Число больных с метастатическими опухолями печени превышает в 30 раз количество пациентов с первичным раком печени. Печень является частой мишенью аденокарцином (65,5%), включая метастазы колоректального рака (48,2%), рака поджелудочной (13,5%), молочной железы (13%), желудка (6,2%), легких (4,5%), пищевода (3,7%) и нейроэндокринной карциномы (16%) [1, 2]. Чрезвычайно пеструю и сложную группу представляют больные с метастазами карциномы в печени при невыявленном первичном очаге. По данным разных авторов [3], метастатическая карцинома регистрируется в 0,5—15% случаев у обратившихся за онкологической помощью. Сложность диагностики метастатических карцином печени повышается при наличии первично-множественных злокачественных образований.
Биопсия печени с последующим морфологическим исследованием является важным инструментом для диагностики метастатических поражений печени, в том числе предоставляет возможность проведения иммуноморфологического, молекулярно-генетического исследований как на цитологическом, так и на гистологическом материале. Точная морфологическая диагностика позволяет планировать адекватное лечение пациентам с карциномами печени метастатического характера [4]. В настоящее время существует два основных метода взятия образцов чрескожной биопсии: 1) Core-биопсия, которая обычно проводится с помощью иглы 16G с ожиданием для получения достаточного количества ткани и с риском серьезных осложнений, включающих внутрибрюшинное кровотечение [5]; 2) тонкоигольная аспирационная биопсия (ТАБ), которая считается более безопасным и менее затратным методом, чем core-биопсия, обычно выполняется с помощью тонкой иглы 22-го калибра, при этом позволяет также произвести экспресс-обследование на месте (ROSE) [6].
ТАБ образований печени как минимально инвазивный метод морфологической оценки имеет диагностическую точность более 85% [7], а цитологические препараты являются полноценным источником диагностического материала [4—9]. Иногда они становятся единственным материалом, доступным для диагностики и определения маркеров для назначения лечения и установления прогноза.
Необходимо отметить, что в литературе прошлого столетия [10, 11] уже встречались работы ретроспективного анализа и многоцентрового исследования по изучению эффективности использования ТАБ при исследовании образований печени. В литературе последних лет встречаются работы [12, 13], сравнивающие результаты исследования core-биопсии и ТАБ при биопсии различных органов, включая печень. Отмечены противоречивые и неубедительные результаты. Некоторые недавние исследования показали, что точность этих двух методов сопоставима и ТАБ может обеспечить более высокую чувствительность при метастатическом поражении печени [8, 9]. Другое исследование [14] показало, что образец ТАБ является достаточно полноценным и дает в большинстве случаев более высокую фракцию опухолевых клеток, чем образец core-биопсии, где может содержаться большое количество стромальных элементов.
В большинстве случаев в нашей стране ТАБ с цитологической верификацией рассматривают исключительно как ориентировочный метод на предмет наличия или отсутствия онкологического процесса. Различия в толщине иглы и связанное с этим ожидание незначительного количества ткани привели к тому, что многие считают образцы ТАБ менее информативными, чем образцы core-биопсии. Вместе с тем в зарубежных публикациях в последние десятилетия четко прослеживается новая тенденция: использование ТАБ для оценки биологии опухоли и ее патоморфоза в ходе специализированного лечения, особенно при неэффективности терапии и росте метастатических очагов [7, 8, 14, 15].
Кроме того, многочисленные исследования показали, что ТАБ является высокоточным, безопасным и экономичным методом взятия клеточных образцов, которые подходят для иммуноцитохимического (ИЦХ) исследования и молекулярного тестирования, включая секвенирование следующего поколения (NGS) [16, 17]. Поэтому выбор метода отбора проб в конкретной ситуации должен отражать наиболее безопасный и эффективный подход, который позволит получить достаточное количество биологического материала для постановки точного диагноза и любых дополнительных исследований, влияющих на прогноз и схему лечения. Необходимо отметить, что в большинстве исследований мало информации о чувствительности, специфичности цитологического метода при разном подходе нанесения материала, включая выполнение мазка-отпечатка с кусочка ткани, полученного при core-биопсии, в сравнении с материалом, полученным при ТАБ с использованием современных методов пробоподготовки.
Морфологические характеристики метастатических опухолей печени в ряде случаев повторяют морфологию первичных опухолей — источников метастазирования. В зарубежных и отечественных работах [18—21] по изучению цитоморфологии выделяют характерные признаки аденокарцином (АК) той или иной локализации. Тем не менее в большинстве случаев для установления органной принадлежности метастазов возникает необходимость в дополнительных методах исследования, таких как ИЦХ-исследование. За последние годы достигнут огромный прогресс в клиническом использовании результатов ИЦХ-диагностики. С появлением жидкостной цитологии (ЖЦ) с возможностью приготовления качественных монослойных препаратов и клеточных блоков (КБ) ИЦХ-исследование вышло на совершенно новый уровень [17, 22—24]. Ряд исследователей [23, 25—27] проводили сопоставление результатов определения экспрессии молекулярных маркеров при ИЦХ- и ИГХ-исследовании. Получена хорошая корреляция. Совпадение результатов этих исследований составило от 61 до 92%.
В настоящее время верификация метастазов в печени в основном проводится на гистологическом материале с использованием ИГХ-метода. Анализ литературы, особенно отечественной, показал, что малоинвазивный, экономичный и высокоэффективный цитологический метод диагностики метастазов в печени не используется в полной мере в практической работе. Возникает необходимость определить место и роль цитологического и ИЦХ-метода исследования в диагностике метастатических карцином печени.
Материал и методы
Проанализированы данные цитологического и ИЦХ-исследования 386 больных с патологическими очагами в печени. Клеточный материал для исследования получали двумя способами: с помощью ТАБ и путем мазка-отпечатка со столбика core-биопсии. Пункционный материал распределяли на 1—2 обезжиренных предметных стекла и готовили тонкие традиционные мазки аналогично мазкам крови. Остаток материала из иглы и со стенок шприца удаляли путем многократной аспирации в транспортной среде, помещенной в пробирке Эппендорфа. В качестве дополнительных методов исследования клеточного материала использовали КБ и ЖЦ, применяя в основном цитоцентрифугу Cellspin II. И только в случаях преобладания элементов распада, крови как дополнение к цитоцентрифуге применяли технологию BD SurePath. Данная технология за счет использования метода клеточного обогащения позволила увеличить пропорцию диагностически значимого материала относительно общей популяции клеток (элементы крови, воспаления, клеточного детрита) не менее чем на 50%.
При получении core-биопсии материал распределяли на 2—3 предметных стекла в виде мазков-отпечатков, а оставшуюся порцию столбика ткани отправляли на гистологическое исследование.
Результаты
Проанализированы факторы, связанные с чувствительностью, специфичностью, достоверностью двух методов получения материала и трех методов пробоподготовки, по основным критериям: пропорция диагностического материала и стромального компонента, качество нанесения материала, наличие фона, степень дифференцировки карцином (табл. 1, 2).
Таблица 1. Факторы, влияющие на показатели эффективности в зависимости от метода пробоподготовки материала
| Факторы, влияющие на показатели эффективности | Мазки-отпечатки материала сore-биопсии | ТАБ | |
| Традиционная цитология | Традиционная цитология с обработкой остаточного материала со стенок шприца и из иглы +ЖЦ +КБ | ||
| Пропорция диагностического материала и стромального компонента | Прямая зависимость | Стромальный компонент отсутствует | Стромальный компонент отсутствует |
| Качество нанесения материала | То же | Прямая зависимость | Возможность приготовить монослойный препарат |
| Фон | » » | То же | Возможность удаления нерелевантного материала |
| Степень дифференцировки карциномы | » » | » » | Более щадящий режим нанесения материала с большей вероятностью обеспечивает сохранность клеток и клеточных структур; материал КБ позволяет рассмотреть архитектонику опухоли |
Таблица 2. Сопоставление результатов цитологического исследования мазков-отпечатков core-биопсии и ТАБ
| Цитологическое заключение | Количество больных | Количество мазков-отпечатков core-биопсии | ТАБ традиционная цитология + ЖЦ + КБ | |||
| абс. | % | абс. | % | абс. | % | |
| Карциномы печени | 276 | 72 | 146 | 73,7 | 130 | 69,2 |
| Неопухолевые поражения | 60 | 15 | 18 | 9,1 | 42 | 22,3 |
| Неинформативный материал | 50 | 13 | 34 | 17,2 | 16 | 8,5 |
| Всего | 386 | 100 | 198 | 100 | 188 | 100 |
Таким образом, при core-биопсии данные факторы напрямую влияют на показатели эффективности цитологического метода. Показатели эффективности ТАБ напрямую зависят от полноценности пунктата, т.е. от квалификации врача УЗ-диагностики. Все остальные факторы, снижающие показатели эффективности, можно контролировать на этапах пробоподготовки биологического материала.
Эффективность цитологического метода исследования, напрямую зависящая от методики пробоподготовки и количества нерелевантного материала (наличие крови, некроза), отражена в табл. 2, 3.
Таблица 3. Показатели информативности цитологического исследования мазков-отпечатков Core-биопсии и ТАБ
| Показатель | Количество мазков-отпечатков материала core-биопсии, % | ТАБ | |
| Традиционная цитология, % | Традиционная цитология + ЖЦ + КБ, % | ||
| Чувствительность | 81,6 | 65,6 | 89,0 |
| Специфичность | 90,0 | 100 | 100 |
| Достоверность | 78,3 | 71,8 | 91,5 |
| Положительная прогностическая ценность (PPV) | 99,3 | 100 | 100 |
| Отрицательная прогностическая ценность (NPV) | 21,4 | 39,1 | 72,4 |
Карциномы печени составили 276 наблюдений, из них 89,1% (n=246) метастатических карцином. Вторичные поражения печени в большинстве своем были представлены АК — 76,4% (n=211/276), мелкоклеточный рак был выявлен в 9,1% (n=25/276), плоскоклеточный — в 3,6% (n=10/276). Диагноз карциномы в большинстве случаев трудностей не представлял, однако предположить первичный очаг опухоли по цитологической картине было сложно. Характерные признаки с сохранением морфологии клеток кишечного, эндометриального, муцинозного типа, серозной, плоскоклеточной, светлоклеточной, нейроэндокринной карциномы наиболее часто встречались при метастазах опухолей с умеренной дифференцировкой клеток и в части наблюдений наиболее четко проявлялись в препаратах КБ (табл. 4).
Таблица 4. Сравнительная характеристика морфологических признаков карцином в зависимости от способа получения и пробоподготовки материала
| Гистологический тип карциномы | Абсолютное число утвердительных диагнозов по количеству больных | Мазки-отпечатки core-биопсии | ТАБ | ||||
| абсолютное число утвердительных диагнозов | характерные цитоморфологические критерии карцином | абсолютное число утвердительных диагнозов | Характерные цитоморфологические критерии карцином | ||||
| традиционная цитология | жидкостная цитология | клеточный блок | |||||
| АК кишечного типа | 54 | 39 | 26 | 15 | 9 | 12 | 15 |
| АК легкого | 27 | 16 | — | 11 | — | — | — |
| Рак молочной железы | 29 | 8 | 2 | 21 | 1 | 9 | 11 |
| Рак поджелудочной железы | 31 | 12 | — | 19 | — | — | — |
| АК желудка | 19 | 10 | — | 9 | — | — | — |
| Мелкоклеточная карцинома | 25 | 13 | 10 | 12 | 9 | 12 | — |
| АК без органоспецифичности | 22 | 15 | — | 7 | — | — | — |
| АК серозная | 2 | — | — | 2 | 1 | 2 | 2 |
| АК эндометриальная | 6 | 3 | — | 3 | 1 | 1 | 1 |
| Плоскоклеточный рак | 10 | 3 | 3 | 7 | 5 | 5 | 5 |
| Карцинома почки | 8 | 3 | 3 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| АК муцинозная | 6 | 3 | 2 | 3 | 3 | 2 | 2 |
| Рак предстательной железы | 2 | 1 | — | 1 | — | — | — |
| Аденокистозная карцинома | 4 | 3 | 3 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Уротелиальная карцинома | 1 | 0 | 0 | 1 | — | — | — |
| Всего | 246 | 129 | 49 | 117 | 35 | 49 | 39 |
| 55* | |||||||
Примечание. * — итого наблюдений с учетом всех признаков по трем методикам.
Возможности ТАБ для определения гистологического типа опухоли на сегодняшний день расширены в связи с активным внедрением ИЦХ-исследования в повседневную практику цитологических лабораторий, что является наиболее практичным вспомогательным методом, так как перекрывающиеся морфологические признаки карцином очень ограничивают возможности цитолога при установлении первичного очага при метастатическом поражении печени. Материал, доставляемый в лабораторию в виде мазков-отпечатков биоптата на предметных стеклах, исключал применение ИЦХ-исследования, поскольку дублировался гистологическим методом и при необходимости — с помощью ИГХ-исследований. Работа основана на применении ИЦХ-исследований для диагностики карцином печени на ограниченном количестве клеточного материала, что требовало оптимизировать панель антител (табл. 5). Учитывая, что в большинстве случаев метастазы отличаются от первичных опухолей степенью дифференцировки клеток, установление органной принадлежности карцином печени целесообразно было проводить по следующему алгоритму:
Таблица 5. Панели антител для определения первичного очага при метастазах в печени
| Первичный очаг | CK7 | CK20 | Дополнительные антитела |
| Аденокарцинома желудка | + | +/- | РЭА +++ |
| Карцинома поджелудочной железы | + | +/- | РЭА +++ |
| Карцинома желчных протоков | + | +/- | РЭА +++, CK19 |
| Карцинома легкого (немелкоклеточная) | + | -/+ | TTF1, napsin |
| Серозная карцинома яичника | + | - | WT1, Pax8, CA125 |
| Карцинома молочной железы | + | - | Gata3, mammaglobin |
| Эндометриальная карцинома | + | - | CK19, vimentin |
| Карцинома мочевого пузыря | + | + | Gata3, uroplakin, p63 |
| Муцинозная карцинома любой локализации | -/+ | + | CDX-2 |
| Колоректальная карцинома | - | + | CDX-2 |
| Карцинома почки | - | - | Pax8, RCC, vimentin |
| Карцинома предстательной железы | - | - | PSA |
1. При наличии четких клинических данных и анамнеза карциномы какой-либо локализации в целях экономии диагностического материала для дальнейшего возможного молекулярно-генетического исследования и подтверждения первичного очага целесообразно ограничиться постановкой ИЦХ-реакции с 1—2 антителами, характерными для конкретного типа опухоли (на цв. вклейке рис 1, 2).
Рис. 1. Метастаз низкодифференцированной карциномы молочной железы в печени.
В анамнезе у пациентки Triple negative карцинома молочной железы и папиллярная карцинома щитовидной железы.
а — материал представлен мономорфными клетками мелкого размера с нерезким полиморфизмом, среди которых встречаются скопления гепатоцитов (препарат Cellspin). Окраска лейкодиф, ×200; б — участок карциномы солидного строения со слабовыраженной стратификацией (препарат КБ). Окраска гематоксилином и эозином, ×200; в — яркая ядерная реакция опухолевых клеток с антителом к Gata 3 (препарат КБ), ×200.
Рис. 2. Метастаз низкодифференцированной плоскоклеточной карциномы в печени.
а — комплексы и поля, разрозненно лежащих мономорфных клеток с полиморфизмом (препарат Cellspin). Окраска лейкодиф, ×200; б — низкодифференцированная карцинома папиллярно-криброзного строения (препарат КБ). Окраска гематоксилином и эозином, ×200; в — яркая ядерная и цитоплазматическая реакция опухолевых клеток с антителом к р63 (препарат КБ), ×200.
2. При обнаружении низкодифференцированной карциномы без первично выявленного очага в случаях отсутствия возможности произвести core-биопсию, а также при отсутствии клинических данных или характерных цитоморфологических черт опухоли возникали проблемы в дифференциальной диагностике первичного и метастатического очага. Поэтому на первом этапе в панель антител входили HepPar1, Ber-Ep4, p63, chromogranin A и/или synaptophysin, CD56.
При положительной реакции:
— на HepPar1 можно предположить наличие низкодифференцированной гепатоцеллюлярной карциномы;
— на p63 можно предположить наличие низкодифференцированного плоскоклеточного рака;
— на synaptophysin, chromogranin A, CD56 опухолевыми клетками диагностируется метастаз нейроэндокринной опухоли (на цв. вклейке рис. 3);
Рис. 3. Метастаз низкодифференцированной нейроэндокринной опухоли в печени.
а — материал представлен полями разрозненно лежащих мономорфных «голых» ядер (препарат Cellspin). Окраска лейкодиф, ×200; б — низкодифференцированная карцинома альвеолярного строения (препарат КБ). Окраска гематоксилином и эозином, ×400; в — цитоплазматическая реакция опухолевых клеток с антителом к сhromogranin A (препарат КБ), ×400.
— на Ber-Ep4 предполагался метастаз АК, соответственно на втором этапе применение дополнительных антител с учетом морфологии по совокупности результатов экспрессии CK7- и CK20-клетками карцином различных локализаций выявлялся вероятный источник метастазирования.
3. При наличии противопоказаний к core-биопсии при первичном обращении в диспансер пациента или если в анамнезе указано онкологическое заболевание, но на момент обращения по клиническим данным не исключался другой очаг метастазирования, целесообразно проведение ИЦХ-исследования с расширенной панелью антител, принимая во внимание морфологию клеток. Учитывая тот факт, что распространенными метастатическими карциномами в печени являются AK, на долю которых приходится около 70% всех карцином, целесообразно на первом этапе оценить совокупность результатов экспрессии CK7 и CK20, а при малейшем подозрении на плоскоклеточный, нейроэндокринный рак или гепатоцеллюлярную карциному провести дополнительно реакции на p63, chromogranin A и/или synaptophysin, HepPar1 и/или arginasa соответственно. На втором этапе применение дополнительных антител опять же с учетом морфологии и по совокупности результатов вышеперечисленных реакций клетками карцином выявлялся вероятный источник метастазирования (на цв. вклейке рис. 4; табл. 5).
Рис. 4. Метастаз низкодифференцированной аденокарциномы легкого в печени.
В анамнезе плоскоклеточный рак слизистой оболочки полости рта.
а — разрозненно лежащие клетки средних размеров, относящиеся к карциноме (препарат Cellspin). Окраска лейкодиф, ×200; б — в материале комплексы АК (препарат КБ). Окраска гематоксилином и эозином, ×200; в — яркая ядерная реакция опухолевых клеток с антителом к TTF1 (препарат КБ), ×200.
Сложность диагностики метастатических карцином печени повышалась при наличии первично-множественных злокачественых образований, необходимо отметить, что такая заболеваемость в России растет [28]. В 7 наблюдениях определить органопринадлежность AK не представлялось возможным, несмотря на то что часть пациентов (3/7) имели в анамнезе карциному с известной локализацией, подтвержденную гистологически.
Заключение
Таким образом, учитывая малоинвазивность цитологического метода диагностики, принимая во внимание существующие ограничения при выполнении core-биопсии, ТАБ метастатических очагов печени можно рассматривать как полноценный морфологический метод верификации первичного очага. Применяя доступные ресурсы и современные протоколы пробоподготовки, необходимо отметить, что образцы ТАБ наиболее пригодны для диагностики метастатических очагов печени. Во-первых, частота получения неинформативного материала почти в 2 раза меньше, чем при core-биопсии. Это во многом обусловлено тем, что столбик ткани, помимо эпителиального компонента, содержит элементы стромы, сосудов, фиброзной ткани и др., что заметно снижает пропорцию опухолевых клеток в мазке-отпечатке и аналитическую чувствительность цитологического препарата. При аспирации в тонкую иглу попадает только эпителиальный компонент опухоли. И, несмотря на то что полученный объем ткани при ТАБ примерно в 10 раз меньше, чем при core-биопсии, качество образца в ряде случаев выше, так как при движении иглы сверху вниз во время аспирации вероятность попадания в иглу диагностического материала выше. Кроме того, ТАБ позволяет контролировать процесс пробоподготовки, применять методику ЖЦ, тем самым концентрировать, обогащать диагностический материал, удалять нерелевантный материал, использовать КБ в стандартных иммуногистохимических протоколах.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — С.В. Сметанина, Е.Н. Славнова
Сбор и обработка материала — С.В. Сметанина, Е.Ю. Ускова, Н.Ю. Орлинская, М.Б. Даняева
Статистическая обработка — Е.Ю. Ускова, А.А. Хусиянова
Написание текста — С.В. Сметанина, Н.Ю. Орлинская
Редактирование — Е.Н. Славнова
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.