В последнее время достижения в области молекулярной генетики активно применяют для разработки новых диагностических маркеров в цитологической диагностике доброкачественных и злокачественных образований щитовидной железы (ЩЖ) [1]. Недавние исследования свидетельствуют о возможности обнаружения мутаций в материале, полученном при тонкоигольной аспирационной биопсии (ТАБ) узловых образований ЩЖ, с целью улучшения точности цитологического метода, особенно для образцов ТАБ ЩЖ с «неопределенной» цитологией.

Точечные мутации BRAF являются наиболее распространенными генетическими изменениями при папиллярном раке (ПР) Щ.Ж. Идентифицировано более 40 мутаций BRAF, из которых наиболее часто встречается мутация в 15-м экзоне гена, вызывающая экспрессию мутантного белка BRAF V600E [2].

BRAF представляет собой протоонкоген, расположенный на 7-й хромосоме (7g24), который кодирует серин/треонинкиназу из семейства RAF-киназ, играющих центральную роль в трансдукции сигналов пути RAS/RAF/MEK/ERK, регулирующего рост, дифференцировку и апоптоз клеток [3]. Наличие мутации BRAF является фактором неблагоприятного прогноза и влияет на определение объема предстоящей операции. По данным литературы [4—6], мутация BRAF связана с агрессивными характеристиками опухоли ЩЖ и часто ассоциируется с худшим клиническим прогнозом.

По данным различных исследований [7—10], мутация V600E в гене киназы BRAF выявляется примерно в 44% (от 29 до 83%) случаев ПР.

В данной работе проведен анализ возможности использования клеточного материала ЩЖ, полученного при ТАБ ЩЖ и помещенного в консервирующую жидкость Novaprep (Франция), для определения мутации BRAF.

Исследование на наличие мутации BRAF выполнено на базе молекулярно-биологической лаборатории МГОБ № 62 Москвы.

В работе использовали 9 цитологических образцов пунктатов ЩЖ больных ПР (n=7) и аутоиммунным тиреоидитом (АИТ; n=2), установленным при цитологическом исследовании и подтвержденным при плановом гистологическом исследовании послеоперационного материала. Возраст пациентов составил от 26 до 67 лет. ПР был выявлен у 2 мужчин и 5 женщин, АИТ— у 2 женщин.

Распространенность процесса у пациентов с ПР ЩЖ оценивали согласно системе TNM в 7-й редакции 2009 г. [11].

У 2 пациентов установлена I клиническая стадия Т1N0M0. В одном случае опухоль размером 1,3×1,0 см располагалась в перешейке ЩЖ, была выполнена тиреоидэктомия; в другом случае опухоль размером 1×1 см — в правой доле, произведена гемитиреоидэктомия.

У 5 пациентов установлена III стадия (1 пациент — Т2N1M0, 2 — Т3N0M0 и 2 — Т3N1M0). Всем пациентам выполнена тотальная тиреоидэктомия, в одном случае с футлярно-фасциальным иссечением клетчатки.

Критерием отбора образцов для проведения молекулярно-генетического исследования на наличие мутации BRAF являлось подтверждение получения информативного материала (не менее 100 клеток в цитологическом препарате) при микроскопии монослойных препаратов, приготовленных с помощью центрифугирования 100 мкл клеточной суспензии в режиме 1000 оборотов в течение 5 мин на цитоцентрифуге Cellspin II фирмы Tharmac (Германия) и окрашенных по Папаниколау.

Окраску по Папаниколау проводили на автоматическом приборе ЭМКОСТЕЙНЕР АФОМК-13-ПАП (ГК ЭМКО, Россия), программа «EMCО-PAP-16». Прибор запрограммирован на последовательное применение красителей, которые заливаются в специальные контейнеры: гематоксилин для окраски ядер, OG6 (оранжевый G) и комбинированная краска EA (эозин, светло-зеленый SF и фосфорно-вольфрамовая кислота) для окраски цитоплазмы [12].

ДНК была выделена из цитологических образцов, находящихся в консерванте Novaprep (1 мл), с помощью набора cobas DNA Sample Preparation Kit («Roshe», США) в соответствии с протоколом производителя. Концентрацию выделенной ДНК определяли на спектрофотометре Qubit («ThermoFisher Scientific», США) (табл. 1).

Анализ мутации гена BRAF проводили с использованием оборудования ПЦР в реальном времени (cobas z480, «Roshe», США) с аллельспецифическими флюоресцентными и гидролизными молекулярными зондами (cobas 4800 BRAFV600 Mutation Test). Каждый зонд содержит флуорофор (FAM или VIC) на 5’-конце и гаситель на 3’-конце. Анализ антагонистов набора позволяет идентифицировать присутствие замещения V600 в гене BRAF. Большинство образцов содержит смесь дикого типа (wt) и мутантных вариантов генов BRAF. Анализ предназначен для амплификации мутантной ДНК даже в образцах с высоким содержанием немутантной ДНК. Кроме того, данный анализ ПЦР в реальном времени Roshe имеет регистрационное удостоверение в РФ для диагностики; результаты, полученные в этом анализе, не требуют подтверждения с использованием других методов.

Мутации в гене BRAF анализировали в общем объеме смеси ПЦР (30 мкл), содержащей 20 мкл смеси компонентов набора BRAF V600E Mutation Test и 10 мкл очищенной геномной ДНК (2 нг/мкл), согласно требованиям производителя. Амплификацию исследуемой области проводили в 96-луночных планшетах Roshe по программе, предоставленной производителем. Отрицательный и положительный контроли использовали из комплектации набора.

В результате мутации BRAF V600E обнаружены в двух образцах ПР (табл. 2).

Все анализируемые образцы рака ЩЖ (с наличием мутации BRAF V600E и без таковой) представлены классическим вариантом ПР.

В обоих случаях ПР с мутацией BRAF V600E цитологические препараты представлены однослойными пластами и сосочкоподобными структурами без выраженного клеточного полиморфизма. Ядра клеток опухоли округлой и овальной формы укрупнены, видны продольные бороздки, встречались единичные внутриядерные цитоплазматические включения (рис. 1, 2).

Клинические данные: женщина, 46 лет, Т2N1M0, срок заболевания 6 мес. По данным УЗИ объем правой доли ЩЖ 15,3 мл, левой 6,7 мл, увеличение паратрахеальных лимфатических узлов, узел размером 3,4×2,3×3,9 см в правой доле ЩЖ, неоднородный, смешанной эхогенности с неровными контурами. Выполнена тотальная тиреоидэктомия с футлярно-фасциальным иссечением клетчатки.

Клинические данные: женщина, 67 лет, Т3N0M0, срок заболевания 1 год. По данным УЗИ узел в левой доле ЩЖ размером 2,0×2,0×4,1 см, гипоэхогенный, неоднородный, с внутринодулярным кровотоком, неровными контурами, кальцинатами. Выполнена тотальная тиреоидэктомия.

Наиболее частая мутация в гене BRAF V600E приводит к избыточной клеточной пролиферации и устойчивости к апоптозу, поэтому определение мутации BRAF играет важную роль в диагностике и дальнейшей тактике лечения пациентов с папиллярным раком щитовидной железы. Необходимо отметить, что клетки папиллярного рака с наличием мутации BRAF и без таковой не имели морфологически значимых различий при световой микроскопии. Таким образом, генотип клеток с мутацией не зависел от их морфологического строения и являлся самостоятельным диагностическим дополнительным критерием прогноза опухоли.

Консервирующая среда, используемая для жидкостной цитологии, способствует сохранению как морфологических, так и молекулярно-генетических свойств клеточного материала, что позволило провести ПЦР-исследование на наличие мутации BRAF V600E. В клетках папиллярного рака, полученных с помощью тонкоигольной аспирационной пункции и помещенных в жидкую консервирующую среду, выявлена BRAFV600E мутация в 2 случаях; при аутоиммунном тиреоидите таковая не выявлена.

Новый подход к приготовлению и обработке цитологических препаратов с использованием жидкостной цитологии позволяет сочетать морфологические и молекулярно-генетические исследования и может стать отправной точкой для полноценной предоперационной оценки поражений щитовидной железы.

Автор выражает благодарность и глубокую признательность зав. молекулярно-биологической лаборатории МГОБ № 62, к.м.н. И.А. Демидовой и врачу клинической лабораторной диагностики МГОБ № 62 И.М. Гагарину за оказанную помощь при проведении данного исследования.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Брынова Ольга Васильевна — https://orcid.org/0000-0003-3095-2216; e-mail: olga.brynova@gmail.com