Эффективность различных VNTR локусов в MLVA25 анализе штаммов Yersinia pestis средневекового биовара из очагов Восточной Европы и Центральной Азии

Бактерия Y. pestis является возбудителем особо опасного природно-очагового заболевания — чумы, способного к эпидемическому и пандемическому распространению. Глобальный характер проблемы чумы определяется существованием большого числа природных очагов чумы на различных континентах и высокой вирулентностью штаммов Y. pestis. В природе возбудитель чумы циркулирует на широком круге носителей и переносчиков, который включает 363 вида млекопитающих и 280 видов и подвидов блох [1, 2]. Считается, что географические и климатические факторы, а также природные катаклизмы, оказывают значительное влияние на эпизоотическую и эпидемическую активность природных очагов чумы [3, 4].

Штаммы Y. pestis вследствие их широкого распространения и адаптации к условиям разных природных биоценозов претерпевают различные изменения генома в ответ на воздействие окружающей среды. Эта изменчивость лежит в основе существующего генетического разнообразия штаммов Y. pestis в природных очагах чумы. Ранее проведенные молекулярно-генетические исследования показали, что в очагах чумы России и других стран СНГ распространены высоковирулентные и эпидемически значимые штаммы Y. pestis основного подвида, относящиеся к средневековому и античному биоварам [5]. В эндемичных очагах Кавказа, Горного Алтая и Центральной Азии встречаются штаммы Y. pestis неосновных подвидов, которые избирательно вирулентны для мелких мышевидных грызунов и зайцеобразных.

По генетической номенклатуре штаммы Y. pestis делят на ряд филогенетических линий и ветвей [6—8]. По современной классификации вид Y. pestis включает семь подвидов: кавказский (0.PE2), ангольский (0.PE3), центральноазиатский (0.PE4), улегейский (0.PE5), тибетский (0.PE7), цинхайский (0.PE10), основной. Последний включает 4 биовара — античный, представленный 5 филогенетическими линиями 0.ANT-4.ANT; средневековый — 2.MED; восточный — 1.ORI; промежуточный — 1.INT [5]. В XX веке широкое распространение в очагах Восточной Европы и Центральной Азии получили штаммы наиболее молодой филогенетической ветви 2.MED1 средневекового биовара, которые встречаются в 33 из 45 очагов чумы стран СНГ, в том числе в 7 из 11 природных очагов России. Штаммы 2.MED1 занимают 93,3% очаговых территорий СНГ с общей площадью 1959965 км², в том числе 6 очагов сусликового (221347 км²), 25 очагов песчаночьего типа (1728676 км²), 2 очага сурочьего (9942 км²) типов. Эти штаммы распространены в очагах Прикаспия, Кавказа и Центральной Азии [9, 10]. В Центрально-Кавказском высокогорном очаге наряду с ветвью 2.MED1 средневекового биовара циркулирует и другая, наиболее ранняя из всех ветвей средневекового биовара 2.MED0. Также в первой половине XX века в очагах Северного и Северо-Западного Прикаспия циркулировали штаммы ветви 2.MED4, которые во второй половине этого века уже не выделялись. Штаммы средневекового биовара еще двух филогенетических ветвей 2.MED2 и 2.MED3 встречаются в Китае [8].

Распространение штаммов филогенетической ветви 2.MED1 в XX веке в Восточной Европе и Центральной Азии привело к многочисленным вспышкам чумы с высокими показателями летальности среди населения [9]. Ранее проведенные исследования показали, что штаммы 2.MED1 из очагов Восточной Европы и Центральной Азии в свою очередь делятся на две ветви — каспийскую (CS) (очаги Кавказа, Прикаспия) и центрально-азиатскую (CA) — очаги Центральной Азии (преимущественно Прибалхашский, Муюнкумский, Таукумский, Кызылкумский пустынные очаги) [9].

Штаммы 2.MED1 генетически однородны и их дифференциация является не простой, но актуальной для мониторинга очагов чумы России и других стран СНГ задачей. Для исследования штаммов Y. pestis средневекового биовара, имеющих важное эпидемиологическое значение, и для повышения эффективности эпидемиологического мониторинга этих территорий требуется наличие высокоразрешающих методов молекулярного типирования [5]. Как показал опыт молекулярно-генетических исследований, одним из наиболее высокоразрешающих методов типирования и определения филогеографической принадлежности штаммов Y. pestis является метод VNTR (от англ. variable number tandem repeats) и его мультилокусный вариант MLVA (от англ. multiple locus VNTR analysis) [12, 13]. Метод основан на анализе повторяющихся тандемных последовательностей, количество которых может изменяться в одной и той же области генома при сохранении структуры окружающих последовательностей. MLVA удовлетворяет большинству критериев, необходимых для эффективного типирования таких генетически мономорфных возбудителей как Y. pestis, Bacillus anthracis, Francisella tularensis, включая простоту использования, высокую дискриминационную способность и хорошую воспроизводимость. Метод MLVA25 успешно используется для молекулярно-эпидемиологических исследований Y. pestis; а также для клональной кластеризации определенных филогенетических групп; решения задач, связанных с микроэволюцией и таксономией возбудителя чумы [14—16]. Однако эффективность различных VNTR локусов и их значимость в генотипировании штаммов средневекового биовара остается не оцененной. Важной задачей является оптимизация метода MLVA25 для быстрой и высокоразрешающей дифференциации эпидемически значимых штаммов Y. pestis средневекового биовара, широко распространенных в природных очагах РФ и сопредельных стран на территории Восточной Европы и Центральной Азии.

Цель работы: оценка эффективности различных VNTR локусов и оптимизация метода MLVA25 для дифференциации штаммов Y. pestis средневекового биовара из природных очагов РФ и других стран СНГ, расположенных в Восточной Европе и Центральной Азии.

В работе использованы полногеномные последовательности 220 штаммов Y. pestis средневекового биовара основного подвида из 31 очага чумы России и других стран СНГ, полученных в 1917—2003 гг. от носителей, переносчиков, больных людей, а также полногеномные последовательности 31 штамма других филогенетических линий Y. pestis из очагов чумы мира (табл. 1). Мультилокусное типирование MLVA25 проводили по 25 VNTR локусам с исключением из анализа трудно идентифицируемого локуса ms09 [13]. Праймеры для локусов ms46 и ms62 использовали согласно описанным [17]. Поиск участков VNTR осуществляли в полногеномных последовательностях штаммов Y. pestis с применением авторского скрипта, принцип действия которого основан на поиске последовательностей, фланкирующих VNTR локусы праймеров, с последующем вырезанием найденных участков и сохранением их в multi-FASTA файле. Подсчет количества тандемных повторов проводили в программе TRF [18], полученные значения округляли в меньшую сторону до целого числа. Степень вариабельности локусов оценивали посредством расчета индекса аллельного полиморфизма (h) с использованием формулы разнообразия Нея (Nei’s Diversity Index). Также был рассчитан соответствующий 95% доверительный интервал (CI от англ. Confidence Interval) [19].

Таблица 1. Штаммы Y.pestis, использованные в MLVA25 анализе

Примечание: NA* (Not Available) — не известно.

Полученные последовательности VNTR локусов вносили в программу Bionumerics 7.6.3. Построение филогенетического дерева осуществляли методами невзвешенного кластирования с арифметическим усреднением (UPGMA) и MST (Minimum spanning tree, минимальное остовное дерево). Оценку дискриминационной возможности системы типирования (Discrimination Power — DP) производили по индексу Симпсона [20].

В работе использованы полногеномные последовательности 220 штаммов Y. pestis средневекового биовара основного подвида из 31 очага чумы России и других стран СНГ, полученных в 1923—2003 гг., а также полногеномные последовательности 31 штамма других филогенетических линий (см. табл. 1). Поиск фрагментов VNTR осуществляли в полногеномных последовательностях штаммов Y. pestis с использованием авторского скрипта. Подсчет количества тандемных повторов по VNTR локусам проводили с помощью программы TRF (табл. 2). Современные методы секвенирования нового поколения генерируют относительно короткие последовательности [21], которые могут не охватывать весь VNTR локус. Это относится к VNTR локусам, которые могут иметь очень большое число копий [22]. По этой причине из анализа был исключен локус ms09. Для каждого VNTR локуса была определена степень вариабельности посредством расчета индекса аллельного полиморфизма (h) с использованием формулы разнообразия Нея (Nei’s Diversity Index) [23]. Для 24 использованных VNTR локусов количество аллелей, наблюдаемых по каждому локусу, варьировало от 1 до 18 (см. табл. 2).

Таблица 2. Анализ аллельного полиморфизма 24 локусов VNTR у штаммов Y.pestis, использованных в этой работе

Примечание: n* — число аллелей; h** — индекс аллельного полиморфизма; CI*** — доверительный интервал; *¹ — количество повторов по конкретному аллелю, представлено от большей частоты к меньшей.

Как показал проведенный MLVA анализ, наименее вариабельными по количеству аллелей (2-3) оказались локусы ms15, ms20, ms35, ms41, ms45, ms73, в то время как наиболее вариабельными по количеству аллелей (6-18) были ms04, ms06, ms46, ms62, ms70, ms74. Индекс аллельного полиморфизма, рассчитанный на основе частот аллелей, у исследованных штаммов варьировал в широких пределах от 0,101 до 0,905, за исключением тех локусов, где обнаружен только 1 аллель (см. табл. 2). По данным литературы по индексу аллельного полиморфизма вариабельность VNTR локусов делят на три типа: высоко вариабельные (h>0,25), умеренно вариабельные (0,11<h<0,25) и низко вариабельные (0,01<h<0,11) [24].

По итогам проведенного статистического анализа дискриминационной силы каждого локуса для штаммов средневекового биовара выявлены локусы с наибольшим генетическим полиморфизмом: ms01, ms07, ms46, ms56, ms62, ms70 и ms74 (рис. 1). Данные локусы включают от 2 до 16 аллелей с индексом аллельного полиморфизма 0,14-0,896. Наиболее вариабельные локусы с наибольшей эффективностью разделяют близкородственные штаммы по месту или времени происхождения, поэтому их включение в оптимизированную схему MLVA типирования средневекового биовара было целесообразным.

Рис. 1. График дискриминационной способности различных VNTR локусов для 220 штаммов Y.pestis средневекового биовара, выделенных в 1917—2003 гг. в 31 очаге чумы России и других стран СНГ.

DP — индекс дискриминационной способности.

Скорость мутаций значительно варьирует в зависимости от таксона, локуса и даже аллеля [12]. Участки последовательностей повторов во многих умеренно вариабельных и низко вариабельных VNTR в связи с низкой скоростью мутирования этих локусов долго остаются неизменными среди групп штаммов, выделенных в один период времени на одной территории. Поэтому даже незначительные изменения в количестве этих повторов могут повлиять на распределение штаммов на дендрограмме. Так, умеренно и низко вариабельные локусы ms05, ms06, ms15, ms21, ms71 по результатам проведенного нами статистического анализа оказали наибольшее влияние на разделение штаммов некоторых популяций средневекового биовара, таких как 2.MED4, а также 2.MED1 из Каракумского пустынного, Мангышлакского пустынного и Урало-Уильского степного очагов чумы. Из этого следует, что использование высоко вариабельных локусов — ms01, ms07, ms46, ms56, ms62, ms70 и ms74 и таких локусов с низкой скоростью накопления мутаций как ms05, ms06, ms15, ms21, ms71 позволяет добиться высокого разрешения в анализе и разделении штаммов средневекового биовара на генотипы. Эти VNTR локусы были использованы нами при разработке оптимизированной схемы MLVA12 типирования для штаммов Y. pestis средневекового биовара. При использовании в MLVA анализе других низко вариабельных локусов — ms35 и ms73 никакой зависимости топологии дерева штаммов средневекового биовара от их присутствия выявлено не было. Использование еще 10 других локусов ms04, ms20, ms38, ms40, ms41, ms44, ms45, ms51, ms54, ms69 из системы MLVA25 типирования в оптимизируемой схеме типирования средневекового биовара было также не целесообразным, поскольку каждый из них у штаммов средневекового биовара был представлен только одной аллелью.

Для дифференциации штаммов Y. pestis средневекового биовара были отобраны локусы с наибольшим генетическим полиморфизмом (ms01, ms07, ms46, ms56, ms62, ms70 и ms74), а также некоторые умеренно и низко вариабельные локусы, оказывающие наибольшее влияние на распределение штаммов на дендрограмме (ms05, ms06, ms15, ms21, ms71).

Для оценки эффективности оптимизированного набора VNTR локусов — MLVA12 — и проверки дискриминирующей способности метода для штаммов средневекового биовара построена дендрограмма методом UPGMA с использованием программы Bionumerics 7.6.3 (рис. 2, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_04_022_add.zip). Распределение штаммов на дендрограмме на основе 12 VNTR локусов и на дендрограмме, построенной на основе 24 локусов (данные не приводятся), было идентично (DP =0,98).

Штаммы 2.MED1 из очагов Восточной Европы и Центральной Азии делятся на две ветви — каспийскую (CS) и центральноазиатскую (CA). Список генотипов CA и CS представлен в табл. 3.

Таблица 3. Список MLVA12 генотипов 220 штаммов Y.pestis средневекового биовара из природных очагов Восточной Европы и Центральной Азии, использованных в работе

Анализ дендрограммы показал, что каждый очаг чумы имел свои уникальные типы MLVA. Большинство изолятов Y. pestis средневекового биовара (88%, 193/220) можно разделить на 4 основных кластера, №№1—4. Первый из них (№1) включает 58 штаммов. В этот кластер вошли штаммы из высокогорных, низкогорных и равнинно-предгорных природных очагов чумы Кавказа (CA7, CS2, CS9, CS13, CS14, CS15, CS16, CS24, CS25), Прибалхашского (CA1, CA8, CA9), Муюнкумского (CA2, CA5, CA6), Северо-Приаральского (CA4), Каракумского (CA11, CA12) пустынных очагов, а также Волго-Уральского степного (CS10) и Волго-Уральского песчаного (CS3, CS4, CS6, CS8, CS18, CS19, CS21, CS22, CS23) очагов чумы, выделенных в основном в первой половине XX века. Штаммы (27 штаммов) центральноазиатской ветви из смежных очагов чумы западного Казахстана выделены в 2 отдельные группы (CA1-CA9 и CA10-CA11). Данный кластер образован за счет отличий в аллелях по локусам ms01, ms07, ms46, ms56, ms74 и разделен на 37 MLVA типов. Кластер №2 (CA12-CA23) состоит из 36 штаммов центральноазиатской ветви, в основном из Мойынкумского пустынного очага чумы (CA12-CA13, CA15-CA21), выделенных в период 1984—1993 гг. Этот кластер выделен благодаря локусам: ms01, ms56, ms70 и ms74. Кластер №3 содержал наибольшее количество штаммов (79), разделяющихся на 42 MLVA генотипа, из которых 38 относятся к каспийской, а 4 к центральноазиатской ветвям эволюции средневекового биовара. Данный кластер в основном состоит из групп штаммов каспийской ветви, выделенных на территории Волго-Уральского междуречья, Астраханской и Волгоградской областей (CS28, CS30, CS41- CS44, CS46, CS50- CS51, CS62) Российской Федерации, а также Атырауской (CS27, CS31, CS32, CS33, CS36-CS40, CS45-CS49, CS64-CS65) и других западных областей (CA24- CA27, CS29, CS34, CS52-CS61) Республики Казахстан, из 14, 15, 16, 17, 18, 20 21, 24, 23, 43 очагов чумы (см. табл. 1). Также в третьем кластере отдельную группу составили пять штаммов центральноазиатской ветви (CA24-CA27), выделенные (1965—1973 гг.) в Прибалхашском, Муюнкумскм и Аксайском очагах чумы. Эти штаммы включены в №3 кластер за счет аллелей в локусах ms46, ms56 и ms62. Кластер №4 состоит из 20 штаммов (CS66-CS77) каспийской ветви, выделенных в период 1945-1978 гг. из 11, 15, 16, 18, 20, 21, 23, 24 очагов чумы (см. табл. 1). Этот кластер разделен на 12 MLVA типов за счет отличий в аллелях по локусам: ms46, ms62, ms70.

К линии средневекового биовара относятся также штаммы (12%), не вошедшие в эти 4 кластера. К ним принадлежат 2 штамма (генотип CA33, CA34) из Кызылкумского природного очага чумы, выделенные в 1924 г. во время вспышки чумы в с. Ак-Камыш. Их MLVA генотип отличается от других изолятов средневекового биовара по локусам ms07, ms21, ms70 и ms74. Также отдельно расположены штамм филогенетической линии 2.MED0 из Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы, 4 штамма филогенетической линии 2.MED4 и 20 штаммов 2.MED1 (CA28-CA32, CS78-CS86), выделенные в период 1924—1970 гг. в Волго-Уральском степном и Волго-Уральском песчаном (CS80-CS82), Урало-Эмбенском (CS78-CS79), Каракумском (CS85-CS86) и Копетдагском (CS84) природных очагах чумы. Данные штаммы имели отличные повторы от остальных штаммов средневекового биовара в локусах ms05, ms46, ms62, ms70, ms74. Штаммы филогенетической линии 2.MED4 также отличались по локусам ms05, ms15, ms56.

Анализ кластеризации штаммов на дендрограмме свидетельствует о приуроченности MLVA генотипов к определенным территориям природных очагов чумы. Расположение на дендрограмме штаммов, входящих в кластерные комплексы и формирующих индивидуальные MLVA генотипы, доказывает их длительное сохранение в отдельных экологических нишах.

В результате статистического анализа выбранных нами 12 VNTR локусов у штаммов средневекового биовара обнаружены 126 индивидуальных генотипов, что соответствует DP=0,98. Это свидетельствует о высоком разрешении метода MLVA12 и о том, что комбинация этих 12 локусов может быть использована в качестве метода типирования Y. pestis с общепринятой вероятностью ошибки 5%. Данный показатель коррелирует с кластерным анализом, при котором исследуемые штаммы разделились на 126 MLVA генотипов. Использование предложенного набора VNTR локусов для штаммов средневекового биовара, циркулирующих на территории Восточной Европы и Центральной Азии, позволяет получить идентичный результат типирования, как при использовании полного набора локусов в MLVA25 анализе.

Локусы, у которых индекс полиморфизма равен нулю, не влияют на генотипирование штаммов, т.к. индивидуальные генотипы формируются за счет уникальных комбинаций чисел количества повторов во всех локусах. Из этого следует, что индекс дискриминационной возможности Симпсона (0,98) остается неизменным при исключении из выборки всех не вариабельных локусов (h=0). По данным индекса частот аллелей, посчитанного нами для штаммов средневекового биовара, были выявлены 10 локусов с нулевым диапазоном частот тандемных повторов — их аллели представлены 1 вариантом повтора (см. табл. 2). Такими локусами оказались: ms04, ms20, ms38, ms40, ms41, ms44, ms45, ms51, ms54, ms69. Независимо от их наличия или отсутствия в анализе количество MLVA генотипов средневекового биовара сохранялось неизменным и равнялось 126. Таким образом, использование этих локусов для внутрибиоварной дифференциации штаммов средневекового биовара, циркулирующих на территории Восточной Европы и Центральной Азии, методом MLVA нецелесообразно. У этих локусов единый вариант VNTR повтора присутствует в группе средневекового биовара, который также изредка встречается и во взятых нами в исследование штаммов других филогенетических линий. Четыре из этих 10 локусов — ms44, ms51, ms54 и ms69 — оказались мономорфными для всех групп штаммов, использованных в работе. Однако другими исследователями в локусах ms44, ms51, ms54 и ms69 были выявлены и другие варианты аллелей, отличавшиеся от наших, что связано с использованием в анализе большего числа штаммов Y.pestis других филогенетических линий [15]. Процент встречаемости единого аллеля средневекового биовара у оставшихся 6 из 10 локусов (ms04, ms20, ms38, ms40, ms41, ms45) у штаммов других биоваров составляет 22,5, 19,3, 3,1, 67,7, 0 и 9,3% соответственно, из чего следует, что применение комплекса этих 6 локусов обеспечивает дифференциацию средневекового биовара от других филогенетических групп Y. pestis. Анализ данных литературы подтверждает сделанное нами заключение о том, что у штаммов античного, восточного биоваров и других филогенетических линий, варианты аллелей этих 6 VNTR локусов отличаются от единого варианта аллеля штаммов средневекового биовара [15, 25—28]. У штаммов античного, восточного и промежуточного биоваров, а также кавказского подвида (0.PE2) и биовара микротус центральноазиатского подвида (0.PE4m), количество повторов варьировало в локусах: ms04 — 2-10; ms20 — 2-11; ms38 — 5-11; ms40 — 7-11; ms41 — 5-7; ms45 — 2-10. При комплексном использовании данных локусов, вероятность перекрытия по аллельному признаку минимальна, так как встречаемость доминирующего аллеля средневекового биовара в локусах, приведенных выше, единична. Из этого следует, что комбинация локусов ms04, ms20, ms38, ms40, ms41, ms45 дает возможность эффективно отделять штаммы Y. pestis средневекового биовара от античного и восточного биоваров, а также от штаммов других филогенетических линий (рис. 3).

Рис. 3. Дифференциация штаммов Y.pestis средневекового биовара на основе 6 локусов VNTR.

а — дендрограмма 251 штамма Y. pestis разных филогенетических линий с использованием 24 локусов VNTR; б — дендрограмма 251 штамма Y. pestis с использованием 6 маркерных локусов VNTR: ms04, ms20, ms38, ms40, ms41, ms45. Minimum Spanning tree (MST), программа Bionumerics 7.6.3.

Для визуализации результата использования 6 локусов VNTR (ms04, ms20, ms38, ms40, ms41, ms45) в MLVA анализе для быстрой дифференциации штаммов Y. pestis средневекового биовара, построена дендрограмма методом MST с использованием программы Bionumerics 7.6.3 (см. рис. 3).

На дендрограмме, построенной методом MST, MLVA типы представлены в виде кругов. Размер каждого круга определяется количеством изолятов с данным VNTR генотипом. На дендрограмме (см. рис. 3 а) штаммы сформировали отдельные группы в зависимости от принадлежности к филогенетической ветви или биовару. Большая часть исследуемых изолятов состоит из штаммов Y. pestis средневекового биовара основного подвида. При использовании в MLVA анализе 6 локусов VNTR (ms04, ms20, ms38, ms40, ms41, ms45) (см. рис. 3 б) штаммы средневекового биовара объединяются в отдельный кластер. При этом другие штаммы формируют другие кластеры, которые не воспроизводят порядок эволюции, но кластеризуют штаммы по филогеографической принадлежности и могут использоваться для дифференцирования штаммов средневекового биовара основного подвида от других штаммов Y. pestis.

Таким образом, по результатам проведенного MLVA анализа при исследовании 220 штаммов Y. pestis средневекового биовара, полученных на территории Восточной Европы и Центральной Азии в период 1917—2003 гг., выявлены наиболее эффективные локусы с высокой дискриминационной силой, оказывающие наибольшее влияние на дифференциацию штаммов по генотипам. Для каждого локуса подсчитан индекс аллельного полиморфизма, в качестве интервальной оценки статистического параметра рассчитан доверительный интервал.

По результатам кластерного анализа установлено, что для MLVA типирования штаммов Y. pestis средневекового биовара основного подвида нецелесообразно использовать 12 локусов (ms04, ms20, ms35, ms38, ms40, ms41, ms44, ms45, ms51, ms54, ms69 и ms73) из-за их низкой дискриминационной силы.

По данным MLVA анализа выявлены сходные MLVA генотипы у штаммов, выделенных на смежных территориях. Полученные генотипы коррелируют с местом и временем выделения исследуемых штаммов. Эта особенность позволяет использовать данный метод для кластеризации штаммов, выделенных как внутри одного очага, так и для разделения штаммов, полученных на разных очаговых территориях. Метод MLVA дает возможность проследить микроэволюционную изменчивость Y. pestis в отдельных географических регионах, что может быть полезно для углубленного понимания популяционной структуры Y. pestis в разных очагах чумы, а также для повышения эффективности молекулярно-эпидемиологического мониторинга очаговых по чуме территорий.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.