Биотехнологические подходы к конструированию внутреннего контрольного образца при разработке генодиагностических препаратов

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

анализ биотехнологических вариантов при решении проблемы конструирования внутреннего контрольного образца (ВКО) для изготовления генодиагностических препаратов и разработка таких ВКО для ПЦР-тест-систем, выпускаемых Российским противочумным институтом «Микроб».

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для создания искусственной нуклеотидной последовательности, которой не обладал бы ни один из известных организмов, использовали online-ресурс Random DNA Sequence Generator. Специфические праймеры для решения этой задачи были подобраны с помощью программного обеспечения DNAWorks (v3.2.4.). Синтез олигонуклеотидов осуществляли стандартным твердофазным амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе ДНК ASM-800. Для клонирования продуктов амплификации, применяемых в качестве ВКО, использовали pAL2-T вектор. Выращивание бактерий и селекцию бактериальных клонов осуществляли на агаризованной среде Лурия—Бертани (LB), содержащей 50 мкг/мл ампициллина в качестве селективного фактора.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В работе представлены данные о биотехнологических подходах, применявшихся при конструировании ВКО. В первом случае для создания экзогенного ВКО был выбран участок гена зеленого флюоресцентного белка sGFP-206 (gfp) медузы Aequorea victoria размером 174 п.н., поскольку в изучаемых образцах данной последовательности он практически отсутствует. Во втором — была создана искусственная нуклеотидная последовательность, которой не обладает ни один из известных организмов.

При разработке диагностического набора реагентов для выявления ДНК штаммов V. cholerae в исследуемых клинических образцах методом ПЦР с гибридизационно-флюоресцентным учетом результата одной из задач было конструирование эндогенного внутреннего контрольного образца. В качестве ДНК-мишени для ВКО были использованы гены человеческой ДНК. Были проведены исследования, направленные на изучение эффективности амплификации фрагментов ВКО с температурами отжига праймеров 49, 58 и 60 °C по рабочим протоколам выпускаемых тест-систем и выявление отсутствия негативного влияния на эффективность реакции амплификации фрагментов исследуемого гена.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использованные подходы позволили создать три варианта ВКО для осуществления контроля с помощью ПЦР-РВ выпускаемых наборов реагентов для выявления ДНК возбудителей особо опасных инфекционных болезней, таких как холера, чума, сибирская язва, бруцеллез и туляремия, с гибридизационно-флюоресцентным учетом результатов.