Рак предстательной железы (РПЖ) стабильно занимает лидирующие позиции в структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями у мужчин. В Российской Федерации в 2019 г. РПЖ выявлен у 45 763 мужчин, причем у 60,7% больных опухолевый процесс диагностирован на I—II стадии [1]. Основными методами радикального лечения РПЖ на стадии локализованного процесса являются радикальная простатэктомия с расширенной тазовой лимфаденэктомией (РПЭ с рТЛАЭ), брахитерапия, дистанционная лучевая терапия. Выбор метода лечения определяется клинической стадией заболевания и группой риска. Метастазирование в региональные лимфатические узлы (ЛУ) является неблагоприятным прогностическим признаком. Наличие метастазов в регионарных ЛУ оценивают с помощью методов лучевой диагностики (КТ, ПЭТ-КТ, мпМРТ и ПЭТ-МРТ), однако низкая чувствительность данных методов обследования (40—45%) не позволяет диагностировать лимфогенные метастазы с необходимой точностью [2, 4, 5]. Риск метастатического поражения ЛУ также может быть рассчитан с помощью номограмм (например, номограммы Briganti), которые учитывают предоперационный уровень ПСА, степень дифференцировки опухоли по шкале Gleason, стадию заболевания и количество положительных и отрицательных биоптатов [3]. Окончательный статус N+ или N– определяется хирургическим стадированием при рТЛАЭ. Согласно рекомендациям Ассоциации онкологов России, рТЛАЭ показана пациентам, у которых риск лимфогенного метастазирования превышает 5%. Однако рТЛАЭ увеличивает риск таких осложнений, как длительная послеоперационная лимфорея, напряженные лимфокисты, которые могут приводить к компрессии подвздошных вен и как следствие — к тромбозам и тромбоэмболиям.

Золотым стандартом определения метастатического поражения ЛУ на сегодняшний момент остается патоморфологическое исследование с окраской гематоксилином и эозином. В спорных случаях выполняется иммуногистохимическое исследование образцов с антителами к цитокератину или ПСА. Наиболее перспективной методикой обнаружения метастазов, совершенствующей диагностическую точность ТЛАЭ, является определение статуса сторожевого лимфатического узла (СЛУ). СЛУ — это первые лимфатические узлы на пути лимфооттока от первичной опухоли. Методика интраоперационного картирования лимфооттока от органа, пораженного опухолью с определением СЛУ предложена в 1990 г. D.L. Morton и соавт. [6] на примере меланомы кожи. С клинических позиций концепция СЛУ состоит в том, что статус СЛУ определяет состояние всего регионарного лимфатического бассейна органа, пораженного опухолью. Если СЛУ не поражены, то нет необходимости в выполнении лимфаденэктомии. Интраоперационное определение СЛУ возможно с помощью радиофармпрепарата (РФП). В СЛУ РФП накапливается в первую очередь и детектируется при помощи гамма-датчика [7]. В 1999 г. F. Wawroshek и соавт. [8] впервые опубликовали результаты исследования предоперационной лимфосцинтиграфии и интраоперационной диагностики СЛУ у 11 больных РПЖ. В 2003 г. опубликованы результаты работы, включающей 350 пациентов с РПЖ, в которой СЛУ, обнаруженные при помощи непрямой и прямой лимфосцинтиграфии, исследовали на наличие метастазов. Чувствительность, по данным автора [9], составила до 96%.

Методика определения СЛУ уже стала стандартной для опухолей наружных локализаций (меланома кожи, рак молочной железы, полового члена, рак головы и шеи), но при РПЖ она до настоящего времени не используется. В классическом протоколе процедуры вначале выделяется и подвергается срочному или плановому морфологическому исследованию СЛУ, а затем в случае их поражения выполняется повторное хирургическое вмешательство — расширенная лимфодиссекция, но повторные вмешательства (лимфодиссекции) при опухолях внутрибрюшной локализации не проводятся. Поэтому необходим метод для интраоперационной оценки статуса СЛУ, более быстрый и точный, чем срочное патоморфологическое исследование. Для этого рассматривались подходы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), однако длительность стандартной реакции не позволяет применять ее для интраоперационной оценки статуса ЛУ.

Подходы на основе ПЦР стали главными технологиями для большей части молекулярных диагностических тестов различных отраслей медицины, включая онкологию. Одной из первых попыток применить ПЦР для оценки СЛУ при РПЖ была работа J. Haas и соавт., опубликованная в 2005 г. Исследование проводилось на парафиновых блоках 133 СЛУ от 68 пациентов (с локализованным раком простаты промежуточного и высокого риска) с двумя опухолеспецифичными маркерами для ПЦР с обратной транскриптазой ОТ-ПЦР (РНК ПСА и простата специфическим мембран-антигеном (ПСМА) и маркером метастатической аденокарциномы — антителом к панцитокератину для ИГХ-исследования. В качестве группы контроля для ОТ-ПЦР были ЛУ от 6 пациентов с другим онкологическими заболеваниями, в которых экспрессии РНК ПСА и ПСМА не было.

Цель исследования — продемонстрировать ОТ-ПЦР в качестве метода оценки статуса СЛУ в дополнение к патоморфологическому и ИГХ исследованиям. Чувствительность ОТ-ПЦР по отношению к стандартному патоморфологическому исследованию составила 100%. Интересным этапом эксперимента является дополнительное включение 12 пациентов, у которых в ходе послеоперационного клинического наблюдения развился биохимический рецидив. Послеоперационный статус ЛУ у пациентов с биохимическим рецидивом по данным гистологического исследования был определен как pN0, однако оценка этих же парафиновых блоков ЛУ с помощью ОТ-ПЦР к РНК ПСА выявила 4 ЛУ pN+. В остальных 8 образцах экспрессии РНК ПСА не было выявлено [10]. Основным минусом ОТ-ПЦР является длительность реакции амплификации нуклеиновых кислот. Стандартно выполняется 25 циклов, которые занимают 2—3 ч, что делает невозможным применение ОТ-ПЦР для интраоперационной диагностики статуса СЛУ [10]. В 1990-х годах, помимо классической ПЦР, был разработан метод изотермической амплификации нуклеиновых кислот с использованием ДНК-полимераз от термофильных бактерий [11]. В 2000 г. Notomi и компания Eiken Chemical Corporation Ltd (Токио, Япония) предложили новый метод изотермической амплификации нуклеиновых кислот — метод петлевой изотермической амплификации нуклеиновых кислот LAMP (петлевая изотермическая амплификация) на примере амплификаций клонированной ДНК вируса гепатита В (HBV) и RT-LAMP (петлевая изотермическая амплификация с обратной транскрипцией) на примере определения мРНК ПСА в ЛУ РПЖ. Амплификация в изотермических условиях (65 °C) происходит при участии фермента BST-полимеразы, обладающий 5´3´ полимеразной, сильной 5´3´ вытесняющей и высокой ревертазной активностью, но не обладающим экзонуклеазной активностью [12]. В реакции используются 4 праймера, конструкция которых определяет начало реакции и последующую цикличность по типу «self-priming». В этом варианте LAMP распознавала 6 различных последовательностей ДНК. В процессе реакции образуются сложные структуры ампликонов, а уровень производительности реакции беспрецедентно высок — количество копий ДНК достигало 10⁹. В отличие от других изотермических методов LAMP практически нечувствительна к примесям, что делает невозможным репликации нецелевой последовательности ДНК. В качестве исходной матрицы может служить лизат образца ткани или биологическая жидкость, что позволяет сократить время реакции до 1 ч и получить возможность использования метода для интраоперационной диагностики [12, 13]. В 2005 г. Notomi и соавт. ускорили LAMP, добавив в реакцию два петлевых праймера (loop primers) на позиции между F2 и F1 (или B1 и B2) в направлении от F1 к F2 (или от B1 к B2). Это ускорило время реакции и сократило его до 15—30 мин, а также, по данным автора, увеличило чувствительность метода. Благодаря этому метод LAMP начал активно внедряться в молекулярно-генетическую диагностику.

В настоящее время в онкологической практике применяется методика RT-LAMP (метод петлевой изотермической амплификации нуклеиновых кислот с обратной транскриптазой) для интраоперационной детекции метастазов в СЛУ. Время теста составляет 15—30 мин [14, 15]. Данный метод получил коммерческое название «OSNA» (одноэтапная амплификация нуклеиновых кислот) и в настоящее время тестируется исследователями для интраоперационного определения статуса СЛУ при солидных опухолях различных локализаций. Основными характеристиками этого метода является высокая чувствительность и специфичность и, что немаловажно, дешевизна (не требуется дорогостоящее оборудование для термоциклирования). Скорость реакции позволяет оценить состояние СЛУ и принять решение о соответствующем объеме лимфодиссекции при РПЖ интраоперационно. Цитокератин 19 (ЦК19) — белок промежуточных филаментов, экспрессируется в эпителиальных клетках и соответственно в клетках аденокарцином и их метастазах [16]. В нормальном неметастатическом ЛУ экспрессия ЦК19 не определяется. Обнаружение ЦК 19 в ЛУ — признак присутствия в нем опухолевых клеток, причем определение количественной экспрессии может разделить поражение на микро- и макрометастаз.

В 2018 г. A. Winter и соавт. [17] опубликовано первое исследование, целью которого было определить экспрессию ЦК 19 в ткани РПЖ методом OSNA у пациентов с промежуточного и высокого риска прогрессирования. Во всех случаях РПЖ OSNA выявило экспрессию ЦК 19, хотя уровень экспрессии не имел прямой корреляции со стадией процесса, суммой баллов по Глисону и уровнем предоперационного ПСА. Также A. Winter и соавт. [18] применили метод OSNA для интраоперационной оценки статуса СЛУ. В работе продемонстрирована высокая чувствительность (93,3%) и специфичность (95,8%) OSNA для интраоперационной детекции метастазов в СЛУ, конкордантность составила 94,1%.

В 2021 г. опубликована научная работа группы авторов из Германии, которые оценили чувствительность и специфичность OSNA для выявления метастазов РПЖ в ЛУ. Чувствительность и специфичность составили 84,2 и 96,1% соответственно, конкордантность — 94,4%. В 24 из 534 ЛУ были выявлены микрометастазы РПЖ, из которых в 18 из 24 микрометастазы выявлены только методом OSNA, что говорит о его большей диагностической значимости. Позитивными ЛУ считались при экспрессии мРНК CK 19 более 250 копий/мкл. При этом экспрессия 250—4999 копий в 1 мкл классифицировалась как микрометастаз, а 5000 копий в 1 мкл и более — как макрометастаз [19]. Однако во всех работах по изучению OSNA для РПЖ использовались пороговые значения количества копий мРНК СК 19 для рака молочной железы. В оценке статуса СЛУ методом OSNA СК 19 принят в качестве маркера метастатической карциномы, который не является органоспецифичным, при этом уровни экспрессии для каждого органа разные.

В 2022 г. опубликован первый систематический обзор, в котором проанализировано 25 научных работ, посвященных использованию метода RT-LAMP для диагностики метастатического поражения ЛУ при опухолях различных локализаций: рак молочной железы; колоректальный рак; рак желудка, шейки матки, эндометрия; рак легкого; плоскоклеточный рак головы и шеи; рак щитовидной железы; рак предстательной железы. Научные работы выбраны из 3 основных библиотек: PubMed, Cochrane и база данных Web of Science.

Цель обзора — сравнить RT-LAMP со стандартным патоморфологическим методом исследования с окраской гематоксилином и эозином. Чувствительность составила от 50% при раке шейки матки до 100% при первичном раке молочной железы, специфичность — от 85,5% при раке эндометрия до 100% при РПЖ. Конкордантность от 88% при раке щитовидной железы до 98,8% при раке легкого и РПЖ. Систематический обзор продемонстрировал высокую чувствительность (91,4%), специфичность (100%) и конкордантность (98,8%) RT-LAMP для диагностики метастазов РПЖ в ЛУ, что делает метод перспективным для использования в клинической практике [20]. В настоящее время по данным базы данных клинических исследований зарегистрировано 11 исследований по изучению RT-LAMP (OSNA) для детекции метастазов в СЛУ при различных видах онкологических заболеваний. Однако нет зарегистрированных исследований для РПЖ.

Заключение

За последние годы во всем мире и в РФ наблюдается устойчивый тренд по увеличению заболеваемости РПЖ, одним из основных методов лечения этих групп пациентов остается РПЭ с рТЛАЭ. Однако рТЛАЭ увеличивает риск послеоперационных осложнений. Наиболее перспективным методом обнаружения метастазов для совершенствования диагностической точности ТЛАЭ является определение статуса СЛУ. Если СЛУ не поражены, то необходимости в расширении объема лимфаденэктомии нет. На сегодняшний день нет сложности с определением СЛУ. Основной проблемой является интраоперационная диагностика статуса СЛУ. Срочное морфологическое и цитологические исследования не обладают необходимой для выявления микрометастазов чувствительностью и специфичностью. Молекулярно-генетическое исследование на основе RT-LAMP является перспективной методикой для интраоперационной детекции как микро-, так макрометастазов РПЖ в СЛУ. Однако для внедрения в клиническую практику метод требует дальнейших исследований.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.