в виде стержней и игл. Сравнение различных свойств наночастиц в этих формах со свойствами наиболее употребимой сфероидной формы (захват клетками, интернализация, биораспределение и время полужизни в крови) показало, что наночастицы в изученных формах обладают различной способностью к сорбции и высвобождению лекарственных препаратов, проникновению в клетки, индукции апоптоза [8, 18].

Сказанное выше обусловливает необходимость выбора подходящего метода синтеза PLGA-наночастиц, нагруженных препаратом, поскольку физико-химические свойства продуктов, полученных различными способами, варьируют по указанным параметрам.

Наиболее широко применяется метод эмульгирования-выпаривания растворителя. Метод включает смешивание лекарственного средства с PLGA в органическом растворителе (например, в дихлорметане), затем полученная смесь тщательно гомогенизируется в водном растворе сурфактанта (например, в 1% поливинилацетате) с использованием высокоскоростного или ультразвукового гомогенизатора до получения однородной эмульсии типа масло в воде (м/в) [19, 20]. Для получения твердых PLGA-наночастиц органический растворитель выпаривается либо при сниженном давлении, либо путем умеренного перемешивания (при использовании летучего растворителя). Затем остатки растворителя и стабилизатора сурфактанта тщательно отмываются дистиллированной водой. Размер наночастиц, их распределение по размеру, а также поверхностный заряд определяют, используя методы динамического светорассеяния и анализ зета-потенциала.

Помимо метода эмульгирования-выпаривания растворителя, существует ряд методов, также используемых в последние годы для получения PLGA-наночастиц с лекарственным препаратом.

Метод нанопреципитации применяют при необходимости контроля размера наночастиц. Особенно он полезен при включении гидрофобных препаратов. PLGA растворяют в органическом растворителе, который смешивают с водой (например, в ацетоне), и по каплям добавляют к водной фазе, в результате чего быстро образуются наночастицы [21, 22]. Целенаправленное в зависимости от природы и свойств препарата введение добавок (солей или масляных растворов) или изменение pH среды приводят к увеличению эффективности инкапсулирования препарата [23].

Метод высаливания отличает отсутствие в методике высокоэнергетической эмульсификации. Для индукции разделения фаз используют насыщение электролитами или неэлектролитами водной фазы. Этот метод обусловливает благоприятные условия инкапсулирования соединений, которые чувствительны к повышению температуры [24].

Метод высушивания при распылении легко масштабируется. PLGA и препарат растворяют в растворителе, способном испаряться. Этот способ получения нагруженных наночастиц может быть использован при масштабировании производства, однако высушивание происходит при повышенной температуре, поэтому он не подходит для термолабильных лекарственных средств [25].

В микрофлюидных системах малые объемы жидкостей обрабатываются с большей эффективностью, чем в конвенциональных системах. Микрофлюидные системы подразделяются на два основных типа в зависимости от типа потока реагентов: 1) непрерывно-фазового и 2) сегментированного/капельного. Для получения наноразмерных PLGA-частиц используют непрерывно-фазовый поток, а частицы, получаемые при сегментированном потоке, как правило, по размеру находятся в микронном диапазоне [26].

PLGA-наночастицы, получаемые в микрофлюидных системах, обладают определенными преимуществами: узким диапазоном распределения по размеру, точно контролируемым процессом синтеза по времени и температуре и устойчивой воспроизводимостью от партии к партии [27]. Более того, эти частицы обладают компактной структурой, которая препятствует взрывному неконтролируемому выходу препарата. Показано, что этот способ получения нагруженных препаратом PLGA-наночастиц особенно подходит для включения чувствительных, легко повреждаемых биомолекул [28].

Одним из наиболее современных методов, используемых для получения PLGA-наночастиц с включением препарата, является Supercritical Fluid Technology [29, 30]. Его преимущество — использование CO₂ и воды вместо органических растворителей и возможность получения наночастиц без сурфактантов и повышенной температуры.

Поскольку свойства наночастиц, такие как размер, форма, деформируемость, состояние поверхности, играют важную роль в эффективности доставки лекарственного средства и его выхода в клетке из наноносителя, в последнее 10-летие был разработан метод PRINT (Particle Replication in Non-wetting Templates), в котором используются формы из перфторполиэфира для получения наночастиц с настраиваемой геометрией и составом. Эта технология является единственной в мире, соответствующей требованиям GMP получения наночастиц с точно заданным размером, формой и составом [31, 32].

Поверхность PLGA-наночастиц является гидрофобной, поэтому, чтобы избежать быстрой элиминации частиц ретикулоэндотелиальной системой, необходимые свойства ей придают путем включения сополимера. Наиболее часто в качестве сополимера используют полиэтиленгликоль (PEG), учитывая его биосовместимость и способность легко сорбироваться на поверхности PLGA-наночастиц [6, 32, 33]. Пэгилирование увеличивает гидрофильность и стабильность частиц, пролонгирует их системную циркуляцию и, более того, снижает иммуногенность частиц путем экранирования антигенных сайтов.

В систематическом обзоре исследований in vitro, проведенном C. Sandoval-Vásquez и соавт. [33], выявлено, что полимерные PEG-PLGA-наночастицы могу служить эффективными системами направленной доставки противоопухолевых препаратов в моделях рака молочной железы. Эти частицы, оптимизированные по размеру 150–250 нм, дзета-потенциалу примерно от -25 до -35 мВ и эффективности инкапсулирования ЭИ>75%, демонстрируют существенно большую эффективность по сравнению со свободными формами лекарственных препаратов, включая захват клетками, их пролонгированное выведение, повышенный цитотоксический эффект и модулирование сигнальных путей апоптоза. Включение таргетированных лигандов, таких, например, как фолиевая кислота, способно еще более увеличить терапевтическую селективность.

Использование PLGA-наночастиц, в том числе PEG-PLGA-наночастиц, позволяет в значительной степени преодолеть недостатки традиционной химиотерапии — развитие химиорезистентности и поражение нормальных клеток, что важно для прецизионной (персонализированной) медицины — современного подхода в здравоохранении, в частности, в онкологии [33].

Традиционная противоопухолевая терапия, как правило, включает системное введение препаратов или их пероральный прием. Оба способа приводят к существенному поступлению препаратов в здоровые ткани. В результате происходит их повреждение, развитие выраженных побочных реакций, что ограничивает допустимые для введения дозы и снижает эффективность терапии.

Таргетирование лекарственных препаратов способствует преодолению этого ограничения, поэтому в настоящее время большое внимание в фармацевтике уделяется разработке стратегий таргетной доставки противоопухолевых препаратов к мишени — опухолевой клетке, в частности, с использованием наноразмерных лекарственных форм и двух различных подходов к таргетированию –пассивного и активного.

Пассивная аккумуляция наноформ препаратов в опухоли происходит прежде всего вследствие эффекта повышенной проницаемости и удержания (EPR). Патофизиологическим фактором, способствующим повышенному накоплению наноразмерных частиц в опухоли, является наличие в ней легко проницаемой сосудистой сети в сочетании с отсутствием функционально активного лимфатического дренажа. PLGA-наночастицы благодаря высокой стабильности и способности длительно циркулировать в кровотоке оказались идельными для их использования в подходе пассивного таргетирования [34]. Эта стратегия пассивного таргетирования была применена для PLGA-наночастиц, нагруженных доксорубицином, паклитакселом, цисплатином и другими препаратами с целью увеличения их противоопухолевой активности, пролонгации времени циркуляции в организме, увеличения стабильности препаратов в результате их защиты от компонентов крови. Действительно, исследования показали, что время циркуляции наночастиц, особенно пэгилированных, с препаратами увеличилось и параллельно снизилась интенсивность побочных эффектов [8].

Однако пассивное таргетирование может быть в ряде случаев малоэффективным за счет гетерогенной васкуляризации опухоли, лимитированной проницаемости сосудов и существенного увеличения интерстициального давления жидкости [35, 36]. Исследования последних лет показали, что EPR-эффект изменяется в динамике, вариабелен относительно различных участков опухоли и в значительной степени варьирует у различных больных. Выявлено, что существуют иные пути проникновения наночастиц в опухоль за счет активного трансцитоза и включения в процесс иммунных клеток крови [36, 37]. Надо отметить, что эти пути тоже значительно варьируют у больных даже с одинаковым типом опухоли. Например, известно, что инфильтрация опухолей иммунными клетками значительно различается у больных [38]. Эндотелиальные клетки, способные к трансцитозу наночастиц, также расположены неравномерно в опухолевых сосудах [39].

Таким образом, оценка вклада различных механизмов транспорта наночастиц в опухоль играет важную роль в возможности предсказания ответа опухоли на различные терапевтические воздействия.

Выявление новых путей при пассивном таргетировании PLGA-наночастиц актуализировало вопрос о необходимости модификации поверхности наночастиц, например, полиэтиленгликолем. Однако покрытие поверхности наночастиц может существенно изменить их взаимодействие с эндотелиальными клетками, нейтрофилами, моноцитами крови, потенциально лимитируя активный транспорт наночастиц в опухоль. В последнее время показано, что увеличение времени их циркуляции может быть достигнуто и без нанесения покрытия, а просто с помощью введения бòльшей дозы наночастиц [40]. Надо также учитывать, что для пассивного таргетирования как с учетом концепции EPR-эффекта, так и клатрин- или кавеолин-опосредованного трансцитоза малый размер наночастиц (менее 100 нм) предпочтительнее из-за малого размера эндовезикул. Однако наночастицы большего размера могут более эффективно располагаться около опухолевых сосудов и лучше взаимодействовать с иммунными клетками крови, которые способствуют их распределению за счет хемотаксиса. Поэтому важно изучать физико-химические свойства наночастиц (размер, форму, жесткость, функциональные параметры), чтобы прогнозировать эффективность различных механизмов доставки их в опухоль.

Для увеличения специфичности наночастиц в отношении мишени и увеличения их захвата клетками используют модификацию поверхности PLGA-наночастиц присоединением к ней специфических лигандов, которые способны связаться с рецепторами или антигенами на опухолевых клетках, на клетках микроокружения или опухолевой сосудистой сети [41, 42]. Для связывания с PLGA-наночастицами использовали лиганды различной природы: антитела, пептиды, аптамеры, биотин, фолиевую кислоту и другие, которые способствуют проникновению носителя в клетку за счет рецептор-опосредованного эндоцитоза [43, 44]. Связывание лигандов с поверхностью наночастиц может быть обусловлено различными процессами: адсорбцией, конъюгированием или взаимодействием с компонентом носителя еще до образования наночастиц.

Надо сказать, что все использованные виды лигандов имеют свои достоинства и недостатки.

Моноклональные антитела могут с высокой специфичностью и аффинностью связываться с рецепторами на клеточной поверхности, поскольку имеют комплементарные участки, которые определяют это связывание. Однако они являются крупными молекулами, что создает опасность иммуногенности и ограничение по их плотности распределения на поверхности частиц по сравнению с другими лигандами.

Пептиды имеют меньший размер и неиммуногенны, но они менее специфичны. Аптамеры — небольшие фрагменты нуклеиновых кислот, которые могут быть сконструированы таким образом, чтобы специфически связываться с биологическими мишенями. Они неиммуногенны и нетоксичны, однако их синтез весьма сложен. Отрицательным моментом в использовании пептидов и аптамеров, несмотря на их преимущества в таргетировании in vivo, является их подверженность разрушению эндогенными ферментами организма.

Полисахариды биосовместимы и могут быть использованы как структурные компоненты наноносителей, способные взаимодействовать с рецепторами клеточной поверхности, тропными к углеводам. Однако некоторые полисахариды плохо растворимы, и модификация ими может вызвать токсичность наночастиц [45].

Малые молекулы образуют класс лигандов, который включает синтетические соединения, сконструированные для взаимодействия с определенными доменами рецепторов на клеточной поверхности. Обычно они отбираются по наиболее доступному методу синтеза, но часто обладают низкой специфичностью к опухолевым клеткам, а в ряде случаев рецепторные мишени находятся и на нормальных клетках, что обусловливает нежелательное связывание.

В целом можно отметить, что хотя стратегии активного таргетирования открывают пути для специфической доставки лекарственных средств к клеткам-мишеням, эта проблема еще не решена. Существует много вопросов, например, доступность рецепторов на опухолевых клетках, экспрессия которых может меняться в зависимости от фазы развития опухоли, или связывание с клетками, которые не являются целевыми, вероятность повышенной иммуногенности и токсичности модифицированных PLGA-наночастиц [46].

Активное конструирование и изучение физико-химических и биологических свойств наноносителей противоопухолевых препаратов на основе PLGA-полимеров привели к открытию первого клинического испытания I фазы BIND-014 для оценки безопасности, фармакокинетики и противоопухолевой активности оригинального препарата, направленного против простатспецифического мембранного антигена (PSMA) с включенным в него доцетакселом [47, 48]. В исследовании принимали участие больные с распространенными опухолевыми процессами: уротелиальной карциномой, холангиокарциномой, раком шейки матки и плоскоклеточным раком головы и шеи. Участники исследования были разделены на две группы, схемы лечения в которых различались. Больные одной группы (28 человек) получали лечение 1 раз в 3 нед, диапазон доз у них составил 3,5—75 мг/м²; у больных другой группы (27 человек) лечение проводили еженедельно с диапазоном доз от 15 до 45 мг/м².

Исследование показало, что в целом препарат хорошо переносился и не имел непредвиденных токсических реакций. Наиболее часто в качестве побочных реакций на введение препарата в обеих схемах у больных (более 20% больных) были отмечены нейтропения, слабость, анемия, алопеция и диарея. BIND-014 продемонстрировал прямую дозозависимость при изучении фармакокинетического профиля, который отличался от такового у доцетаксела, а также длительную циркуляцию наночастиц с доцетакселом. Из 52 больных, доступных для анализа, у 1 больной раком шейки матки, получавшей еженедельное лечение, наблюдался полный ответ, и у 5 больных солидными опухолями различного гистогенеза отмечен частичный ответ, который не зависел от экспрессии PSMA в опухоли.

В результате для II фазы исследований BIND-014 были рекомендованы дозы: 60 мг/м² при схеме 1 раз в 3 нед, или 40 мг/м² еженедельно.

На основании этих результатов была начата II фаза клинических испытаний, однако ввиду низкой эффективности терапии исследование было прекращено.

Несмотря на то что в течение последнего 10-летия PLGA-наночастицы, нагруженные различными химиопрепаратами, были испытаны и одобрены FDA для лечения нескольких форм рака [8] (PLGA микросферы Lupron Depot^® (Abbvie Endocrine Inc.) и Treslar^® (Allergan Sales Inc.)), клиническое применение они к настоящему времени не получили.

Поскольку препараты вышли из-под патентов по окончании их действия, FDA разработало программу исследований дженериков, которые должны проходить все исследования в соответствии с регуляторными правилами [49].

В соответствии с этой программой исследования должны включать:

1) характеристику PLGA-полимеров аналитическими методами;

2) оценку влияния характеристик PLGA и условий его получения на его действие;

3) исследование выхода химиопрепарата из наноносителя в системе in vitro;

4) оценку корреляции свойств лекарственных средств на основе PLGA в системах in vitro и in vivo;

5) моделирование инструментов для создания лекарственных форм и изучения биоэквивалентности препаратов, основанных на PLGA.

С учетом требований этой программы в настоящее время продолжаются активные исследования в модельных системах in vitro и in vivo по разработке химиотерапевтических средств, инкапсулированных в наноносители.

Необходимо отметить, что конвенциональная терапия сегодня строится, как правило, не на индивидуальных препаратах, а на их комбинациях, поскольку при сочетанном применении проявляется синергизм действия лекарственных средств различных классов. Вследствие своей вариабельности по размеру и другим параметрам PLGA-наноносители представляют надежную и удобную платформу для инкапсулирования комбинаций препаратов, различающихся по следующим свойствам — гидрофобность, фармакинетический профиль, механизм действия, и обеспечивают одновременное поступление препаратов в целевой сайт [50−53]. Более того, такой подход способствует замедлению развития лекарственной устойчивости [54].

Помимо твердых PLGA-наноносителей, разрабатываются и другие лекарственные наноформы — гели (например, Eligard^®, Tomar Therap) и импланты, получаемые с использованием технологий Atrigel^®, BEPO^® или FluidCrystal^® [55—57].

Образование in situ имплантов (ISFIs — in situ-forming implants) на основе PLGA — перспективная технология, разрабатываемая в последние годы. Она способна обеспечить минимально инвазивное парентеральное введение раствора полимера с лекарственным средством в область поражения, где происходит образование геля под действием окружающей среды (технология Atrigel^®). Таким образом, создается структура, которая служит резервуаром терапевтического средства, из которого оно постепенно выходит. Скорость выхода зависит от физико-химических свойств геля и самого препарата [58].

ISFIs — малоинвазивные средства, которые могут соответствовать по форме любой мишени — ткани, органу или полости, что делает их пригодными для введения в трудно достижимые анатомические области. Препарат Eligard^®, получаемый по этой технологии, предназначен для лечения распространенного рака предстательной железы. При производстве Eligard^® используют различные соотношения сополимеров (LA и GA) в PLGA в зависимости от дозировки действующего вещества леупролида ацетата — 50:50 при 7,5 мг; 75:25 при 22,5 и 30 мг; 85:15 при 45 мг. При получении лекарственной формы для введения содержание PLGA составляет 45−50% по весу и N-метил-2-пирролидона — 50—55%, леупролид ацетат составляет примерно 2−4% по весу от общего количества препарата в зависимости от дозировки [57].

К сожалению, трансляции в клинику ISFIs на основе PLGA препятствуют сложность лекарственной формы, чувствительность ее к вариабельности окружающей среды, а также невысокая точность предсказания количества и скорости выхода лекарственного препарата из созданного депо особенно в начале формирования импланта.

PLGA-полимер и полимеры, образованные составляющими его компонентами LA и GA, интенсивно изучались как нанотерапевтические платформы для включения лекарственных препаратов различных классов.

Доклинические исследования как с использованием культивируемых клеток в системе in vitro, так и в модельных экспериментах на животных в системе in vivo свидетельствовали о наличии преимуществ при введении лекарственных средств, инкапсулированных в наноносители, по сравнению с введением чистых препаратов, что обусловливало представление об их высоком потенциале для трансляции в клинику.

Однако поскольку выявлено, что эффективность пассивного таргетирования, которое рассматривали как основной способ аккумуляции препарата в целевых клетках, сугубо индивидуальна из-за вариабельности EPR-эффекта, необходимо ориентироваться в бóльшей степени на активное таргетирование, создавая для него условия при синтезе наноносителя путем соответствующей функционализации поверхности наночастиц специфическими лигандами, распознающими рецепторы на опухолевых клетках и благодаря этому целенаправленно доставляющими противоопухолевое средство к опухоли.

Но при изучении всех процессов получения и применения PLGA-наночастиц возникло много взаимосвязанных вопросов, включая некоторые несоответствия в производстве, затруднявшие оценку продукта в соответствии с регуляторными требованиями.

В итоге, в настоящее время исследования временно вернулись к экспериментам и производственным доработкам, поскольку клинические испытания не выявили преимуществ PLGA-наноносителей для применения в клинике.

Таким образом, чтобы вплотную подойти к трансляции наноносителей, нагруженных противоопухолевыми препаратами, в клинику, необходимы дальнейшие исследования в области создания оптимального дизайна PLGA-наночастиц и проведение доклинических исследований для оценки физико-химических и биологических характеристик полученных лекарственных средств.

Исследование выполнено в рамках договора №0373100122126000046 на выполнение НИР с Федеральным государственным бюджетным учреждением «Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью» Федерального медико-биологического агентства (ФГБУ «ЦСП» ФМБА России).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.