Метастатический плеврит (МП) представляет одну из ведущих причин плеврального выпота, занимая до 25% среди всех этиологических факторов [1—4]. К МП наиболее часто приводят рак легкого, молочной железы, яичников и лимфопролиферативные заболевания[5—7]. Метастатическое поражение плевры сопровождается патологическим накоплением жидкости в 55—60% наблюдений, что предопределяет худший прогноз для продолжительности жизни по сравнению с метастатическим поражением плевры без выпота [1, 3, 4, 8, 9]. Сегодня предложено большое количество методов лечения злокачественного плеврита, однако согласно опросу членов Европейского общества торакальных хирургов (ESTS) в 2018 г. клиническими рекомендациями по лечению МП руководствуются менее 50% респондентов, что свидетельствует об отсутствии универсальной технологии, удовлетворяющей потребностям специалистов [1].

Поиск оптимального метода лечения МП сохраняет актуальность. В 2022 г. предложен метод облитерации плевральной полости порошком никелида титана, обладающим потенциальными преимуществами перед альтернативными методами плевродеза, включающими плевродез медицинским тальком [10, 11]. В настоящей работе описана эффективность и безопасность облитерации плевральной полости порошком никелида титана на основании клеточных и тканевых реакций в эксперименте.

Цель исследования — оценить в эксперименте безопасность и эффективность облитерации плевральной полости порошком никелида титана с дисперсностью гранул от 20 до 160 мкм и медианой 80 (60, 100) мкм.

Материал и методы

Исследование выполнено в рамках гранта Московского центра инновационных технологий в здравоохранении (соглашение №2002-30/23).

В проведенных ранее исследованиях была определена оптимальная дисперсность порошка никелида титана для облитерации плевральной полости, при которой эффективность плевродеза была сопоставима с плевродезом медицинским тальком [10, 11].

На первом этапе оценили цитотоксичность порошка никелида титана с дисперсностью от 20 до 160 мкм и медианой 80 (60, 100) мкм в культуре фибробластов (ATCC, США) и эпителиоцитов человека (ATCC, США) после 24-часовой инкубации культур клеток в концентрациях 0,01, 0,1, 1, 10, 100 мг/мл. Учет морфологических изменений клеток или их лизиса проводили на инвертерном микроскопе Axiovert (Carl Zeiss, Германия). Оценку выживаемости клеток по уровню митохондриальной активности осуществляли с использованием МТТ-теста [12].

На втором этапе в экспериментальном исследовании провели сравнение эффективности плевродеза порошком никелидом титана с медицинским тальком на 12 половозрелых самках минипигов массой 18– 22 кг. Содержание и вывод животных из эксперимента проведены в соответствии с требованиями Директивы Европейского парламента и Совета Европейского союза 2010/63/EC от 22 сентября 2010 г. «О защите животных, использующихся для научных целей» [13].

Животные в исследовании были разделены на 2 группы по 6 минипигов. В 1-й группе (контрольная) плевродез выполняли медицинским тальком (Марка ТМО. ТУ 5727-003-46689024-2012); во 2-й группе для плевродеза использован порошок никелида титана с дисперсностью от 20 до 160 мкм и медианой 80 (60, 100) мкм (рис. 1). Объем экспериментальных групп сформирован исходя из принципа минимальной достаточности для оценки изучаемых явлений и получения репрезентативных данных.

Рис. 1. Микрофотограмма и график распределения размера частиц в порошке никелида титана.

Все операции выполнены на правой плевральной полости с использованием ветеринарного наркоза в условиях раздельной искусственной вентиляции легких. В плевральную полость устанавливали два троакара диаметром 10 мм по передней и средней аксилярной линии в пятом и седьмом межреберьях, после коллабирования легкого при помощи специально разработанного доставочного устройства под контролем зрения выполняли распыление порошка никелида титана или медицинского талька по всей поверхности висцеральной и париетальной плевры. Плевральную полость дренировали одним силиконовым дренажем через нижний троакарный доступ, который удаляли после ушивания троакарных вколов и контроля герметичности плевральной полости на операционном столе перед переводом животного на самостоятельное дыхание.

Животные из эксперимента были выведены на 7, 14, 21-е сутки после операции (по 2 животных из каждой группы) с оценкой изменений в оперированной и интактной (левой) плевральной полости во всех наблюдениях. Лабораторные показатели в клинических и биохимических анализах крови были исследованы накануне и после окончания операции, а также на 1, 3, 5, 7-е сутки после операции и в день вывода из эксперимента. Выраженность спаечного процесса оценивали макроскопически по 3-балльной шкале (предложенной Hurewitz и соавт.): 0 — отсутствие спаек, 1 — единичные рыхлые плевральные сращения, 2 — умеренно выраженный спаечный процесс, представленный рыхлыми и плотными соединительнотканными тяжами в разных отделах плевральной полости, 3 — выраженный спаечный процесс во всех отделах плевральной полости [14]. Также рассчитывали площадь спаек в процентном отношении к площади поверхности плевры. При морфометрии толщина висцеральной плевры на каждом препарате измерена минимум по 3 раза с расчетом медианы и межквартильного интервала. Также морфологическая оценка выраженности фиброза висцеральной и париетальной плевры проведена на основании шкалы Эшкрофта, дополненной методом микроскопического исследования с использованием гистохимической окраски трихром по Массону и иммуногистохимической окраски на Collagen IV типа [15, 16].

При сравнении количественных признаков проведен дисперсионный анализ для оценки нормальности распределения с последующим использованием ANOVA и применением функциональных возможностей критериев оценки множественных сравнений Ньюмена—Кейлса. При ненормальном распределении вариант применяли критерии Манна—Уитни, а также Краскела—Уоллиса.

Результаты

При 24-часовой инкубации культуры клеток фибробластов в присутствии порошка никелида титана, добавленного непосредственно в среду культивирования в концентрациях 0,01, 0,1, 1, 10, 100 мг/мл, лизиса клеток и изменения их цитоморфологии не наблюдалось. Балл оценки цитотоксичности соответствовал 0. При 24-часовой инкубации культуры эпителиоцитов человека в присутствии порошка никелида титана, добавленного непосредственно в среду культивирования в вышеупомянутом диапазоне концентраций, выживаемость клеток снижалась до 96% при концентрации 100 мкг/мл, что было статистически недостоверно (рис. 2).

Рис. 2. Выживаемость культур клеток при 24-часовой инкубации культуры клеток в присутствии порошка никелида титана.

а — фибробласты; б — эндотелиальные клетки.

Расчетная доза медицинского талька на одну процедуру плевродеза составила 4 г, что соответствует общепринятой дозировке в клинической практике и реализовано в зарубежных медицинских изделиях для плевродеза на основе талька. Масса порошка никелида титана была рассчитана исходя из объема, эквивалентного соответствующей дозе медицинского талька, необходимого для тотального покрытия плевральной полости крупного экспериментального животного, и составила 15 г на одну процедуру.

В 1-й группе на 7-е сутки эксперимента на макроскопической картине преобладал умеренно выраженный спаечный процесс, средний балл которого по шкале Hurewitz и соавт. составил 2,5±0,5, средняя арифметическая доли площади, занятой спайками,–63,33±4,33%. Воспалительные изменения сопровождались плевральным выпотом объемом 125±25мл, утолщением висцеральной плевры и выпадением фибрина. На 14-е сутки макроскопически также отмечено нарастание воспалительных изменений по сравнению с состоянием на 7-е сутки после операции, сопровождавшихся плевральным выпотом объемом до 300±50 мл, утолщением висцеральной плевры и увеличением количества фибрина. Средний балл спаечного процесса по шкале Hurewitz составил 2,5±0,5, средняя арифметическая доли площади, занятой спайками,– 73,00±7,09%. На 21-е сутки средний балл спаечного процесса по шкале Hurewitz был 3, средняя арифметическая доли площади, занятой спайками, –83,67±2,03%. Несмотря на выраженный спаечный процесс, отмечался реактивный плевральный выпот, объем которого 425± 75 мл (рис. 3).

Рис. 3. Вид плевральной полости на 21-е сутки после плевродеза медицинским тальком.

а — вид полости на стороне операции; б — контралатеральная контрольная полость.

Во 2-й группе на 7-е сутки спаечный процесс был умеренно выражен и представлен рыхлыми соединительнотканными тяжами с локализацией в разных отделах плевральной полости, средний балл по шкале Hurewitz составил 2,0±0,5, средняя арифметическая площади, занятой спайками, была равна 52,0±12,74%, объем плеврального выпота был 25±5 мл. На 14-е сутки спайки были распределены равномерно во всех отделах плевральной полости с полной облитерацией синусовых пространств. Средний балл по шкале Hurewitz составил 2,5±0,5, средняя арифметическая площади спаек –69,00±9,02%.Незначительные воспалительные изменения сопровождались плевральным выпотом объемом 35±5 мл. К 21-м суткам эксперимента средний балл по шкале Hurewitz составил 3,0±0,0, средняя арифметическая доли площади, занятой спайками, равнялась 87,33±2,40%. Макроскопически выявлено отсутствие признаков воспалительных изменений, объем плеврального выпота до 12,5±2,5 мл, висцеральная плевра на стороне операции утолщена (рис. 4).

Рис. 4. Вид плевральной полости на 21-е сутки после плевродеза мелкодисперсным порошком никелида титана.

а — спаечный процесс имеет тотальный характер, соединительнотканные спайки плотные, легкое выделяется с техническими трудностями, при этом травмируется; б — в области плевральных синусов тотальная облитерация листков плевры.

При оценке неоперированной контрольной плевральной полости у животных во всех исследуемых группах в контрольные сроки экспериментального исследования листки париетальной и висцеральной плевры макроскопически были не изменены, имели гладкую блестящую поверхность без спаек. Объем жидкости в плевральных полостях не превышал 4±1 мл.

При морфологическом исследовании висцеральной плевры на 7-е сутки после операции при окрашивании гематоксилином и эозином во всех группах отмечены явления склероза висцеральной и париетальной плевры с выраженной лимфогистиоцитарной инфильтрацией в 1-й группе и менее выраженными инфильтративными изменениями и ангиоматозом во 2-й группе. При окрашивании по Массону соединительнотканные волокна демонстрируют очаговое окрашивание в синий цвет, при окраске на Collagen IV коллагеновые волокна имеют очаговое окрашивание (до 25% от площади препарата). Степень фиброза по Эшкрофту в 1-й и 2-й группах составила 3 и 2 балла соответственно. При морфометрии и оценке толщины висцеральной плевры в 1-й и 2-й группах на 7-е сутки отмечена тенденция к большей выраженности фиброзных изменений в группе с мелкодисперсным никелидом титана, статистически значимых различий не установлено (p>0,05). Медиана толщины висцеральной плевры на 7-е сутки после плевродеза в 1-й и 2-й группах составила 157,4 (115,4, 213,3) и 244,1 (172,7, 301,6) мкм соответственно, что во всех наблюдениях было статистически значимо больше по сравнению с интактной плевральной полостью (p<0,05; критерий Манна—Уитни).

На 14-е сутки во всех группах на фоне сохранения равно выраженных явлений лимфогистиоцитарной инфильтрации отмечено большее утолщение висцеральной плевры, а также утолщение межальвеолярных перегородок в субплевральных отделах легкого. При окрашивании по Массону и на Collagen IV картина значимо не отличалась между группами и была идентичной таковой на 7-е сутки после операции.

На 21-е сутки после вывода животных из эксперимента в 1-й группе установлена морфологическая картина формирования фиброза висцеральной и париетальной плевры с незначительной лимфогистиоцитарной инфильтрацией, в группах с плевродезом порошком никелида титана лимфогистиоцитарная инфильтрация была также значительно менее выражена по сравнению с более ранними сроками наблюдения. При окрашивании по Массону соединительнотканные волокна окрашивались в синий цвет, коллагеновые волокна демонстрируют очаговое цитоплазматическое окрашивание на Collagen IV типа до 25% от площади препарата во всех группах. По шкале Эшкрофта степень фиброза висцеральной плевры на 21-е сутки после операции в 1-й и 2-й группах соответствовала 6-й и 4-й степени соответственно. В обеих группах висцеральная плевра была утолщена от 89,6 до 696,5 мкм в 1-й группе и от 116,8 до 292,6 мкм во 2-й с медианами 179,7 (105,9, 453,5) мкм и 245,3(185,6, 266,6) мкм соответственно. Толщина висцеральной плевры не имела статистически значимых различий между группами. В то же время при сравнении с толщиной плевры контрольной контралатеральной стороны во всех наблюдениях различия были статистически значимыми (рис. 5).

Рис. 5. Динамика толщины висцеральной плевры в сравнении с интактной плеврой.

а — порошок медицинского талька; б — мелкодисперсный порошок никелида титана.

При морфометрическом и морфологическом исследовании была прослежена динамика изменения толщины висцеральной плевры после плевродеза медицинским тальком в 1-й группе и порошком никелидом титана во 2-й группе. Так, на 7-е сутки отмечалось увеличение толщины висцеральной плевры во всех группах, и после пика на 14-е сутки плевра оставалась утолщенной на 21-е сутки после операции, что можно объяснить снижением выраженности локальных воспалительных реакций и формированием склеротических изменений.

При анализе лабораторных показателей отмечено увеличение лейкоцитов крови на 5—14-е сутки эксперимента во всех наблюдениях. Пиковые значения лейкоцитоза (максимально 34,4×10⁹/л) зарегистрированы на 5-е сутки в группе плевродеза медицинским тальком (1-я группа) и на 14-е сутки после операции в обеих группах без статистически значимых различий. В последующем намечена тенденция к снижению лейкоцитоза до значений, близким к исходным, что может отражать естественную динамику раневого процесса в плевральной полости. Пиковые значения уровня C-реактивного белка зарегистрированы на 5-е сутки после операции с последующим снижением к 21-м суткам эксперимента. Максимальное значение зарегистрировано во 2-й группе — 18 мг/л без статистически значимых различий между группами на всех сроках наблюдения (рис. 6).

Рис. 6. Динамика лабораторных показателей в исследуемых группах в зависимости от суток эксперимента.

а — уровень лейкоцитов крови; б — С-реактивный белок.

Обсуждение

Таким образом, в серии хронических лабораторных экспериментов плевродез порошком никелида титана с медианой дисперсности гранул 80 (60, 100) мкм показал свою эффективность, эквивалентную таковой при облитерации плевральной полости медицинским тальком. При оценке цитотоксичности доказана безопасность порошка никелида титана в культуре клеток эндотелиоцитов и фибробластов. Механизм действия предложенного метода плевродеза связан с полигональной микропористой структурой частиц никелида титана (см. рис. 1), обеспечивающих их адгезию к листкам плевры и в последующем прорастание в первую очередь соединительной тканью, что реализуется в формировании спаечного процесса между листками париетальной и висцеральной плевры. Биологическая инертность порошка никелида титана обеспечивает меньшую выраженность воспалительных реакций, характерных для плевродеза тальком.

Заключение

Разработанный метод плевродеза порошком никелидом титана эффективен и безопасен в эксперименте, сопоставим по эффективности облитерации плевральной полости с плевродезом медицинским тальком, вызывая при этом менее выраженные воспалительные и инфильтративные реакции со стороны висцеральной плевры. Дисперсность порошка никелида титана имеет значение и должна находиться в диапазоне не менее 20 мкм с предпочтительной медианой размера частиц в 80 мкм с целью повышения эффективности и безопасности плевродеза. Необходимы дальнейшие исследования для оценки эффективности предложенной технологии в клинической практике.

Участие авторов

Концепция и дизайн исследования – Есаков Ю.С., Блинова Е.В., Марченко Е.С, Галкин В.Н., Дыдыкин С.С.

Сбор и обработка материала – Ефтеев Л.А., Шимановский Д.Н., Шаталов В.Г., Вавилова О.С., Гюнтер С.В.

Статистическая обработка – Епишкина А.А., Ефтеев Л.А.

Написание текста – Ефтеев Л.А., Есаков Ю.С.

Редактирование — Блинова Е.В., Есаков Ю.С., Марченко Е.С.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.