Репродукция вируса папилломы человека 16 генотипа и интеграция вирусной ДНК в измененном цервикальном эпителии

После проникновения в базальную клетку многослойного плоского (МПЭ) или резервногенного эпителия освободившаяся от капсида ДНК вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска (ВПЧ ВКР) поступает в ядро, где поддерживается в виде эписомы.

В жизненном цикле папилломавируса важнейшую роль играет «ранний» вирусный белок Е2, который регулирует репликацию вирусного генома, его сегрегацию в ходе митоза и процессы транскрипции онкогенов E6 и E7 [1—3]. Процессы репродукции ВПЧ или интегрирования вирусной ДНК в клеточные хромосомы с формированием цервикальной неоплазии происходят только в делящихся клетках [4].

Встраивание ВПЧ в клеточный геном сопровождается снижением функциональной активности вирусного белка Е2, приводящей к повышенной экспрессии вирусных белков Е6 и Е7 [5—8]. Морфологическими признаками этого процесса принято считать изменения, характерные для низкой (LSIL) и высокой (HSIL) степеней интраэпителиального повреждения плоского эпителия с возможным последующим озлокачествлением.

Признаками репликации и транскрипции вирусной ДНК с последующим формированием вирусных частиц служат наличие в цервикальном эпителии капсидного белка L1 и выявление вирионов при электронной микроскопии. Отмечено, что связанные с ВПЧ ВКР L1-отрицательные слабые и умеренные диспластические поражения цервикального эпителия в 4 раза чаще прогрессируют в рак, чем L1-положительные неоплазии. Результаты этих наблюдений предлагаются к практическому использованию в качестве прогностического фактора развития неоплазии [9, 10], хотя существует и противоположная точка зрения [11].

Целью настоящего исследования являлось изучение репродукции генотипа ВПЧ 16 и интеграции вирусной ДНК в цервикальном эпителии.

Проведен анализ результатов цитологического, иммуноцитохимического, гистологического, иммуногистохимического, электронно-микроскопического и молекулярно-генетического методов исследования эпителия шейки матки у 57 ВПЧ-инфицированных женщин в возрасте 22—61 года, находившихся на лечении по поводу цервикальной интраэпителиальной неоплазии в Санкт-Петербургском ГУЗ «Городской клинический онкологический диспансер» с октября 2010 г. по май 2011 г. включительно.

Материал соскобов с влагалищной части шейки матки и из цервикального канала для цитологического исследования в течение 10 мин распределяли на предметные стекла с помощью центрифуги Rotofix 32A при скорости 6000 об/мин, фиксировали в течение 5 мин в 95% растворе этилового спирта и окрашивали по методу Папаниколау.

Для гистологического исследования использовали материал, полученный при электроэксцизии шейки матки, который фиксировали в 10% растворе формалина, обезвоживали в этиловых спиртах восходящей концентрации, заливали в парафиновые блоки, с помощью микротома готовили срезы толщиной 5—6 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином.

Для ультраструктурного исследования использовали материал, полученный при электроэксцизии шейки матки у больной с тяжелой формой дисплазии. Кусочки ткани измельчали до 1 мм³, фиксировали в 2,5% растворе глютаральдегида на 0,1 М какодилатном буфере и в 1% растворе четырехокиси осмия на том же буфере, обезвоживали в серии этиловых спиртов восходящей концентрации и заключали в смесь смол эпона и аралдита. Ультратонкие срезы изготавливали на ультратоме LKB-100 (Швеция) и анализировали в просвечивающем электронном микроскопе JEM-1011 (Япония).

В 34 случаях проводили иммуноцитохимическое и в 23 — иммуногистохимическое исследования с использованием системы детекции Ultra Vision LP Detection System HRP Polymer & Dab Plus Chromogen (TL-015-HD) производства фирмы «Thermo Scientific» для «Lab Vision Corporation» (США) и моноклональных антител (разведение 1:100) к капсидному протеину L1 ВПЧ 16 (CAMVIR-1, Mob 394) производства «DBS». Полученные результаты оценивали в цитологических или гистологических препаратах полуколичественным способом среди всех атипичных клеток, характерных для интраэпителиальной неоплазии, в смежных с ними клетках МПЭ и метаплазированных резервных клетках, а также во всех опухолевых клетках морфологического препарата и клетках паратуморальной зоны.

Заключения результатов цитологических исследований формулировали в соответствии с классификацией «The Bethesda System for reporting cervical cytologic diagnoses» [12], гистологических исследований — в соответствии с последней редакцией гистологической классификации ВОЗ [13].

Выявление и генотипирование ДНК ВПЧ в соскобе цервикального канала проводили методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени на приборе Rotor Gene («Corbett Research», Австралия) с использованием комплектов реагентов ФГУН ЦНИИЭ.

Физический статус генотипа ДНК ВПЧ 16 оценивали по соотношению количества вирусных генов Е2/Е7 с учетом стандартного отклонения и коэффициента вариации [14—16]. При эписомной форме это соотношение считали равным 1, при 100% интеграции — 0, при смешанной (эписомная + интегрированная) форме — от 0 до 1.

Расчет степени интеграции ДНК ВПЧ 16 осуществляли по формуле:

(1 – Е2/Е7) ×100%, где Е2 — число копий гена Е2, Е7 — число копий гена Е7.

Степень интеграции ДНК ВПЧ 16 определяли как низкую (от 1 до 33%), умеренную (от 34 до 66%), выраженную (от 67 до 99%), полную (100%).

Достоверность различий полученных результатов оценивали на основании критерия Фишера с уровнем значимости p<0,05.

В результате морфологического исследования операционного материала у 3 женщин 32—50 лет верифицирована псевдоэрозия шейки матки, у 54 на ее фоне выявлены изменения МПЭ. Из них у 4 женщин 22—46 лет диагностирована слабая (CINI, LSIL), у 12 больных 25—54 лет — умеренная (CINII, HSIL), у 24 пациенток 22—60 лет — тяжелая форма дисплазии (CINIII, HSIL). У 6 женщин 29—61 года верифицирован интраэпителиальный рак (CINIII, carcinoma in situ, HSIL), у 8 пациенток 27—48 лет — плоскоклеточный рак шейки матки (SCC).

Среди женщин 40—49 лет слабая форма дисплазии выявлена у 2 (50%), интраэпителиальный рак диагностирован у 2 (33,33%) и плоскоклеточный рак — у 4 (50%). Среди пациенток 30—39 лет выявлена умеренная дисплазия у 5 (41,67%) и тяжелая — у 10 (41,67%).

ВПЧ 16 обнаружен в 40 (70,18%) случаях, его сочетания с папилломавирусами филогенетической группы (ФГГ) α9 — в 14 (24,46%), с ФГГ α9 и ФГГ α7 — в 1 (1,75%) и с ФГГ α7 — в 2 (3,51%) случаях.

По результатам ПЦР эписомная форма вирусной ДНК (степень интеграции 0) выявлена у 9 (15,79%) пациенток. Низкая степень интеграции обнаружена у 30 (52,63%), умеренная — у 10 (17,54%), выраженная — у 3 (5,27%), полная — у 5 (8,77%) пациенток соответственно (см. таблицу).

Капсидный белок L1 выявлен во всех наблюдениях псевдоэрозии шейки матки (см. таблицу). У женщин с эписомной формой ДНК ВПЧ экспрессию L1 наблюдали только в ядрах [17] поверхностных (рис. 1, а)

Рисунок 1. Капсидный белок генотипа L1 ВПЧ 16 в цервикальном эпителии. Иммунопероксидазное окрашивание. а — внутриядерная экспрессия L1 в поверхностной клетке МПЭ в цитологическом препарате псевдоэрозии шейки матки. ×600; б — внутриядерная экспрессия L1 в промежуточной клетке МПЭ в цитологическом препарате псевдоэрозии шейки матки. ×600; в — внутриядерная экспрессия L1 в атипичных клетках в гистологическом препарате умеренной дисплазии шейки матки. ×400; г — экспрессия L1 в метаплазированном эпителии в цитологическом препарате умеренной дисплазии шейки матки. ×400; д — внутриядерная экспрессия L1 в базальных клетках МПЭ в гистологическом препарате тяжелой дисплазии шейки матки. ×1000; е — внутриядерная экспрессия L1 в парабазальных клетках МПЭ в цитологическом препарате тяжелой дисплазии шейки матки. ×1000; ж — внеклеточные скопления L1 и их фагоцитоз лейкоцитами в просвете цервикального канала в гистологическом препарате плоскоклеточного рака шейки матки. ×100.

и прилежащих к ним промежуточных (см. рис. 1, б) клеток МПЭ, что характерно для продуктивного типа жизненного цикла папилломавируса [18, 19]. В этих же случаях белок L1 выявлен и в просвете дистального отдела цервикального канала, что иллюстрирует элиминацию вируса из клеток. У больной с низкой степенью интеграции вирусной ДНК капсидный белок обнаружен в ядрах парабазальных клеток.

В случаях низкой степени интраэпителиального повреждения плоского эпителия экспрессия L1 отмечена в 3 (75%) наблюдениях (см. таблицу), что в 1,5 раза превысило частоту выявления белка L1 в случаях LSIL в других исследованиях [9, 20]. Независимо от физического статуса генотипа ДНК ВПЧ 16 вирусные частицы, выявляемые с помощью антител к белку L1, обнаружены лишь в просвете цервикального канала, что считают признаком продуктивной формы папилломавирусной инфекции.

Капсидный белок L1 обнаружили в 8 (66,67%) случаях умеренной дисплазии (см. таблицу). Его экспрессию наблюдали у 1 (8,33%) пациентки с умеренной степенью интеграции ДНК ВПЧ 16 в ядрах клеток, характерных для HSIL (см. рис. 1, в), что отмечали и другие исследователи [9], и у 7 (58,33%) женщин в смежных с очагом CINII участках эпителия. Из них в 1 случае низкой степени интеграции вирусной ДНК белок L1 выявлен в ядрах поверхностных клеток плоского эпителия, в 3 случаях низкой степени и в 1 полной интеграции ДНК ВПЧ — в метаплазированных резервных клетках (см. рис. 1, г).

В 1 наблюдении с умеренной степенью и в 1 с выраженной степенью интеграции ДНК ВПЧ 16 капсидный белок L1 присутствовал только в просвете дистального отдела цервикального канала.

В 14 (58,33%) случаях тяжелой дисплазии (см. таблицу) экспрессию L1 наблюдали в участках эпителия, смежных с очагом CINIII. Из них у 1 пациентки с эписомной формой вирусной ДНК и у 6 — с разными степенями ее интеграции экспрессия L1 выявлена в ядрах поверхностных и прилежащих к ним промежуточных клеток. Независимо от степени интеграции ДНК ВПЧ в 3 случаях капсидный белок выявлен в ядрах базальных (см. рис. 1, д) и парабазальных (см. рис. 1, е) клеток, в одном — в ядрах метаплазированных резервных клеток. У 3 пациенток белок L1 обнаружен в просвете эндоцервикальных желез участка регенерации пораженного МПЭ, а также в просвете дистального отдела цервикального канала и внутри обнаруженных там же сегментоядерных лейкоцитов.

При электронно-микроскопическом исследовании случая тяжелой дисплазии наблюдали эпителиоциты как вытянутой, так и округлой формы, в которых форма ядер повторяла форму клетки. В ядрах, заполненных крупными глыбками гетерохроматина, и в околоядерной зоне цитоплазмы, содержащей тонофиламенты и большое количество свободных рибосом, а также немногочисленные короткие цистерны гладкого и шероховатого эндоплазматического ретикулума, обнаружены вирусоподобные частицы сферической формы размером около 50 нм (рис. 2),

Рисунок 2. Электронограмма клетки цервикального эпителия. Частицы ВПЧ указаны стрелками. ЭК — эпителиальная клетка; Я — ядро.

что соответствует размеру частиц ВПЧ [21] и свидетельствует о репликации и транскрипции вирусной ДНК [21—23]. Кроме того, за пределами некоторых из этих клеток также обнаружили подобные частицы. Во многих из них различима электронно-темная центральная часть, что считается признаком зрелого вириона [21]. Некоторые вирусоподобные частицы, расположенные внутри- и внеклеточно, имели равномерную электронную плотность по всей площади, свидетельствующую об отсутствии ДНК вируса внутри капсида. Независимо от локализации вирусные частицы располагались раздельно или образовывали аморфные скопления без формирования кристаллических фигур, что отмечено и другими исследователями [23, 24].

Во всех L1-положительных случаях интраэпителиального рака (50%) независимо от степени интеграции ВПЧ (см. таблицу) экспрессия белка L1 обнаружена в ядрах поверхностных и прилежащих к ним промежуточных клеток паратуморальной зоны, что согласуется с данными литературы о наличии папилломавирусов в эпителии вокруг carcinoma in situ [7]. В одном из этих наблюдений белок L1 также выявлен в пласте метаплазированного резервного эпителия, перекрывающего выводной проток эндоцервикальной железы.

В нашем исследовании частота выявления L1 в атипичных клетках HSIL (2,38%) была в 6—10 раз ниже приводимой в литературе [9, 20]. Капсидный белок в смежных с очагами CINII и CINIII участках отмечен в половине всех наблюдений, что в 1,5 раза реже частоты выявления папилломавирусов вокруг интраэпителиальной неоплазии в наблюдениях других авторов [7].

Положительная реакция на антитела к белку L1 определена у 3 (37,50%) больных плоскоклеточным раком шейки матки (см. таблицу). У 1 больной с полностью интегрированной формой ДНК ВПЧ экспрессия L1 обнаружена в атипичных клетках типа клеток парабазального и базального слоев МПЭ участка паратуморальной зоны с характерными для слабой дисплазии изменениями и в просвете цервикального канала. У 2 больных с низкой степенью интеграции вирусной ДНК капсидный белок наблюдали в метаплазированном резервном эпителии паратуморальной зоны и в просвете дистального отдела цервикального канала (см. рис. 1, ж). Отсутствие экспрессии капсидного белка L1 в клетках плоскоклеточного рака в наших исследованиях не противоречит наблюдениям других авторов [20]. При этом частота обнаружения вирусных частиц в клетках паратуморальной зоны была в 2 раза ниже таковой в других наблюдениях [7].

Наблюдаемые в гистологических и цитологических препаратах морфологические критерии поражения ВПЧ 16 атипичных клеток и окружающих их клеток в препаратах LSIL, HSIL и SCC [13, 25] не позволили отличить L1-отрицательные от L1-положительных случаев без использования иммуноморфологических маркеров.

Полученные нами результаты о разнообразии форм существования ДНК ВПЧ 16 (см. таблицу) при CIN и SCC не противоречат наблюдениям других авторов [26, 27].

Вместе с тем при прогрессировании повреждения цервикального эпителия отмечено снижение выявляемости ДНК ВПЧ 16 в эписомной и низко интегрированной формах — с 25% при LSIL до 12,5% при SCC и с 75% при LSIL до 33,3% при carcinoma in situ соответственно. Число случаев с умеренной степенью интеграции вирусной ДНК, наоборот, возрастало с 25% при CINII до 50% при carcinoma in situ. Показатели встречаемости ДНК ВПЧ с выраженной и полной интеграцией также повышались с 8,3% при CINII до 12,5% при SCC.

Выводы

1. При нарастании тяжести повреждения цервикального эпителия снижается встречаемость эписомной и низкой степени интегрированной форм генотипа ДНК ВПЧ 16 и выявляемость его капсидного белка L1.

2. Степень интеграции генотипа ДНК ВПЧ 16 более 33% обнаружена только в случаях высокой степени интраэпителиального повреждения плоского эпителия и плоскоклеточного рака.

3. Экспрессию капсидного белка L1 ВПЧ 16 наблюдали у женщин с псевдоэрозией шейки матки и слабой формой дисплазии только в дифференцированных клетках плоского и метаплазированного цервикального эпителия.

4. Продукция капсидного белка L1 ВПЧ 16 атипичными клетками выявлена в 2,3% случаев HSIL. В остальных случаях HSIL и плоскоклеточного рака белок L1 экспрессировали клетки плоского и метаплазированного эпителия смежных с CIN участков и паратуморальных зон.