МикроРНК в кардиологии: что мы можем сегодня?

На сегодняшний день одним из перспективных направлений как практической, так и исследовательской кардиологии является изучение экспрессии циркулирующих микроРНК (ц-микроРНК) в плазме у пациентов с различной патологией.

Эти одноцепочечные некодирующие РНК вызывают безусловный интерес как перспективные биомаркеры-кандидаты. Они участвуют в подавлении активности генов, комплементарно спариваясь с участками матричной РНК и ингибируя трансляцию. Интерес к их изучению связан, прежде всего, со стабильностью в биологических жидкостях. Например, микроРНК крови, входя в состав микрочастиц или связываясь с циркулирующими белками крови, защищены от воздействия разрушающих их нуклеаз. Поэтому микроРНК легко определяются в крови и являются многообещающими неинвазивными биомаркерами для многих физиологических и, соответственно, патологических процессов.

Описано более 2000 таких микроРНК. В международной базе mirbase.org зарегистрировано более 1420 зрелых микроРНК, встречающихся у человека, и эта база регулярно пополняется. Значимость микроРНК в патофизиологии человека косвенно подтверждается присуждением Нобелевской премии по физиологии и медицине в 2024 году Виктору Амбросу и Гэри Равкану.

МикроРНК представляют собой малые (длиной до 25 нуклеотидов) одноцепочечные молекулы рибонуклеиновой кислоты (РНК), которые блокируют трансляцию более 60% матричной РНК (мРНК) с помощью образования РНК-индуцированного сайленсинг-комплекса – RISC (RNA-induced silencing complex). Регулируя трансляцию и/или деградацию мРНК в организме человека, они неизбежно участвуют в различных физиологических и патофизиологических механизмах.

К RISC могут присоединяться различные белки, модифицируя его функцию. Этот комплекс связывается в области между 2-м и 8-м нуклеотидами микроРНК с комплементарной последовательностью матричной РНК. Таким образом блокируется или уменьшается трансляция любого белка. Хотя механизм деградации RISC до конца не изучен, считается, что после взаимодействия с мРНК он расщепляется протеолитическими ферментами.

Время жизни и функционирования различных микроРНК может значительно различаться. Например, период полужизни мРНК составляет 2–4 часа, а среднее время полужизни зрелой функционирующей микроРНК насчитывает дни. Цикл созревания микроРНК представлен на рис. 1 [1].

Рис. 1. Традиционный (канонический) цикл образования (созревания) микроРНК (Адаптация J. O’Brien и соавт. [1])

Помимо традиционного (канонического) пути образования зрелой микроРНК существуют альтернативные (неканонические) пути, которые включают в себя Drosha/DGCR8- и Dicer-независимые пути. Как видно из представленного цикла образования микроРНК, на каждую ступень этого процесса возможно внешнее воздействие с целью регуляции.

Интересным представляется тот факт, что нередко мишенями микроРНК являются белки, участвующие в процессинге самой микроРНК, например белок Dicer при некоторых видах онкологических заболеваний. Более того, известно, что микроРНК обладают множественной комплементарностью и могут взаимодействовать одновременно с разными мишенями, что обеспечивает устойчивую внутриклеточную среду и многообразие функций микроРНК.

Регуляторный эффект микроРНК реализуется, прежде всего, на уровне клетки. Однако эти олигонуклеотиды способны регулировать функцию любых соседних клеток и отдаленных органов и тканей, напоминая по своему механизму эффект гормона. Принято выделять несколько классических механизмов взаимодействия микроРНК и клетки-мишени: аутокринный, паракринный и эндокринный (рис. 2) [2].

Рис. 2. Механизм взаимодействия микроРНК и мишени (Адаптация B. Pardini и соавт. [2])

Для осуществления отдаленного действия микроРНК происходит активный и пассивный транспорт микроРНК.

Пассивный транспорт микроРНК может происходить, например, в случае разрушения клеточной мембраны.

Активный транспорт требует энергетических затрат и предполагает соединение микроРНК либо с белками-транспортерами (AGO 1, AGO 2), либо с липопротеидами высокой плотности (ЛПВП). Также транспортировка микроРНК возможна в составе микровезикул и экзосом: в этом случае они окружены липопротеидной мембраной (рис. 3) [3].

Рис. 3. Варианты транспорта микроРНК (Адаптация S. Zhou и соавт. [3])

Если рассматривать ц-микроРНК с точки зрения биомаркера, пригодного к изучению, то транспорт в виде соединения с белками или в виде микровезикул обеспечивает их резистентность к действию нуклеаз и, следовательно, стабильность в любой биологической среде. Доказано, что, находясь в плазме крови, они способны выдерживать изменения pH крови, повторные циклы замораживания и размораживания. С учетом такой стабильности и того факта, что микроРНК эпигенетически регулируют до 60% экспрессии всего генома человека, можно сказать, что эти олигонуклеотиды являются перспективными биомаркерами эпигенетической диагностики и терапии с поиском потенциальной мишени.

Методология детекции ц-микроРНК в крови включает 3 основных этапа: получение, изоляцию и измерение микроРНК. Однако низкая концентрация микроРНК в биологических жидкостях представляет собой реальное ограничение при оценке их диагностических и прогностических возможностей.

Исходя из этого, неизбежно встает вопрос: как объективно и достоверно измерить небольшое количество этих малых РНК? Поскольку биологические жидкости, содержащие ц-микроРНК, чувствительны к условиям окружающей среды, необходимо тщательное соблюдение стандартных и четких преаналитических условий.

Например, для последующего анализа биомаркера возможно использование пробирок, содержащих этилендиаминтетрауксусную кислоту или цитрат, но не рекомендовано использование гепарина. Также крайне важным моментом является возможность контаминации образца биологической жидкости внутриклеточными микроРНК при разрушении клеток (например, эритроцитов при гемолизе образца крови). Кроме того, считается абсолютно необходимым проведение центрифугирования в течение нескольких часов после получения образца, если в качестве биологической жидкости использовалась слюна или моча [4]. Очень важно строгое соблюдение правил забора крови, транспортировки образцов и как можно более быстрое проведение центрифугирования полученного образца цельной крови во избежание гемолиза и попадания внутриклеточных микроРНК во внеклеточную среду.

Помимо исключения клеточной контаминации, существуют также различные варианты подготовки полученных образцов для корректного измерения выделенной ц-микроРНК. Именно такую подготовку принято называть изоляцией микроРНК.

Сам процесс выделения микроРНК из биологической жидкости также является достаточно сложной задачей, поскольку, с одной стороны, естественная концентрация этих рибонуклеиновых кислот крайне мала, при этом в любых биологических жидкостях, прежде всего в крови, содержится большое количество внеклеточной контаминации, которую составляют белки, липопротеиды, другие варианты нуклеиновых кислот и т. д. В настоящий момент большинство производителей лабораторного оборудования выпускают лишь несколько стандартизированных наборов, которые достаточно просты в использовании и ускоряют процесс изоляции.

В случае поисковых работ, когда речь идет о выделении новых и не описанных ранее вариантов олигонуклеотидов, а также при одновременном выделении и изучении многих микроРНК сразу, целесообразно использовать спин-колонки: существующие в образце биологической жидкости различные фракции всех микроРНК (и связанные с белками, и находящиеся внутри микровезикул/экзосом, и связанные с ЛПВП) фиксируются на мембране колонки. Однако на мембране осаживаются и другие олигонуклеотиды, что значительно снижает специфичность данного метода изоляции. После такого осаждения необходимо дальнейшее применение дезоксирибонуклеазы, что позволяет удалить все нежелательные олигонуклеотиды из образца.

Исходя из того факта, что ц-микроРНК содержатся в низкой (по сравнению с другими поли- и олигонуклеотидами) концентрации в любой биологической жидкости, наиболее рациональным является вычисление и анализ относительного, а не абсолютного уровня микроРНК. Такой подсчет и анализ носит название нормализации.

Таким образом, общий принцип лабораторного этапа этой пока еще довольно громоздкой методики представляет собой довольно кропотливую работу:

1. Определение коэффициента гемолиза (HS) в образце плазмы.

2. Детекция микроРНК с помощью количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР), где выходной параметр – пороговый цикл амплификации (Ct).

3. Расчет относительной экспрессии каждой кандидатной микроРНК на основании Ct.

4. Расчет степени гемолиза по соотношению гемолиз-зависимой микроРНК и гемолиз-независимой микроРНК.

5. Сравнение относительных уровней экспрессии микроРНК в группах участников исследования с использованием дисперсионного анализа с поправкой на множественное сравнение Бонферрони – Хольма.

6. Определение направленности изменения относительных уровней экспрессии таргетных микроРНК в группах, для которых были найдены статистические различия.

На сегодняшний день накоплен большой пул исследовательских работ о регуляторных возможностях микроРНК в онкологии. Эти исследования демонстрируют достоверные различия уровней экспрессии ц-микроРНК плазмы крови при злокачественных заболеваниях с формированием характерного профиля. С точки зрения механизмов регуляции выделены также микроРНК, оказывающие супрессивное действие при онкологических заболеваниях – тумор-супрессоры. Таким образом, можно сказать, что изучение микроРНК в качестве онкомаркеров также получило свое широкое распространение и является по-прежнему перспективным.

Изучение реальных клинических возможностей микроРНК в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) представляется крайне перспективным. Имеются публикации, которые уже раскрыли возможности ряда олигонуклеотидов при анализе патогенеза артериальной гипертензии (АГ), гипертрофии миокарда, фибрилляции предсердий (ФП), ишемической болезни сердца (ИБС) и хронической сердечной недостаточности (ХСН).

Представляется крайне заманчивой идея рутинной оценки экспрессии ц-микроРНК в практической кардиологии, позволяющей расширить диагностический алгоритм большинства патологических состояний. Именно поэтому в течение последних 15 лет имеется все большее количество публикаций, демонстрирующих возможности уровней экспрессии некоторых вариантов ц-микроРНК как новых и обнадеживающих диагностических биомаркеров для пациентов с ИБС, АГ, ФП, расслаивающей аневризмой аорты (РАА) [3, 5–9].

Такой интерес к ц-микроРНК связан также и с безусловной необходимостью первичной профилактики именно этих нозологий как широко распространенных в практике врача-кардиолога. Первичная профилактика любой кардиологической патологии представляется крайне важной с точки зрения снижения риска осложненного течения, сердечно-сосудистой смертности и инвалидизации таких пациентов.

Однако по-прежнему актуальна и вторичная профилактика осложненного течения распространенных кардиологических заболеваний: ИБС (у пациентов с острым коронарным синдромом (ОКС)), АГ (у больных с состоявшимся ишемическим или геморрагическим инсультом) и ФП (у пациентов с тромбоэмболическими осложнениями (ТЭО)).

При этом с каждым годом среди исследуемых ц-микроРНК накапливается все большее количество биомаркеров-кандидатов, для которых доказаны диагностические возможности. Однако существующие объективные трудности пока отдаляют нас от безусловно заманчивой перспективы терапевтической мишени.

С одной стороны, имеющиеся преаналитические трудности выделения микроРНК (отсутствие единого стандартизированного протокола для всех этапов детекции ц-микроРНК) неизбежно препятствуют быстрому формированию общепризнанной международной базы данных. Это, в свою очередь, затрудняет формирование общего взгляда различных исследовательских групп на роль микроРНК в патогенезе различных кардиологических заболеваний. С другой стороны, при обследовании пациентов как с хронической, так и с острой кардиологической патологией следует учитывать плановую медикаментозную терапию и любые экстренные медикаментозные назначения, поскольку кардиотропная терапия также влияет на уровень экспрессии ц-микроРНК. Известно, что одним из наиболее широко используемых препаратов, применяемых для лечения ИБС, является ацетилсалициловая кислота. Существующее исследование показало, что активация тромбоцитов с помощью арахидоновой кислоты в присутствии ацетилсалициловой кислоты приводила к достоверному снижению активной секреции микроРНК miR-126 тромбоцитами [10]. Другое исследование показало, что здоровые пациенты, принимавшие ацетилсалициловую кислоту и прасугрел, демонстрировали снижение экспрессии miR-126, miR-150, miR-191 и miR-223 в плазме [11]. Таким образом, применение антиагрегантов способно изменять экспрессию микроРНК как посредством изменения секреции микровезикул, содержащих микроРНК, так и изменения их синтеза мегакариоцитами [12].

С этой точки зрения доказательные исследования очень трудно воспроизводимы. По сути, можно сказать, что для корректной оценки уровня экспрессии ц-микроРНК плазмы следует анализировать их уровни экспрессии у пациента до назначения ему любой медикаментозной терапии.

Среди препаратов, влияние которых необходимо изучить в первую очередь, стоит выделить антикоагулянты прямого действия (гепарин), новые оральные антикоагулянты (НОАК, NOAC: дабигатран, ривароксабан, апиксабан, эдоксабан) и антиагреганты (ацетилсалициловая кислота, клопидогрел, тикагрелор, прасугрел). Однако чаще всего в реальной практике в соответствии с существующими международными протоколами обследования и терапии кардиологический пациент попадает в поле зрения исследователя с уже назначенной плановой медикаментозной терапией, которая абсолютно показана и не может быть отменена. Кроме того, при наличии острой патологии (ОКС, РАА) накануне забора крови у больного обычно проводится экстренная коррекция медикаментозной терапии, в результате чего исследования уровней экспрессии неизбежно проводятся в «переходном периоде», когда в крови имеется некоторая концентрация впервые принятого лекарственного средства.

У кардиологических пациентов старше 40 лет часто имеется несколько кардиологических заболеваний, что довольно типично при наличии множественных факторов риска. Например, в практике кардиолога довольно типичными являются пациенты с длительно существующей неконтролируемой умеренной АГ и недавно возникшими пароксизмами ФП; больные с давней АГ, некоррегированной семейной дислипидемией и ИБС стабильного или нестабильного течения. Такие коморбидные пациенты представляют большой интерес с точки зрения изучения вклада ц-микроРНК в патогенетические звенья кардиологических заболеваний, однако их участие в исследовании предполагает формирование нескольких групп сравнения, в каждую из которых включаются пациенты с одной патологией.

Все эти представленные выше реальные трудности значительно тормозят результативность многочисленных исследований уровней экспрессии у пациентов с несколькими кардиологическими заболеваниями и обусловливают противоречивость полученных результатов. Можно сказать, что любому исследователю, который анализирует экспрессию ц-микроРНК у коморбидных кардиологических пациентов, необходимо придерживаться четырех основных правил:

1) формировать группы сравнения кардиологических пациентов после их детального диагностического обследования в соответствии с действующими клиническими рекомендациями на момент включения пациентов (группы с одинаковой доказанной нозологией);

2) формировать однородные группы сравнения с сопоставимой кардиотропной терапией (группы с одинаковыми классами кардиотропной терапии);

3) обязательно формировать группы сравнения, каждая из которых включает пациентов с одним кардиологическим заболеванием;

4) производить исследования в соответствии с жесткими преаналитическими требованиями (использование единого стандартизированного протокола получения плазмы, исключение клеточной контаминации за счет фиксированного времени и скорости центрифугирования, стандартизация методов детекции и анализа экспрессии микроРНК).

Возвращаясь к типичному коморбидному пациенту, необходимо отметить, что длительное существование неконтролируемой АГ и некоррегированной дислипидемии является доказанным фактором риска развития как ИБС стабильного течения, так и ОКС [13]. Исходя из этого, в паре «факторы риска – возникновение ИБС» представляют интерес ц-микроРНК, доказанно ассоциированные с атерогенезом, ИБС стабильного течения (СИБС, стабильная ишемия), ОКС и тромбоцитами.

МикроРНК – биомаркеры ИБС стабильного течения (СИБС)

Помимо активации тромбоцитов, регуляция с помощью микроРНК лежит в основе множества других звеньев атерогенеза: воспаление, фиброз, функция гладкомышечных клеток и эндотелиальная дисфункция [14]. Безусловный интерес вызывают публикации, посвященные возможностям первичной профилактики ИБС с использованием нового чувствительного лабораторного биомаркера. В частности, у пациентов с ранними признаками атеросклероза коронарных артерий были значимо снижены уровни miR-31 и miR-720 в плазме крови [15]. При этом другими авторами показано, что снижение уровня ц-микроРНК miR-181a также было достоверно выше у больных с коронарным атеросклерозом [16].

Уровни ц-микроРНК ассоциированы с дислипидемией [17]: в данной работе показано, что относительные уровни циркулирующих miR-145, miR-182, miR-133a, miR-205 были достоверно выше у пациентов с ИБС. На сегодняшний день можно говорить об ассоциации с СИБС для miR-145 [18], miR-370 [19], miR-29b [20], miR-155 [21], miR-134 [22], miR-133 [20, 23]. При этом важен не только сам факт наличия такой ассоциации, но и связь этих вариантов микроРНК с тяжестью коронарного атеросклероза.

Поскольку диагностическая ценность отдельных микроРНК весьма ограничена, большой интерес представляет формирование диагностических панелей. В частности, для диагностики СИБС уже сформирована панель miR-33, miR-103a, miR-24, miR-122, которая ассоциирована с СИБС с высокой точностью [24]. В наших собственных исследованиях были получены сходные результаты [8, 9].

Опубликованные результаты проспективного когортного исследования ц-микроРНК в плазме у пациентов с СИБС продемонстрировали, что ц-микроРНК miRNA-197 и miRNA-223 были достоверными предикторами сердечно-сосудистой смерти у пациентов с ИБС [25]. Результаты другого исследования показали связь miR-126 и miR-199a со снижением сердечно-сосудистой смертности у пациентов с СИБС [26], хотя ряд иных исследований не продемонстрировали подобной ассоциации.

МикроРНК – биомаркеры ОКС

Вопрос, можно ли расценивать некоторые ц-микроРНК плазмы в качестве биомаркеров ОКС, также представляется перспективным и актуальным. Прежде всего, его актуальность связана с действующими сегодня клиническими рекомендациями в Европе и США [13, 27, 28]. Современные стандарты диагностики и лечения пациентов с инфарктом миокарда (ИМ) с подъемом сегмента ST (STEMI, ИМпST) давностью менее 48 часов предполагают проведение первичного чрескожного вмешательства (ЧКВ). При этом повышение уровня тропонина не всегда позволяет точно определить давность острого инфаркта миокарда (ОИМ), поскольку, достигая своего максимального значения в течение первых 24 часов, он может сохранять свой повышенный уровень B течение нескольких дней. Рутинное ЧКВ не рекомендовано пациентам с ИМпST при длительности более 48 часов и при отсутствии клинических симптомов ишемии.

Для корректной оценки уровня экспрессии ц-микроРНК плазмы следует анализировать их уровни экспрессии у пациента до назначения ему любой медикаментозной терапии

Именно по этой причине ассоциации ц-микроРНК и ОКС было посвящено достаточно много работ. К наиболее широко изученным ц-микроРНК при ОКС можно отнести miR-1 [29, 30], miR-499 [31], miR-133 [32, 33], miR-208 [31, 34], miR-21 [34, 35], miR-93 [36, 37].

Циркулирующие микроРНК miR-1 и miR-133 относятся к кардиоспецифическим микроРНК. Их концентрация в крови растет в раннем постинфарктном периоде: пиковая концентрация достигается в течение первых 2 часов после начала ишемии [38]. Представляется важным и интересным тот факт, что уровень miR-1 продемонстрировал ассоциацию с неблагоприятными исходами ИМ и ремоделированием левого желудочка [1].

Кроме того, miR-208 также расценивается как кардиоспецифичная микроРНК, ассоциированная с механизмом пролиферации и миграции клеток и обладающая прогностическими возможностями [39]. Она продемонстрировала прогностическую ценность, ассоциируясь с характером течения ИБС у пациентов с постинфарктным кардиосклерозом.

Особый интерес также представляет хорошо изученная и чувствительная к гемолизу ц-микроРНК miR-21: она показала свои возможности у пациентов с ОКС, поскольку уровень ее экспрессии достоверно повышался у пациентов с ОИМ, а также ассоциировался со способностью предотвращать избыточное воспаление и дисфункцию левого желудочка после перенесенного ОИМ [40].

Кроме того, по-прежнему актуально наличие дополнительного специфичного биомаркера при дифференциальном диагнозе болей в грудной клетке. Например, важным и актуальным направлением исследований является использование ц-микроРНК в таком диагнозе исключения, как кардиомиопатия такоцубо. На сегодняшний день дифференцировать ОИМ и синдром такоцубо без проведения коронароангиографии (КАГ) не представляется возможным. Дифференциальный диагноз этих двух состояний чрезвычайно важен, поскольку развивающиеся при синдроме такоцубо гемодинамические нарушения могут закончиться кардиогенным шоком [41]. Таким образом, несомненна ценность исследования, где сформирована диагностическая панель ц-микроРНК, включающая miR-16, miR-1, miR-133a, miR-26a, позволяющая достоверно дифференцировать пациентов с синдромом такоцубо от здоровых лиц без повреждения миокарда и от пациентов с ИМ с подъемом сегмента ST (ИМпST, STEMI; AUC 0,881, 95% ДИ 0,793–0,968, p<0,0001) [42].

МикроРНК тромбоцитарного происхождения

Для ССЗ, при которых активация тромбоцитов является важным патогенетическим звеном, большой интерес представляет изучение внеклеточных ц-микроРНК тромбоцитарного происхождения.

С учетом доказанных звеньев патогенеза ОКС, стоит выделить эрозию нестабильной атеросклеротической бляшки с формированием на ее поверхности окклюзирующего тромба. Широкое распространение двойной антитромбоцитарной (антиагрегантной) терапии аспирином и ингибитором рецепторов P2Y12 базируется на доказанной в патогенезе ОКС значимой роли тромбоцитов. Представляется интересным известный факт повышения активации тромбоцитов как раннего маркера ОКС. Также интересны результаты исследований, продемонстрировавших ряд изменений крови пациентов с ИБС по сравнению с контрольной группой здоровых лиц: были повышены уровни некоторых биомаркеров активации тромбоцитов, а также средний объем тромбоцитов, при этом у пациентов с ИБС достоверно чаще имелись крупные тромбоциты [43].

С учетом доказанных звеньев патогенеза ОКС, стоит выделить эрозию нестабильной атеросклеротической бляшки с формированием на ее поверхности окклюзирующего тромба

Поиск небелковых биомаркеров, ассоциированных с функциональной активностью тромбоцитов, мог бы быть крайне ценным как в первичной, так и во вторичной профилактике ОКС [44]. Стабильность и простота выявления ц-микроРНК связана, прежде всего, с их характерными переносчиками: доказано, что их большая часть представляет собой микровезикулы тромбоцитарного происхождения [45].

На сегодняшний день имеется большое количество публикаций, где продемонстрирована ассоциация некоторых ц-микроРНК с тромбоцитами и их функциональной состоятельностью. В частности, к ц-микроРНК, участвующим в регуляции сосудистого тонуса и воспаления, можно отнести miR-320a-3p, miR-21-5p, miR-150-5p, miR-191-5p, miR-223-3p, miR-126-3p, miR-24-3p, miR-23a-3p. Эти ц-микроРНК обнаруживаются в самих тромбоцитах, поэтому их наличие в плазме можно объяснить именно тромбоцитарным происхождением [46, 47].

При активации тромбоцитов происходит секреция микроРНК-содержащих микровезикул [48–50]. Тем не менее относительные уровни ц-микроРНК изменяются не только при активации тромбоцитов. Ряд публикаций продемонстрировали, что изменение экспрессии ц-микроРНК можно наблюдать и при приеме антиагрегантов и антикоагулянтов, которые также влияют на функцию тромбоцитов [49, 51, 52].

Особое внимание среди микроРНК, содержащихся в тромбоцитах, следует уделить ц-микроРНК miR-223-3p, которая является биомаркером различных ССЗ. Эта микроРНК регулирует экспрессию рецептора P2Y12, обеспечивающего агрегацию тромбоцитов, секрецию гранул, а также рост и стабильность тромба. Также по ряду других исследовательских работ была показана ассоциация уровней miR-126 и miR-223 с агрегационной способностью тромбоцитов у пациентов с ОКС [53, 54].

Кроме того, крайне перспективными являются работы о возможной прогностической ценности этих ц-микроРНК. Например, в исследованиях отдельных авторов показано, что уровни miR-126 и miR-223 в плазме могут обладать прогностической ценностью относительно риска развития сердечно-сосудистых событий у кардиологических больных [55]. Похожие результаты были получены в исследовании Li, где уровни miR-150, miR-223, miR-126 в плазме достоверно различались у пациентов с ОИМ и у лиц контрольной группы [56].

Влияние преаналитических факторов на изучение циркулирующих микроРНК

Сегодня данные имеющихся публикаций о результатах сравнения уровней ц-микроРНК у кардиологических пациентов и здоровых лиц могут рассогласовываться и противоречить друг другу.

Одной из наиболее вероятных причин таких расхождений является отсутствие стандартного общепринятого международного протокола выделения, анализа и подсчета микроРНК, что нередко ведет как к выраженной погрешности измерения, так и к несопоставимости данных при нарушении процедуры нормализации [57]. Важным преаналитическим ограничением является гемолиз полученного образца, так как после разрушения клеток крови (например, эритроцитов) плазма контаминируется множеством внутриклеточных микроРНК и малых РНК.

При использовании цельной крови в качестве биологической жидкости крайне важным является четкое соблюдение правил забора крови, транспортировки образцов и как можно более быстрое проведение центрифугирования полученного образца цельной крови во избежание гемолиза и попадания внутриклеточных микроРНК во внеклеточную среду. Опубликованные результаты исследований демонстрируют многократное увеличение концентрации микроРНК именно за счет гемолиза [58].

С целью снижения клеточной контаминации многие авторы сегодня предлагают использовать двухэтапное центрифугирование, после чего производится строгая оценка степени гемолиза с использованием наноспектрофотометрии. При таком протоколе исследования можно уверенно утверждать о неклеточном происхождении исследуемых ц-микроРНК. Кроме того, в ряде исследований (и в двух наших собственных исследованиях в том числе) было показано, что тип антикоагулянта в пробирке для забора крови при получении плазмы может повлиять на активацию тромбоцитов [59].

Перспективы эпигенетической терапии

Совершенно очевидно из самого принципа функционирования «нуклеотидных ключей», что потенциальные возможности ц-микроРНК являются не только диагностическими. Для кардиологических пациентов в случае успешных доказательных исследований с получением достоверных различий уровней экспрессии различных ц-микроРНК и формирования реальных диагностических панелей откроется большая перспектива эпигенетической терапии.

Среди исследований возможностей эпигенетической терапии, которые проводятся в настоящее время, следует упомянуть изучение специфического ингибитора miR-133 – препарата CDR132L. На ранних этапах клинических испытаний было продемонстрировано, что рост уровня циркулирующей miR-132 в плазме крови приводит к адаптивной гипертрофии, прогрессирующему снижению сократимости миокарда и ингибированию процесса аутофагии. Сегодня доступны результаты Ib фазы исследования с включением 28 пациентов с ХСН со сниженной фракцией выброса левого желудочка (ФВ ЛЖ), получивших различные дозы CDR132L (две инфузии с интервалом в 1 месяц). Пациенты продемонстрировали хорошую переносимость эффективной дозы препарата с достоверным снижением уровня натрийуретического пептида крови, сужением комплекса QRS на ЭКГ покоя и выраженной тенденцией к снижению биомаркеров фиброза миокарда [60]. Сегодня продолжается 2-я фаза исследования CDR132L HF-REVERT, куда планируется включить 280 пациентов с ранней постинфарктной сердечной недостаточностью (СН) и сниженной ФВ ЛЖ. Также планируется проведение 2-й фазы исследования CDR132L REMOD-REVERT, куда будут включены пациенты с ХСН с сохранной ФВ ЛЖ [61].

Делаем выводы

В целом на сегодняшний день можно говорить как о сохраняющейся высокой актуальности, так и о несомненных успехах в изучении диагностических возможностей ц-микроРНК у пациентов с кардиологической патологией.

Особенностями этих пациентов является их коморбидность с нередким сочетанием двух или трех заболеваний одновременно, что затрудняет четкую интерпретацию полученных данных об уровнях экспрессии ц-микроРНК в плазме.

Одним из неизбежных следствий этой проблемы является несопоставимость сформированных групп пациентов по возрасту, поскольку пожилой и старческий возраст участников ассоциирован с большим количеством кардиологических заболеваний. Например, средний возраст пациентов с АГ без другой патологии будет достоверно меньше по сравнению с пациентами с АГ, перенесшими ОИМ или с пациентами с ХСН, что приводит к обсуждению вопроса корректности сопоставления полученных результатов исследования. Тем не менее такое распределение пациентов по возрасту будет естественным с точки зрения патофизиологии этих заболеваний. При этом формирование множественных контрольных групп с изолированной кардиологической патологией представляется крайне важным. Несомненные сложности возникают и при экстренной госпитализации пациентов с ОКС, когда трудно интерпретировать результаты анализа уровней ц-микроРНК у пациентов, которые экстренно или планово принимают антиагреганты и антикоагулянты. Однако все дальнейшие исследования как диагностических возможностей ц-микроРНК, так и возможностей эпигенетической терапии представляются перспективными.