Получение и характеризация in vitro рекомбинантного домена RCL серпина Ipis клещей Ixodes persulcatus

Клещи являются переносчиками различных патогенов человека и животных. Процессы, происходящие во время укуса клеща, играют значительную роль в передаче вирусов. При этом происходит ряд биохимических реакций, опосредованных впрыскиванием слюны клеща в хозяина, направленных на прикрепление и питание клеща. Исследования состава слюны иксодовых клещей на молекулярном уровне позволили идентифицировать такие белки как дефензины [1], Salp15 [2], липокалины [3], TROSPA [4], Salp16 [5] и металлопротеазы [6]. В слюнных железах были идентифицированы ингибиторы сериновых протеаз — серпины, которые играют ключевую роль во взаимодействии клещ-хозяин [7, 8].

Серпины представляют собой обширную группу ингибиторов сериновых протеаз. Серпины состоят из 350-500 аминокислотных остатков (а.о.), молекулярная масса варьирует от 40 до 60 кДа. Вторичная структура серпинов образована тремя β-листами (A, B и C) и 8-9 α-спиралями. Областью, ответственной за взаимодействие с протеазами-мишенями, является гибкая реакционноспособная центральная петля- RCL (reactive center loop), которая образует протяженную открытую структуру над основной частью белкового каркаса. RCL с доменной структурой из 120 а.о. придает серпинам характерную структуру, необходимую для их функционирования [7, 9—11]. Серпины играют ключевую роль в регуляции физиологических путей, контролируемых сериновыми протеазами у позвоночных и беспозвоночных, включая свертывание крови и гемолимфы, фибринолиз, воспаление, активацию комплемента и регуляцию фермента фенолоксидазы в Toll-пути у членистоногих [9].

Серпин Ipis — белок слюнной железы клеща I. persulcatus, его экспрессия значительно увеличивается у напитавшихся клещей [12]. Этот факт позволяет предположить, что экспрессию Ipis в клещах I. persulcatus индуцирует процесс кормления кровью [12]. В исследованиях показано, что у крупного рогатого скота серпин Ipis ингибирует пролиферацию клеток и выработку интерферона-гамма (IFN-γ), что свидетельствует о потенциальном прямом взаимодействии Ipis с Т-лимфоцитами и подавлении их функциональной активности [12]. Белок Iris из слюнных желез клеща Ixodes ricinus является гомологом белка Ipis. Исследования показали, что вакцинация кроликов белком Iris приводит к повышению уровня смертности клещей (как нимф, так и взрослых особей), снижению их веса и увеличению времени питания кровью у взрослых клещей [13].

В настоящее время активно разрабатываются противоклещевые вакцины, способные подавлять биологические процессы у клещей (питание, яйцекладку). В ряде исследований описаны компоненты слюны клещей, обладающие протективными свойствами, необходимыми для разработки противоклещевых вакцин. Подавляющая часть исследований направлена на изучение и получение белков клещей I. ricinus, I. scapularis, R. microplus, A. Americanum, H. longicornis, и лишь малая часть на изучение белков клещей I. persulcatus [2, 9, 14—17].

Таким образом, принимая во внимание социальную значимость переносимых клещами инфекций, разработка вакцин на основе клещевых антигенов является актуальным и перспективным направлением. Цель исследования — получение и характеризация in vitro рекомбинантного домена RCL серпина Ipis клещей Ixodes persulcatus.

Клещи. Клещи были собраны в Новосибирской области с крупного рогатого скота в мае 2022 г. в количестве 25 штук. Предварительное изучение морфологических признаков показало, что клещи относятся к виду Ixodes persulcatus.

Гомогенизация образцов и выделение РНК. Образцы живых клещей помещали в круглодонные пробирки с металлическим шариком для гомогенизации. Гомогенизацию проводили механическим способом в течении 5 мин на гомогенизаторе TissueLyser (ThermoFisher Scientific, США). Тотальную РНК выделяли из гомогенатов фенол-хлороформным методом с использованием реактива Trizol (ThermoFisher Scientific, США). Обратную транскрипцию проводили с использованием коммерческого набора REVERTA-L RT (AmpliSens, Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии, Москва, Россия).

ПЦР и секвенирование. Реакцию ПЦР для генотипирования клещей проводили, как описано ранее [18, 19]. Реакцию ПЦР для получения целевой нуклеотидной последовательности проводили с использованием специфических праймеров, разработанных на основе последовательности Ipis-1, представленной в базе данных GenBank (AB971750.1): RCLf CGGCGGCATGTATGTG (866—881 п.о.); RCLr GAGCTCACGGATGGATCCCA (1207—1226 п.о.). ПЦР проводили с использованием набора 5Х Screen mix (Евроген, Россия) при t отжига 55 ◦C. Продукты ПЦР были очищены из агарозного геля с помощью набора diaGene (ДиаМ, Россия). Секвенирование производили по методу Сэнгера на генетическом анализаторе «ABI 3500/3500xl» (Applied Biosystems, США). Полученная последовательность была депонирована в базу данных GenBank (PQ963841).

Бактериальные культуры и экспрессирующие векторы. Полученный ПЦР-продукт длиной 360 п.о. клонировали в плазмиды PCR 2.1 и pET-200 D/TOPO (Thermo Fisher Scientific, США). Трансформацию проводили на химически компетентных клетках E. coli One Shot TOP10 (Thermo Fisher Scientific, США) и E. coli BL21(DE3) (Thermo Fisher Scientific, США). Отбор клонов, содержащих целевую вставку, проводили методом ПЦР. Для скрининга использовали пару специфичных праймеров согласно инструкции производителя. Амплификацию проводили с 20 случайно отобранными колониями, и по длине полученного фрагмента ДНК на электрофорезе судили о наличии или отсутствии вставки. Для подтверждения правильной ориентации вставки ПЦР-продукты секвенировали по методу Сэнгера. Для наработки бактериальной культуры была использована коммерческая питательная среда LB (1% бактотриптона, 0,5% дрожжевого экстракта,1% NaCl, 1,5% агара) (AppliChem, Германия). Экспрессию рекомбинантного белка индуцировали добавлением до 1% изопропил-D-тио-галактопиранозида (ИПТГ) (Медиген, Россия).

Очистка рекомбинантного белка и измерение концентрации. Осадок бактериальных клеток ресуспендировали в лизирующем буфере (0,1 мг/мл лизоцима, 0,1% Тритона Х-100, 1 мМ PMSF, 0,2 м NaCl, pH 8,0). Клеточную суспензию трижды замораживали и оттаивали, добавляли ДНКазу (Sigma, США) в конечной концентрации 6 ед/мл в присутствии 20 мМ MgSO4. После инкубации при 37 °C в течение 1 ч бактериальную суспензию подвергали воздействию ультразвука на дезинтеграторе (6 раз по 10 с). Очистку белка от примесей проводили никельхелатной хроматографией с помощью смолы Ni-NTA-Superflow (Qiagen, Германия). Элюцию белка со смолы проводили в 8 М мочевине (Amresco, США) с различными концентрациями имидазола (15—80 мМ) (ICN Biomedicals Inc., США), pH 6.0. Концентрацию очищенного препарата белка определяли с помощью Protein Assay Kit (Invitrogen, USA) на приборе Qubit fluorimeter (Invitrogen, Сингапур), а качество очистки — с помощью электрофореза в 12% ПААГ в присутствии 1% SDS.

Иммунизация мышей рекомбинантным белком. Очищенным препаратом были иммунизированы 10 мышей линии BALB/c. Мышам вводили 150 мкл препарата (5 мкг рекомбинантного белка/мышь) четырехкратно внутрибрюшинно с интервалом 3 нед. Для первой иммунизации использовали полный адъювант Фрейнда 1:1 (ДиаМ, Россия), для последующих трех иммунизаций — неполный адъювант Фрейнда 1:1 (ДиаМ, Россия). Вторая группа не иммунизированных мышей в количестве 10 особей служила в качестве контрольной группы. Все животные содержались в питомнике согласно правилам лабораторной практики и получали должный уход.

ИФА-анализ для оценки иммуногенности белка, иммуноблот. ИФА проводили, как описано нами ранее [20]. Для этого в лунку полистеролового планшета вносили 100 мкл антигена (1,2 мг/мл) и сорбировали при 4 °C в течение ночи. Места неспецифического связывания насыщали 0,5% раствором казеина в ЗФР-Твин, содержащим 0?1% Tween-20 (Serva, Германия), pH-7.4 при 37 °C 30 мин. Затем инкубировали со специфическими сыворотками в течение ночи при 4 °C. Специфическое связывание выявляли антивидовыми, мечеными пероксидазой хрена антителами против IgG. В качестве хромогена использовали коммерческий раствор TMB (Abcam, США). Затем выдерживали 30 мин в темноте, останавливали реакцию добавлением 100 мкл 1N HCl на лунку и измеряли оптическую плотность образцов на спектрофотометре «Multiskan FC» (Thermo scientific, США) с использованием светофильтра с максимумом пропускания 450 нм. Положительным считали результат измерения оптической плотности (ОП) в лунке, превышающий в 3 раза таковой для лунки с отрицательным контролем. В качестве контроля использовали сыворотки неиммунизированных мышей.

Белки, разделенные электрофорезом в 12% ПААГ, переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Millipore, США) по методу, описанному ранее [21]. Перенос проводили в течение 1,5 ч на аппарате Transphor (LKB, Швеция) при напряжении 80 В в 0,025 М трис-HCl буфере, содержащем 0,192 М глицина (pH 8,3) и 20% этанола. Контроль переноса белков на нитроцеллюлозу осуществляли окрашиванием полоски мембраны красителем амидочерным10В. Остальные полоски помещали в буфер ЗФР-твин, содержащий 0,5% казеина или яичного альбумина, на ночь при 4 °C. Обработанные таким образом полоски инкубировали в течение ночи при 4 °C с поликлональной сывороткой. От избытка белка и антител избавлялись трехкратным промыванием мембран ЗФР-твин. Далее мембраны обрабатывали антивидовыми антителами, меченными пероксидазой, выдерживая 2 ч при комнатной температуре. Полоски промывали и проявляли в растворе хромогена, содержащем 1 мг/мл 3,3 диаминобензидин тетрагидрохлорид в ЦФБ буфере (pH 7,4), содержащем 0,03% перекиси водорода.

Моделирование трехмерной структуры белка. Построение структур клещевых серпинов проводили методом моделирования по гомологии с использованием сервера AlphaFold (https://www.alphafold.com/). Для этого отбирали наиболее гомологичные по аминокислотным последовательностям прототипы пространственных структур, после чего проводили непосредственно моделирование.

Статистический анализ. Статистический анализ проводили с использованием пакета программ Statistica 12.0 («Statsoft», США). Нормальность распределения проверяли с помощью теста Колмогорова—Смирнова. Данные представляли как среднее±стандартное отклонение (SD), медиану и квартили. Статистическую значимость различий оценивали с помощью критерия Краскела—Уоллиса. Различия считали значимыми при p<0,05.

Из гомогенатов клещей I. persulcatus, собранных в Новосибирской области, методом ПЦР была получена нуклеотидная последовательность длиной 360 п.о., кодирующая иммунодоминантный участок белка Ipis RCL-домен. На основе использования вектора pET-200 D/TOPO была создана рекомбинантная плазмида, продуктом экспрессии которой в клетках штамма реципиента E. coli BL21(DE3) является белок, содержащий аминокислотную последовательность иммунодоминантного участка белка Ipis RCL-домен (рис. 1, см.https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2025_03_028_add.zip). Секвенирование по Сэнгеру показало, что последовательность вставки соответствует целевой последовательности [22].

Для наработки белка, выращенные на чашке Петри клоны E. Coli, несущие плазмиду со вставкой, переносили в 100 мл среды LB. Ночную культуру выращивали на качалке при 37 °C и 170 об/мин. Затем 5 мл ночной культуры переносили в 500 мл среды LB и нарабатывали при 37 °C и 170 об/мин до ОП₆₀₀ —0,6. Образцы биомассы отбирали до индукции и после добавления ИПТГ (1 мМ в конечной концентрации), центрифугировали при 14000 об/мин 10 мин и ресуспендировали осадок в мочевине (pH 8,0). Далее подбирали условия экспрессии белка по температуре, времени экспрессии и концентрации имидазола для очистки (рис. 2—4, см.https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2025_03_028_add.zip).

Для выбора оптимальной температуры и времени экспрессии белка были проведены два параллельных эксперимента наработки белка при 37 °C и 25 °C (см. рис. 2). Образцы биомассы были взяты для анализа до индукции, спустя 1 ч, 2 ч, 3 ч, а также спустя 20 ч. Образцы биомассы анализировали с помощью электрофореза с использованием 12% ПААГ в присутствии 1% SDS. Молекулярная масса полученного целевого белка соответствовала расчетному значению и составляла 17 кДа. Было выявлено, что экспрессия белка при 37 °C спустя 20 ч эксперимента проходила более эффективно, чем при 25 °C. Очистку белка от примесей проводили никельхелатной хроматографией с помощью смолы Ni-NTA-Superflow. Для выбора оптимальной концентрации имидазола при очистке проводили серию экспериментов с увеличением концентрации имидазола с 15 до 80 мМ (см. рис. 3, 4).

Анализ данных, представленных на рис. 4, свидетельствует о том, что повышение концентрации имидазола приводит к постепенному уменьшению выхода белка. При концентрациях имидазола в диапазоне 15—30 мМ выход белка составляет 2,4—1,6 мг/мл. Однако полученный белковый препарат не обладает достаточной степенью очистки для применения в экспериментах с лабораторными животными (см. рис. 3). Увеличение концентрации имидазола до 40—80 мМ и выше сопровождается снижением выхода белка до 1,2—0,5 мг/мл. В то же время, применение высоких концентраций имидазола позволяет получить препарат с более высокой степенью очистки от примесей, что делает его пригодным для иммунизации лабораторных животных (см. рис. 3). На основании полученных результатов оптимальной концентрацией имидазола для очистки белка определена концентрация 40 мМ.

Для анализа иммуногенности 10 мышей линии BALB/c были иммунизированы очищенным препаратом белка. Во время эксперимента осуществляли ежедневное наблюдение за животными. Состояние лабораторных животных во время эксперимента оценивали по различным показателям, таким как поведенческие (уровень активности, уход за собой, социальное поведение) и физиологические (состояние шерсти, состояние глаз). Полученные сыворотки лабораторных животных после иммунизации были протестированы методом иммуноферментного анализа и иммуноблота. Было показано, что антитела из сывороток иммунизированных животных специфически взаимодействуют с полученным рекомбинантным белком (рис. 5, см.https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2025_03_029_add.zip).

С помощью сервиса AlphaFold (https://www.alphafold.com/) построены 3D-модели клещевых серпинов: Ixodes persulcatus Ipis-1 (AB971750.1), Ixodes persulcatus Ipis-2 (PP977176.1), Ixodes ricinus factor (AJ269658.2), Ixodes scapularis leukocyte elastase inhibitor (XM_029976198.4), Ixodes scapularis serine protease inhibitor precursor (FJ196393.1), Ixodes scapularis leukocyte elastase inhibitor (XM_029976197.3) (рис. 6,см.https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2025_03_029_add.zip).

Полученные модели демонстрируют характерную пространственную структуру, а также наличие сходного RCL-домена. Согласно имеющимся данным, RCL-домен играет важную роль в взаимодействии с белками и вовлечен в процесс иммуносупрессии хозяина при укусе клеща.

Было показано, что вакцины на основе белков слюны клещей являются эффективным методом борьбы с передачей клещевых инфекций. В сравнении с химическими методами (использованием инсектицидов), такие вакцины рассматриваются как более экологически безопасный способ борьбы с клещами. Тем не менее, многообразие клещевых белков остается недостаточно изученным, что ограничивает дальнейшее развитие и совершенствование противоклещевых вакцин [23].

Ранее в качестве потенциальных кандидатов для создания универсальной вакцины от клещей были предложены несколько клещевых белков, таких как Bm86 и суболезины (акирины) [24].

Bm86 представляет собой гликопротеин, локализующийся на внутренней стороне эпителия средней кишки клещей Rhipicephalus (Boophilus) microplus. На основе рекомбинантного Bm86 разработаны вакцины для иммунологического контроля клещей у крупного рогатого скота. С 1990-х гг. Bm86 используется в качестве вакцинного антигена. Противоклещевые вакцины на основе Bm86 помогают предотвратить развитие устойчивости к акарицидам и способствуют профилактике передачи возбудителей таких заболеваний, как бабезиоз и анаплазмоз [24]. Рекомбинантные белки на основе природного гликопротеина Bm86 являются единственными антигенами, используемыми в коммерческих противоклещевых вакцинах TickGard и Gavac. Эффективность вакцины Gavac против популяций R. microplus в Латинской Америке составляет 55—100% [24].

Суболезин и его ортологи (акирины) представляют собой транскрипционные факторы, регулирующие экспрессию генов сигнальной трансдукции и врожденного иммунного ответа у клещей. Эксперименты по перекрестной защите показали высокую эффективность вакцин, содержащих суболезин и акирины, против различных видов клещей. Это делает данные антигены перспективными для разработки универсальной вакцины [25—27]. Применение моно- и мультиантигенных составов суболезинов для иммунизации крупного рогатого скота показало эффективность в диапазоне от 47 до 94% [24].

Серпины, присутствующие в слюне клещей, также рассматриваются как потенциальные кандидаты для создания противоклещевых вакцин. В частности, серпин Ipis, играющий роль иммуносупрессора и подавляющий выработку IFNγ у крупного рогатого скота при взаимодействии клеща с хозяином, является перспективным кандидатом для разработки белковой вакцины [12]. Иммунизация рекомбинантным RCL-доменом белка Ipis может способствовать усилению противоклещевого иммунного ответа у животных и использоваться в качестве эффективного компонента моно- и мультиантигенных белковых вакцин.

Таким образом, в данном исследовании был получен и охарактеризован рекомбинантный домен RCL серпина Ipis клещей Ixodes persulcatus. После проведения дополнительных исследований полученный рекомбинантный домен RCL серпина Ipis планируется использовать в качестве моно- и мультиантигенных белковых вакцин.

Информация о соблюдении стандартов работы с животными: Работу с животными проводили в соответствии с принципами гуманной экспериментальной практики, сформулированной в Европейской директиве 2010/63/EU. Все процедуры с животными проводили в соответствии с действующими документами «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (https://docs.cntd.ru/document/456016716) и «Руководство по уходу за лабораторными животными и их использованию» (Albus, 2012). Исследования были одобрены комитетом по биоэтике ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово, Россия (протокол №6 от 20.11.2024).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.