Роль неисправной системы репарации неспаренных оснований ДНК как фактор чувствительности к таргетной терапии мультиформной глиобластомы

Мультиформная глиобластома (GBM; астроцитома IV степени злокачественности по классификации ВОЗ) является самой агрессивной первичной опухолью центральной нервной системы (ЦНС) [1]. Следует отметить, что термин «мультиформная глиобластома» широко используется в медицинской литературе. Хотя в классификации ВОЗ данный термин отсутствует, необходимо понимать, что он отражает гетерогенные характеристики глиобластомы на микроскопическом уровне и является в целом синонимом термина «глиобластома» [2]. Около 50% глиом во всех возрастных группах представлены GBM. Прогноз при данном заболевании крайне неблагоприятный, поскольку медиана выживаемости при выполнении стандартных протоколов комплексного лечения в лучшем случае достигает всего лишь 14—15 мес с момента постановки диагноза [3]. Стандартные черты глиобластомы включают: гиперцеллюлярность, клеточный и ядерный полиморфизм, коагуляционный некроз и пролиферацию эндотелия капилляров. Исключительной особенностью данной опухоли служит ее гетерогенная клеточная популяция с различными биологическими свойствами и молекулярными изменениями [4]. GBM стала одной из первых патологий, геномный профиль которой был подробно описан в проекте The Cancer Genome Atlas (TCGA), и на сегодняшний день представляет глобальную проблему общественного здравоохранения.

Несмотря на существенный прогресс в лечении пациентов с мультиформной глиобластомой, прогноз при данном заболевании продолжает оставаться одним из самых неблагоприятных в онкологии [5]. Стандартом лечения GBM является «максимально безопасная резекция» опухоли (maximal safe resection) с последующей адъювантной лучевой терапией и применением темозоломида (TMZ) [6]. ТMZ в сочетании с лучевой терапией в 2,5 раза усиливает свою противоопухолевую активность в послеоперационном периоде. Выступая в роли радиосенсибилизатора, он повышает чувствительность опухолевых клеток к лучевой терапии и тем самым усиливает эффект от проводимого лечения [7, 8]. К сожалению, медиана выживаемости даже при комплексном подходе крайне редко превышает 14,6 мес, поскольку в большинстве случаев у пациентов наблюдаются рецидив заболевания и приобретенная резистентность к воздействию TMZ [9].

Темозоломид (темодал) — цитостатический алкилирующий препарат 2-го поколения, относящийся к классу имидазотетразинов. Противоопухолевый механизм действия TMZ при лечении пациентов с мультиформной глиобластомой выглядит следующим образом: TMZ быстро абсорбируется после перорального введения и подвергается спонтанному разрушению с последовательным образованием 5-(3-метил-1-триазено) имидазол-4-карбоксамида, а затем метилгидразина, который является активной алкилирующей формой препарата. Метилгидразин метилирует ДНК с образованием N7-метилгуанина (70%), N3-метиладенина (9%) и O6-метилгуанина (O6-me-G; 6%). Образование O6-me-G является основой цитотоксического эффекта TMZ [10]. В ходе репликации ДНК репаративная система распознает, что O6-me-G неправильно соединен с азотистым основанием, тимином, и инициирует механизм апоптоза [11]. ДНК-репарационный белок O6-me-G-ДНК-алкилтрансфераза (MGMT, также известный как AGT) удаляет O6-метил-аддукт из гуанина и тем самым снижает эффективность TMZ в лечении GBM [12]. Установлено, что в клетках злокачественных новообразований ЦНС активность MGMT может увеличиваться в 300 раз [13]. Таким образом, MGMT препятствует терапевтическому эффекту TMZ и является одной из основных причин резистентности к этому препарату (повышенная экспрессия наблюдается в 70% случаев, где отмечается устойчивостью к воздействию алкилирующими агентами). В то же время метилирование промотора гена MGMT подавляет его экспрессию у пациентов с GBM, и они получают больший эффект от лечения TMZ по сравнению с пациентами с неметилированным промотором MGMT [14]. Также в ряде исследований [15] доказано, что статус метилирования MGMT не меняется во время лечения TMZ. Из этого следует вывод, что у GBM с метилированным промотором MGMT, которые изначально проявляют чувствительность к TMZ, но становятся резистентными спустя некоторое время после начала лечения, устойчивость опосредована другими механизмами. Как оказалось, за альтернативный механизм отвечает инактивация гена MSH6, которая и приводит к TMZ-устойчивости клеток GBM после воздействия на них данным препаратом [16].

MSH6 наряду с MSH2 и MSH3 являются важными генами системы репарации неспаренных оснований ДНК (MMR), которая отвечает за распознавание и устранение несоответствий, возникающих при репликации [17]. Вместе они образуют два гетеродимерных комплекса: MSH2-MSH6 и MSH2-MSH3. Главной функцией комплекса MSH2-MSH6 является распознавание ошибок в ходе репликации, в том числе однонуклеотидных замещений, вставок и делеций [18]. После распознавания ошибки комплекс MSH2-MSH6 связывается со специфическим участком ДНК и образует вокруг него структуру, напоминающую по форме кольцо, которое при перемещении вдоль цепи ДНК восстанавливает ее исходную структуру [19]. Данный процесс не только обеспечивает геномную стабильность в эукариотических клетках, но также препятствует их злокачественной трансформации [20]. Из этого следует вывод, что в случае мутации гена MSH6, MMR становится неисправной из-за неспособности компенсировать функцию нарушенного комплекса MSH2-MSH6. Нарушения в MMR приводят к возникновению широкого спектра злокачественных новообразований различной локализации, включая глиобластому, рак толстой кишки, желудка, яичников, эндометрия и др.

С. Hunter и соавт. [21] провели секвенирование гена MSH6 в 9 образцах GBM. Соматические мутации гена MSH6 были обнаружены в двух образцах рецидивной мультиформной глиобластомы после проведенного лечения TMZ в сочетании с лучевой терапией, причем соматические мутации MSH6 в первичных образцах отсутствовали. Мутации MSH6 не были обнаружены ни в одном из образцов до лечения, это указывает на то, что данное молекулярное нарушение не участвует в злокачественной трансформации нормальных клеток в глиобластому. Авторы пришли к выводу, что соматические мутации MSH6 являются следствием лечения темодалом и предполагают, что данное изменение обеспечивает выживаемость злокачественных клеток GBM и, как следствие, приводит к рецидиву заболевания.

В другом исследовании, помимо мутаций в гене MSH6, дополнительно оценивали экспрессию белка MSH6 в клетках GBM до и после начала лечения [22]. Как оказалось, применение исключительно лучевой терапии у пациентов с GBM не влияло на возникновение соматических мутаций в гене MSH6 или на уровень экспрессии белка MSH6. Однако в 50% рецидивирующих GBM спустя некоторое время после начала лечения TMZ в сочетании с лучевой терапией были обнаружены мутации MSH6 и снижение уровня экспрессии белка MSH6. В ходе проекта TCGA был проведен сравнительный анализ результатов полногеномного секвенирования образцов глиобластомы с ДНК, взятой из периферической крови у 91 пациента [23]. Из 19 случаев рецидива глиобластомы, где пациенты предварительно прошли лечение алкилирующими препаратами, у 5 (26%) пациентов обнаружили синонимичные мутации в гене MSH6. Помимо этого, сравнениe результатов секвенирования до и после начала лечения показало, что в 4 из 5 случаев мутации MSH6 отсутствовали в GBM до применения TMZ. Эти данные в очередной раз подтверждают гипотезу о том, что мутации гена MSH6 являются следствием лечения TMZ. Однако встречается и ряд исключений. Так, например, в недавнем исследовании сообщается о наличии мутаций MSH6 в анапластической олигодендроглиоме и глиобластоме до начала лечения темодалом, причем мутации влияли на резистентность к данному алкилирующему препарату независимо от статуса метилирования промотора MGMT [24]. Мутации MSH6 могут возникать в GBM до алкилирующей терапии, а также в других подтипах глиомы, однако, учитывая, что такие наблюдения редки, их принято относить к случайным находкам, не представляющим клинической значимости. Из этого можно сделать вывод, что большинство соматических мутаций MSH6 возникает в ходе лечения TMZ и играет ключевую роль в приобретении резистентности к воздействию данного алкилирующего препарата.

Учитывая, что экспрессия белка MGMT регулируется изменением уровня метилирования промотора соответствующего гена, J. Felsberg и соавт. [25] решили исследовать, контролируется ли экспрессия белка MSH6 подобным образом. Установлено, что статус метилирования MSH6 оставался неизменным в 43 образцах первичной и рецидивирующей глиобластомы.

J. Maxwell и соавт. [26] в своем исследовании попытались опровергнуть теорию о том, что мутации MSH6 воздействуют на устойчивость опухолевых клеток GBM к TMZ, объясняя это тем, что данные нарушения, а также потеря экспрессии белка MSH6 не приводят к возникновению высокой микросателлитной нестабильности (MSI-Н). Микросателлитная нестабильность (МСН) — это гипермутантное состояние опухолевых клеток, вызванное нарушениями в системе репарации неспаренных оснований (MMR). Микросателлитами называют короткие (1—6 нуклеотидов) повторяющиеся последовательности ДНК, склонные к накоплению ошибок во время репликации [27]. Несмотря на огромное разнообразие микросателлитов в популяции (последовательность и длина микросателлитов обеспечивают индивидуальность молекулярного «отпечатка» ДНК), длина микросателлитов постоянна внутри каждого человека. В клетках с нарушенной MMR ошибки, возникающие при репликации ДНК, не могут быть исправлены. Это приводит к их накоплению и изменениям последовательности нуклеотидов внутри микросателлитов, способствуя развитию МСН. Для идентификации МСН изучают 5 мононуклеотидных локусов, включая BAT-25 (c-kit), BAT-26 (hMSH2), NR-21 (SLC7A8), NR-22 (IMP1) и NR-24 (ZNF-2) [27]. Образец определяется как MSI-high при наличии не менее 2 нестабильных локусов. Результаты показали: экспрессия MSH6 не была связана с MSI-high-фенотипом, что было также подтверждено в ряде других исследований [28]. Было обнаружено: мутации MSH6 не связаны с фенотипом MSI-high при GBM, однако это не является доказательством того, что они не вызывают устойчивость к TMZ. J. Maxwell и соавт. не сравнивали непосредственно цитотоксический эффект TMZ с наличием мутации MSH6, в связи с чем их заключение не может считаться полностью обоснованным.

Известно, что опухолевая трансформация нормальных клеток сопровождается хромосомными аберрациями, заменами, вставками и делециями нуклеотидов в кодирующей последовательности ДНК и эпигенетическими модификациями [23]. Злокачественные новообразования обладают высокой устойчивостью ко многим существующим методам лечения и обеспечивают свою выживаемость за счет отбора клонов клеток с большим количеством генетических изменений. При прогрессировании любого онкологического заболевания гипермутантные опухолевые клетки и их клоны постоянно подвергаются ряду трансформаций и приобретают все более злокачественные характеристики. В частности, клетки GBM могут накапливать генетические изменения в онкогенах и генах-супрессорах опухолей, которые позволяют им адаптироваться к проводимым схемам лечения [29].

С. Hunter и соавт. [21] установили, что у двух пациентов с мутациями MSH6 в геноме GBM присутствовало огромное количество мутаций (34 и 30 мутаций соответственно на последовательность ДНК размером 500 кб, ~ 1 мутация на 15 кб). В общей сложности в данных образцах обнаружилось более 200 000 соматических точечных мутаций. В ходе более детального изучения обнаружили, что все они были случайно распределены по геному и в каждой опухоли присутствовало около 1500 измененных аминокислот. Данное нарушение, известное также как гипермутационный статус, способствует повышенной активации опухолевых клеток и быстрой эволюции резистентных и агрессивных клонов. Аналогичный вывод был получен S. Yip и соавт. [16]: высокая частота мутаций присутствовала в CpC-динуклеотидах в 4 случаях глиобластомы с мутациями MSH6. Согласно исследованию TCGA, из 91 образца GBM мутации MSH6 обнаруживали исключительно в тех случаях, где предварительно проводили лечение TMZ и наблюдали гипермутантный статус опухолевых клеток.

Исходя из результатов вышеперечисленных наблюдений, можно сделать вывод, что мутации в MSH6 при GBM приводят не только к резистентности к TMZ, но также могут выступать как катализатор прогрессии опухолевого роста. Следовательно, изменения в гене MSH6 следует идентифицировать на ранних этапах диагностики, чтобы соответствующим образом скорректировать схему лечения.

В отличие от злокачественных новообразований ЦНС у взрослых значительная доля опухолей мозга у детей происходит в контексте наследственных синдромов [30]. Как правило, педиатрические GBM связаны с зародышевыми мутациями ТР53 (синдром Ли-Фраумени), изменениями в генах MMR (биаллельный синдром дефицита MMR [bMMRD]) и повышенной амплификацией генов MYC, MYCN и PDGFRA [31]. У детей гомозиготные мутации зародышевой линии в одном из четырех генов MMR (PMS2, MLH1, MSH2 и MSH6) приводят к bMMRD и формированию GBM с уникальной картиной молекулярных нарушений. У 100% носителей bMMRD развиваются онкологические заболевания в первые два 10-летия жизни (глиобластома, злокачественные новообразования ЖКТ и т. д.) [31, 32]. Сочетание мутаций зародышевой линии в генах MMR и соматических мутаций в ДНК-полимеразе приводят к полному нарушению корректировки ошибок во время репликации ДНК и накоплению огромного количества мутаций [33]. Детальное изучение связи между мутационным профилем bMMRD GBM и биологией опухолевых клеток привело к развитию более грамотной тактики лечения пациентов с данным заболеванием.

На сегодняшний день самой перспективной терапией в онкологии является применение ингибиторов контрольных точек иммунного ответа (immune checkpoint therapy) [34]. Эти препараты нацелены на иммуномодулирующий эффект цитотоксического T-лимфоцитарного антигена-4 (CTLA-4) и белка запрограммированной гибели клеток-1 (PD-1). Главная цель данной терапии заключается в восстановлении эффекторной функции Т-клеток и активации их противоопухолевой активности. Последние исследования доказали, что пациенты, у которых наблюдаются опухоли с высокой мутационной нагрузкой, демонстрируют лучший клинический ответ на применение иммунной терапии [35].

Ниволумаб (Nivolumab) является анти-PD-1-направленным ингибитором, который одобрен для лечения немелкоклеточного рака легкого и меланомы, а также проходит клинические испытания при ряде других злокачественных новообразованиях у взрослых и детей [36—38]. Однако до недавнего времени оставалась неизвестной эффективность ниволумаба при bMMRD-ассоциированных опухолях, включая GBM. E. Bouffet и соавт. [39] описали 2 детей с рецидивирующей GBM, которые были невосприимчивы к стандартным методам лечения. У этих пациентов отмечен замечательный и долговременный ответ на иммунную терапию ниволумабом. Данный успех связывают с наличием так называемых выигрышных неоантигенов, которые активируют Т-клетки и характерны для уникального мутационного профиля GBM с bMMRD [40]. Это наблюдение представляет особую значимость, поскольку обследуемые дети по-прежнему клинически стабильны, тогда как большинство рецидивов педиатрических GBM обычно развиваются в течение 1—2 мес [41], и, несмотря на комплексное лечение, выживаемость таких пациентов обычно не превышает 6 мес [42]. На сегодняшний день это первый успешный отчет о применении иммунологических контрольных точек в лечении педиатрической GBM.

Несмотря на то что высокая мутационная нагрузка во всех GBM с bMMRD указывает, что такие опухоли являются превосходными кандидатами для иммунной терапии [43], в этом исследовании также поднимаются вопросы касательно сложностей данного терапевтического подхода. Известно, что гематоэнцефалический барьер остается главной преградой на пути к эффективной доставке различных химиотерапевтических препаратов [44]. Однако исчезновение множественных очагов на фоне приема ниволумаба (включая зоны, где не было проведено хирургическое вмешательство) доказало, что гематоэнцефалический барьер не влиял на доставку ингибиторов контрольных точек иммунного ответа и эффекторные Т-лимфоциты могли беспрепятственно проникать в область мозга. Специфическая картина мутационного профиля, наблюдаемого при bMMRD GBM, в частности наличие соматических мутаций в ДНК-полимеразе, не оказала барьерного воздействия на терапевтический эффект ниволумаба [39].

Таким образом, E. Bouffet и соавт. описали первый длительный ответ рецидивирующей GBM на иммунную терапию. Это исследование имеет огромное значение для клинической онкологии и может уже в ближайшем будущем кардинально изменить существующие схемы лечения GBM.

В заключение стоит отметить, что за последние 30 лет медиана выживаемости пациентов с глиобластомой выросла всего лишь на 30%. В целом это обусловлено устойчивостью злокачественных клеток GBM к предлагаемым схемам лечения (темозоломид, иринотенкан+бевацизумаб, PCV) вследствие их гетерогенной природы [5, 6]. Несмотря на то что определенные нарушения в системе репарации неспаренных оснований ДНК сопровождаются возникновением резистентности GBM к темозоломиду, более детальное исследование молекулярных характеристик таких опухолей представляет огромную значимость для выбора наиболее оптимальных схем лечения [45, 46]. Дальнейшее развитие молекулярно-генетических анализов для изучения мутантного профиля GBM с неисправной MMR непременно расширит наше понимание биологических процессов, происходящих в клетках таких злокачественных новообразований, и откроет новые возможности для выработки персонализированного подхода к лечению данного заболевания [23, 48, 49].

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of onterest.

Сведения об авторах

Хаммад В.А. — https://orcid.org/0000-0002-4787-7673, e-mail: vas-khammad@yandex.ru;

Зайцев А.М. — e-mail: azaitsev_nsi@mail.ru;

Кирсанова О.Н. — e-mail: o.n.kirsanova@gmail.com;

Харченко Н.В. — e-mail: nkharchenko@mail.ru;

Запиров Г.М. — e-mail: zapirov@mail.ru;

Кисарьев С.А. — e-mail: kysaryev@gmail.com;

Кобылецкая Т.М. — e-mail: tatakob@rambler.ru

Автор, ответственный за переписку: Хаммад Василий Александрович — e-mail: vas-khammad@yandex.ru

Хаммад В.А., Зайцев А.М., Кирсанова О.Н., Харченко Н.В., Запиров Г.М., Кисарьев С.А., Кобылецкая Т.М. Роль неисправной системы репарации неспаренных оснований ДНК как фактор чувствительности к таргетной терапии мультиформной глиобластомы. Онкология. Журнал им. П.А. Герцена. 2019;8(5):379-384. https://doi.org/10.17116/onkolog20198051379