B-клеточные лимфомы представляют собой гетерогенную категорию злокачественных новообразований, среди которых наиболее распространенной является диффузная B-крупноклеточная лимфома (ДВКЛ), характеризующаяся агрессивным течением [1]. Хотя большинство пациентов с ДВКЛ можно вылечить с помощью иммунохимиотерапии, примерно у 40% больных после первоначального лечения развиваются рефрактерность опухоли к терапии или ее рецидив [2]. Несмотря на то что некоторых пациентов в дальнейшем можно вылечить, используя химиотерапию 2-й линии, большинство из них умирают от основного заболевания. Примерно в 10—15% случаев наблюдается первичная рефрактерность, которая обычно определяется как неполный ответ или рецидив в течение 3—6 мес, при этом общая выживаемость (ОВ) составляет около 6 мес [3].

Разработка метода T-клеточной терапии с использованием химерных антигенных рецепторов (CAR) произвела революцию в лечении В-клеточных злокачественных опухолей [4, 5]. CAR — это сконструированные синтетические рецепторы, функция которых заключается в перенацеливании лимфоцитов, чаще всего T-клеток, на распознавание и уничтожение клеток, экспрессирующих определенный целевой антиген. Связывание CAR с целевыми антигенами, экспрессированными на поверхности клеток, происходит независимо от рецептора главного комплекса гистосовместимости, что приводит к активации T-клеток и мощному противоопухолевому ответу [6].

Благодаря беспрецедентной частоте и продолжительности ответов у пациентов с B-клеточной лимфомой высокого риска анти-CD19-CAR-T-клеточная терапия сегодня рассматривается в качестве наиболее перспективного метода лечения пациентов с рецидивной/рефрактерной агрессивной неходжскинской лимфомой [7]. Вместе с тем одной из проблем при проведении CAR-T-терапии является ее потенциальная токсичность, проявляющаяся в основном такими специфическими для данного вида лечения побочными эффектами, как синдром выброса цитокинов (СВЦ) и CAR-T-ассоциированная нейротоксичность.

Цель исследования — оценить эффективность и безопасность терапии локально изготовленными анти-CD19-CAR-T-клетками у пациентов, страдающих рецидивными/рефрактерными формами B-клеточных лимфом.

Материал и методы

В проспективное нерандомизированное исследование, одобренное комитетом по этике центра, включено 11 пациентов, получавших лечение с июня 2021 г. по январь 2023 г. в Государственном учреждении «Республиканский научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н. Александрова» (таблица).

Клиническая характеристика пациентов

Примечание. АутоТПСК — аутотрансплантация периферических стволовых клеток.

Наиболее распространенным морфологическим вариантом была ДВКЛ у 6 пациентов, у 2 диагностирована первичная медиастинальная B-крупноклеточная лимфома, 2 пациента страдали лимфомой Беркитта, еще 1 — фолликулярной лимфомой 3-го цитологического типа.

Все пациенты удовлетворяли критериям рефрактерного заболевания SCHOLAR-1 [3]: прогрессирование как наилучший ответ на любую линию терапии, стабилизация заболевания по крайней мере после 4 циклов терапии 1-й линии или 2 циклов терапии 2-й и последующих линий с длительностью не более 6 мес от момента последней дозы терапии или рецидив менее 12 мес после трансплантации аутологичных гемопоэтических периферических стволовых клеток.

Метод лечения включал три основных этапа: получение CAR-T-клеток; проведение кондиционирования (лимфодеплетирующая химиотерапия); введение CAR-T-клеток.

Селекция и экспансия T-клеток. В качестве исходного материала для получения первичной культуры T-клеток использовали продукт афереза реципиента. В последующем изоляцию популяций CD4+ и CD8+ T-клеток проводили раздельно методом иммуномагнитной селекции с использованием соответствующих наборов CD4/CD8 Positive Isolation Kit (Thermo Fisher scientific, Норвегия).

T-клетки инкубировали в полной среде RPMI 1640 (Thermo Fisher scientific, Бразилия) с добавлением рекомбинантных цитокинов интерлейкина (ИЛ)-7 и ИЛ-15 (Miltenyi Biotec GmbH, Германия) в конечной концентрации 10 нг/мл. Активацию T-клеток осуществляли с использованием иммуномагнитных частиц Dynabeads Human T-activator CD3/CD28 (Thermo Fisher scientific, Норвегия). Продолжительность экспансии клеточного продукта составила 13 сут, смену среды проводили по достижении плотности 2·10⁶ клеток/мл.

Генетическая модификация T-клеток. Рекомбинантные псевдотипированные лентивирусные частицы, предназначенные для трансдукции T-клеток, получали путем транзиторной котрансфекции клеточной линии 293T (ATCC CRL-3216) лентивирусной системой. Трансфер-вектор S4, полученный на основе плазмиды pWPXL (Addgene #12257), содержал бицистронную экспрессионную кассету, кодирующую последовательность CAR II поколения к белку CD19 человека, а также транкированного варианта белка EGFR человека, который позволяет идентифицировать T-клетки, несущие CAR, а также при необходимости их нейтрализовать с помощью моноклонального антитела цетуксимаб. В качестве пакующего вектора использовали плазмиду pCMV-dR8.91. Белок оболочки VSV-G кодировался вектором pMD2.G (Addgene #12259). Функциональный титр вирусных частиц определяли методом трансдукции клеток линии 293T серией последовательных разведений. В контроль безопасности вирусного супернатанта входили определение рекомбинантно-компетентных вирусных частиц (RCL) методом количественной полимеразной цепной реакции, микробиологический контроль. Трансдукцию T-клеток реципиента проводили в присутствии рекомбинантного фибронектина RetroNectin (Takara Bio, США). Множественность инфекции составила 5 TU/клетка.

Продолжительность процесса получения CAR T-клеточного продукта составляла 10—14 дней в зависимости от эффективности экспансии целевой популяции.

Режимы лимфодеплеции: циклофосфан 300—500 мг/м2 внутривенно капельно за 1 ч, в 1—3-й дни; флюдарабин 25—30 мг/м² внутривенно капельно за 30 мин, в 1—3-й дни.

Проведение трансфузии клеточного продукта. В настоящем исследовании введение аутологичного клеточного продукта осуществлялось непосредственно после завершении цикла производства. Клеточный продукт вводили в виде внутривенной инфузии со скоростью 10—20 мл в 1 мин. Введение осуществляли через систему для внутривенных инфузий, в составе материала, из которого она изготовлена, отсутствовал латекс, а в системе для инфузий — лейкоцитарный фильтр. Доза клеточного продукта составляла 2,0·10⁸ CAR-позитивных жизнеспособных клеток.

Конечными точками исследования являлись оценка токсичности, частоты объективного ответа (ЧОО), под которой понимали сумму полных и частичных метаболических ответов по данным контрольной позитронно-эмиссионной томографии с 2-дезокси-[18F]-фтор-глюкозой, совмещенной с компьютерной томографией (ФДГ-ПЭТ/КТ), и ОВ. Тяжесть СВЦ и нейротоксичности оценивали в соответствии с критериями консенсуса ASTCT (American Society for Transplantation and Cell Therapy) [8].

Результаты

Анти-CD19-CAR-T-клеточный продукт был получен для всех 11 пациентов, вошедших в исследование. Экспансия CAR-T-клеток после трансфузии продукта отмечалась также у всех 11 пациентов. Медиана пикового значения экспансии CAR-T-клеток в периферической крови составила 70,5 клеток/мкл (диапазон 2,65—433 клеток/мкл). Медиана пика приходилась на 14-й день.

При оценке результатов лечения медиана наблюдения составила 6,2 мес (диапазон 2—21 мес). Один пациент умер от осложнений до достижения клинического ответа. Еще один пациент умер через 4 мес после проведения терапии от прогрессирования заболевания. Следует отметить, что у этого пациента наблюдался неполный метаболический ответ по данным ФДГ-ПЭТ/КТ, а уровень экспрессии CD19 на опухолевых клетках изначально составлял 50%, что, вероятно, оказалось недостаточно для полной эрадикации опухоли.

ЧОО составила 100% (10/10), полная ремиссия достигнута у 9 пациентов, частичная — у 1. Медиана ОВ не достигнута, одногодичная ОВ составила 77,9±12%.

После введения клеточного продукта нейротоксичность III степени зарегистрирована у 1 (9,1%) пациента, II и IV степени тяжести не зафиксированы. У 3 (27,3%) пациентов развилась нейротоксичность I степени, проявлявшаяся тревогой, сонливостью и диплопией.

СВЦ III степени тяжести развился у 1 (9,1%) пациента, впоследствии скончавшегося от осложнений (у этого пациента была нейротоксичность III степени). СВЦ I степени (лихорадка 38°C и выше без гипоксии и гипотонии) отмечен у 2 (18,2%) пациентов.

Обсуждение

Результаты проведенного исследования демонстрируют высокую клиническую эффективность локально изготовленных анти-CD19-CAR-T-клеток II поколения у пациентов с рецидивными/рефрактерными B-клеточными лимфомами: ЧОО составила 100%, а одногодичная ОВ — более 70%. При этом следует отметить, что у умершего от осложнения терапии пациента по данным КТ грудной клетки, выполненной на 20-й день, наряду с двусторонней пневмонией определялась 50% регрессия опухолевой массы, а на аутопсии обнаружен некроз опухоли.

За последние 5 лет опубликованы результаты трех основных исследований по изучению эффективности CD19-таргетных CAR-T-клеток у пациентов с острым лимфобластным лейкозом и рецидивом B-клеточной лимфомы (исследования ZUMA-1, JULIET и TRANSCEND). Частота общего ответа в них варьировала от 52 до 74% с показателями выживаемости в течение 1 года от 48 до 59% [9—11].

Согласно полученным данным, частота тяжелых (III степени) CAR-T-ассоциированных нежелательных явлений составила 9,1% (1 случай из 11, приведший к летальному исходу). Следует отметить, что частота развития указанного вида токсичности в различных исследованиях сильно варьирует, но в целом сопоставима с нашими результатами. В частности, P. Sesques и соавт. [12] сообщили о результатах лечения 61 пациента, получавшего либо тисагенлеклейсел или аксикабтаген силолейсел и показали, что 8 и 10% пациентов перенесли соответственно СВЦ III степени тяжести и нейротоксичность соответственно.

Существенным фактором, ограничивающим широкую доступность CAR-T-клеточной терапии, является высокая стоимость этого метода. В среднем общая стоимость терапии коммерческим препаратом Тисагенлеклейсел (Новартис) при B-клеточной лимфоме составила 515 150 $, Аксикабтаген силолейсел (Кайт Фарма) — 503 955 $. Основными факторами, влияющими на общую стоимость лечения, были цены на препараты CAR-T-клеток, на сопроводительную терапию и купирование нежелательных явлений. Одним из путей, способствующих снижению цены на CAR-T-клеточную терапию — это производство CAR-T-клеток в лечебных учреждениях по месту оказания медицинской помощи (так называемые локально изготовленные CAR-T-клетки).

В Государственном учреждении «Республиканский научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н. Александрова» отработана технология мануального изготовления анти-CD19-CAR-T-лимфоцитов второго поколения. Характеристики пациентов, получивших CAR-T-терапию в нашем центре, сходны с данными других исследований реальной клинической практики [7, 8, 11, 13]. Полученные результаты обнадеживают, однако необходимы дополнительные исследования с включением большего количества пациентов и более длительный период наблюдения, чтобы лучше определить, какая подгруппа пациентов получит наибольшую пользу от CAR-T-терапии.

Заключение

Разработан метод лечения пациентов с рефрактерными и рецидивными формами CD19-позитивных B-клеточных лимфом с применением локально изготовленных аутологичных анти-CD19-CAR-T-клеток человека II поколения, полученных путем генетической модификации T-лимфоцитов методом лентивирусной трансдукции с дальнейшей экспансией в культуре ex vivo.

CAR-T-клеточная терапия характеризовалась невысокой частотой тяжелых нежелательных явлений, ассоциированных с CAR-T: СВЦ III степени тяжести составил 9,1%, I степени тяжести — 18,2%, нейротоксичность III степени — 9,1%, случаев нейротоксичности II и IV степени не наблюдалось. При этом частота объективного ответа на терапию составила 100%, медиана ОВ не достигнута, одногодичная ОВ составила 77,9±12%.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Н.Е. Конопля

Сбор и обработка материала — О.А. Каленик, Т.М. Дорошенко, И.Н. Северин, А.А. Саврицкая

Статистическая обработка — О.А. Каленик

Написание текста — Боброва Н.М., Портянко А.С., Т.М. Дорошенко

Редактирование — Н.Е. Конопля

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.