Бактерии очень быстро размножаются. В богатой питательной среде новое поколение энтеробактерий образуется каждые 20 мин. Поэтому наблюдать за эволюционными преобразованиями в мире бактерий можно непосредственно в процессе их появления. По той же причине главные открытия в области генетики тоже были сделаны на модели бактерий [1—3]. Очень удобным фенотипическим признаком, возникновение которого в бактериальной популяции легко доступно для наблюдения и изучения, является устойчивость бактерий к лекарственным средствам. О бактериях, устойчивых к антибиотикам, мы слышим от врачей, ученых, популяризаторов науки. И последнее время все чаще. Это чрезвычайная проблема. Если в 40—50-х годах прошлого века у людей появилась уверенность в том, что теперь можно справиться с любой инфекционной болезнью, любым послеоперационным осложнением, то с течением времени эта уверенность таяла на глазах. В наши дни стало особенно тревожно. Пандемия COVID-19 так или иначе способствовала бесконтрольному и неоправданному применению антибиотиков, да и объем их использования в сельском хозяйстве не стал меньше. И даже если человек не станет принимать антибиотик без строгих медицинских показаний, он все равно получит его с рыбой, мясом кур или свининой. Более того, подкормка животных антибиотиками способствует появлению в их организмах устойчивых бактерий, которые легко могут заразить человека. В результате появляется все больше клонов бактерий, устойчивых к тому или иному антибиотику. И даже не это самое опасное — появляются клоны, устойчивые ко многим антибиотикам. Это так называемая множественная лекарственная устойчивость (MDR — multi drug resistance). Процесс идет уже давно, и когда свойство MDR приобретают такие бактерии, как возбудители туберкулеза, стафилококки, стрептококки, клебсиеллы или другие опасные бактерии, у врачей возникает естественный вопрос: чем лечить больных. Ответ найти очень непросто и чем дальше, тем сложнее. Для того, чтобы ответить, нужно разобраться в том, как возникает лекарственная устойчивость и почему это происходит. Должен сказать, что этой проблеме посвящены многочисленные и глубокие научные труды. Поэтому рассмотреть все в деталях невозможно, и что-то будет изложено короче и не так глубоко, как хотелось бы.
Многие десятилетия наука открывала, изучала, а медицина использовала новые и новые антибактериальные средства (АБС). Сейчас насчитывается несколько поколений антибиотиков, принадлежащих разным классам. И действуют они не одинаково. Эти различия состоят в том, что антибиотики разных классов поражают внутри бактерии разные мишени. Например, они могут повреждать различные компоненты механизма синтеза белка (белки 30S или 50S субъединиц рибосом)1, компоненты механизма репликации ДНК (топоизомеразы), компоненты синтеза бактериальной оболочки и другие. То есть у антибиотиков есть много способов убить бактерию. А что же бактерии? А у них есть еще больше способов защиты от антибиотиков. При этом нужно понимать, что успешно защитить себя от антибиотика в данный момент времени может не каждая бактерия. На ранней стадии инфекции почти все бактерии чувствительны и погибают от того или другого АБС. В человеческом организме в норме живут миллиарды бактерий. Когда человек инфицирован какими-либо болезнетворными бактериями, последние быстро размножаются, и их количество тоже возрастает до миллиардов. Подходящий антибиотик (тот, к которому эти бактерии чувствительны) может убить почти все из миллиарда или сотен миллионов бактерий, успевших размножиться, но одна, две или три бактерии выживут, станут размножаться несмотря на продолжающееся лечение антибиотиком, наступит рецидив болезни, больному станет хуже, и дальнейшая его судьба будет зависеть от того, какое решение примет врач. Это происходит потому, что выжили и стали размножаться устойчивые к антибиотику бактериальные клетки. А откуда они появились? Дело в том, что когда популяция бактерий достигает численности в сотни миллионов или несколько миллиардов особей, среди них неизбежно появляются единицы, отличающиеся по какому-нибудь признаку от остальных. Это спонтанные мутанты, и признаком отличия может быть устойчивость к антибиотику. Собственно, так и происходит. При этом формирование лекарственной устойчивости может происходить самыми разными способами.
Во-первых, они способны сделать свою оболочку непроницаемой для антибиотика (уменьшение проходимости специальных каналов), то есть закрыть «входную дверь» для лекарства.
Во-вторых, они могут откачать антибиотик из своих клеток, как матросы откачивают воду из трюма судна, получившего пробоину. Это способ называется эффлюкс.
В-третьих, они могут разрушить поступивший внутрь собственной клетки антибиотик с помощью специальных ферментов (например, бета-лактамаз).
В-четвертых, они могут изменить свою собственную мишень, на которую должен подействовать антибиотик, таким образом, что он не сможет ее повредить.
Это неполный набор возможностей, но и его достаточно, чтобы понять, что бактерии прекрасно вооружены и готовы противостоять любому антибактериальному воздействию. Молекулярные механизмы формирования всех перечисленных типов устойчивости известны и хорошо изучены. Практически во всех случаях возникновение лекарственной устойчивости является следствием изменений в генетическом аппарате бактерий. который состоит из обязательного компонента — бактериальной хромосомы, и дополнительных, факультативных структур — плазмид. Плазмиды меньше, чем хромосома, но это тоже ДНК, чаще всего кольцевая. При этом, среди плазмид много таких, которые способны передаваться от клетки к клетке. И хромосома, и плазмиды вносят свой вклад в формирование устойчивости к АБС. Рассмотрим, как бактерии реализуют перечисленные способы приобретения устойчивости.
Изменение проницаемости оболочек. Препятствием для проникновения различных веществ из внешней среды внутрь клетки является клеточная мембрана. Однако для поступления питательных веществ и вывода из клетки продуктов жизнедеятельности предусмотрены пориновые каналы, образованные белками. Эти белки кодируются хромосомными генами. Антибиотики и другие АБС пользуются пориновыми каналами, чтобы попасть внутрь бактерии. Изменение структуры или регуляции генов, кодирующих или регулирующих синтез белков пориновых каналов, может привести к снижению пропускной способности этих каналов и, соответственно, затруднит доступ АБС внутрь клетки.
Эффлюкс. Изначально механизм активного вывода веществ из бактериальной клетки был обнаружен для антибиотиков тетрациклинового ряда, однако, сейчас известно, что диапазон его действия намного шире. Этот активный транспорт обеспечивается белками, организованными в сложные комплексы, работающими, как помпы.
Разрушение антибиотика. Бактериальная клетка может иметь или приобрести гены, которые кодируют ферменты, способные инактивировать определенные антибиотики. Такими ферментами являются, например, бета-лактамазы, разрушающие антибиотики бета-лактамного типа (пенициллины), хлорамфеникол-ацетилтрансфераза, модифицирующая хлорамфеникол (левомицетин, синтомицин), или многочисленные фосфотрансферазы или аденилтрансферазы, модифицирующие аминогликозидные антибиотики (стрептомицин). Перечисленные ферменты чаще всего кодируются плазмидными генами.
Модификация мишени. Это четвертый из перечисленных нами способ, который используют бактерии, чтобы избежать губительного действия АБС. Это очень эффективный способ. Достаточно, чтобы в гене, кодирующем белок-мишень, возникла мутация, которая сделала бы неузнаваемой ту часть белка, которую атакует АБС. Так возникает, например, хромосомная устойчивость к аминогликозидным антибиотикам, аминокумаринам или фторхинолонам. В первом случае модифицируется белок 30S субъединицы рибосом, а во втором и третьем — одна из топоизомераз.
Как уже было сказано, перечисленные примеры не исчерпывают все возможности бактерий. Когда речь идет о мишенях, кодируемых хромосомными генами, то это ее постоянные резиденты. Бактерия не может существовать без хромосомы. Без генов, которые кодируют белки рибосом или топоизомеразы, бактерия тоже не может существовать. Изменения этих генов за счет точковых мутаций приводит к появлению лекарственной устойчивости, но не лишает их продукты функциональной активности. Микроб, обладающий этим фенотипическим признаком, в присутствии антибиотика получает селективное преимущество, а чаще всего не просто преимущество, а возможность существования. Все строго по Дарвину. А как быть с теми генами, без которых бактерии могут жить, т.е. которые не обязательны так, как гены топоизомераз или белков рибосом? Откуда они берутся и как попадают в хромосому или плазмиду? Оказалось, что бактерии умеют приобретать готовые гены и делают это очень эффективно на протяжении миллионов лет.
Процесс интенсивного обмена генетической информацией имеет место у организмов, принадлежащих разным таксонам, но особенно выражен у бактерий. Сейчас этот процесс обозначается термином горизонтальный перенос (в отличие от вертикального, где генетическая информация передается от родителей потомкам). Горизонтальный перенос, как явление, настолько выражен, что древо жизни, представлявшееся нам раньше в виде канонического фрактала, теперь смотрится, как беспорядочная сеть. Все началось в 1944 г., когда Эвери, Маклеуд и Маккарти открыли процесс трансформации — возможность передачи генов у бактерий с помощью свободной ДНК [1]. Несколько позже Ледерберг и Тэйтум открыли у бактерий половой процесс [2]. В этом случае от клетки к клетке передавались так называемые конъюгативные плазмиды, которые захватывали с собой хромосомные гены. Примерно в тот же период времени Циндер и Ледерберг обнаружили, что бактериальные гены могут передавать бактериофаги (вирусы бактерий) [3]. Этот процесс назван трансдукцией. С течением времени стало очевидно, что существует огромное количество разновидностей плазмид, которые курсируют между бактериями и не только «захватывают» с собой хромосомные гены бактерий, но часто изначально содержат в своем геноме те или иные гены. При этом, благодаря свойствам плазмид широкого спектра хозяев, обмен может происходить не только между близкородственными бактериями, но и между бактериями отдаленных видов. То есть помимо набора генов, заключенных в бактериальные хромосомы и характерных для каждого вида бактерий, существует некий пул генов общего пользования, находящихся в плазмидах и доступный бактериям разных таксономических групп. Что это за гены? Это разные гены, но среди них есть те, которые представляют интерес для медицины и медицинской микробиологии прежде всего. Это гены, обеспечивающие бактерий устойчивостью к АБС и кодирующие те или иные признаки вирулентности (болезнетворности), т.е. гены, делающие бактерий особенно опасными для человека. Иными словами, наряду с постоянными обитателями бактериальной хромосомы — генами-резидентами существует диспергированный пул генетических детерминант, которые могут появиться в любой момент в любой бактерии. Какое место они там займут? Поступив в клетку в составе плазмиды, они могут в ней и остаться, но могут переместиться в хромосому и стать резидентами. За счет чего возможна такая миграция? Оказалось, что такие мигрирующие гены перемещаются не сами по себе, не в чистом виде, а в составе специальных мигрирующих элементов — транспозонов. Миграция генов за счет мобильных элементов — плазмид и транспозонов — возможна только в том случае, если бактерии могут непосредственно контактировать друг с другом. Поэтому местами, где MDR-бактерии образуются с наибольшей вероятностью, являются отделения гнойной хирургии, инфекционные больницы и другие места, где плотность бактерий выше обычной. Инфекционные процессы, вызванные такими бактериями, называются нозокомиальными (больничными) инфекциями.
Сейчас известно очень много разновидностей транспозонов. Сначала были открыты транспозоны, содержащие гены устойчивости к АБС, позже транспозоны — носители других генов (например, генов вирулентности). Разные транспозоны построены по-разному, но все имеют одну общую черту — их центральная уникальная часть, в которой находятся гены, окружена повторяющимися нуклеотидными последовательностями, или повторами. Повторы в значительных количествах находятся в геномах и вне транспозонов, то есть сами по себе, могут быть по-разному расположены друг относительно друга и иметь разную длину — от нескольких единиц до нескольких тысяч пар нуклеотидов. Некоторые повторы способны к самостоятельной миграции. Их называют IS-элементами. У разных транспозонов разные нуклеотидные последовательности и размеры повторов. Именно повторы обеспечивают способность к миграции — перемещению транспозонов как между геномами, так и в пределах одного генома.
Наряду с мигрирующими элементами: транспозонами, IS-элементами, трансдуцирующими бактериофагами, конъюгативными и мобилизуемыми плазмидами существуют еще один тип, точнее типы, генетических структур, которые самым непосредственным образом участвуют в горизонтальном переносе генов вообще и в распространении генов устойчивости к АБС в частности. Это интегроны и суперинтегроны. Они представляют собой сложные и во многом загадочные образования, входящие в состав геномов бактерий самых разных видов: Vibrio, Shewanella, Pseudomonas, Geobacter, Treponema, Nitrosomonas, Xanthomonas и др.[4—6 ]. Интегрон, содержащий кассету, представляет собой участок ДНК генома, в состав которого входят сайт интеграции attI (место для внедрения, сайт мишени), генная кассета или несколько кассет, промотор (участок с которого считываются гены кассет), ген интегразы IntI (фермента, осуществляющего рекомбинацию) со своим промотором. Таким образом, интегрон — это стационарная платформа для приобретения, хранения, считывания и последующего распространения самых разных генов.
Автономные генные кассеты это не реплицирующиеся кольцевые ДНК, состоящие из гена, объединенного с сайтом интеграции attC (место для внедрения, в attI-сайт интегрона). Сайты attC могут отличаться по размеру (от 57 до 141 п.н.) но всегда ограничены противоположно ориентированными повторами около 25 п.н. Генные кассеты у бактерий разных видов тоже отличаются друг от друга. Более того, в бактериях одного вида с одним и тем же сайтом attC могу быть объединены разные гены лекарственной устойчивости.
Гены, входящие в состав кассет, обычно не активны сами по себе, так как не имеют своего промотора, а начинают считываться, только попав в интегрон, и используя его резидентный промотор. Для того, чтобы кассета с геном или генами смогла внедриться в платформу интегрона, фермент интеграза должен узнать некие последовательности нуклеотидов как в сайте кассеты attC, так и в сайте платформы attI, связаться с ними и осуществить рекомбинацию.
Интегроны, обнаруживаемые в плазмидах, содержат кассеты с генами устойчивости к антибиотикам [4]. К настоящему времени в составе кассет было найдено около 70 генов устойчивости к большинству известных антибиотиков [7, 8].
Наконец, еще одним важнейшим элементом в составе интегронов являются гены Int, кодирующие интегразы — ферменты рекомбинации. Предполагается, что предшественниками современных интегронов, содержащих генные кассеты, могли быть более древние хромосомные интегроны, которые вовсе не содержали кассет, а состояли только из сайтов attI и генов интеграз (IntI). Эти сайты вместе с генами IntI могли быть захвачены транспозонами и перенесены на плазмиды [7—9]. Впоследствии они могли остаться в составе плазмид или попасть в те или иные сайты хромосомы за счет транспозиции. Поскольку интегразы обладают свойствами рекомбиназ сайт-специфической рекомбинации они, скорее всего, являются производными Int-белков умеренных фагов [7—9]. Таким образом, интегроны собирались по частям постепенно. Расчет, сделанный на основании частоты нуклеотидных замен, показал, что этот процесс начался несколько сотен миллионов лет назад [9], то есть очень задолго до наступления эры антибиотиков.
Наряду с интегронами существуют более крупные образования, названные суперинтегронами [4, 7]. Они локализованы в хромосомах и содержат кроме кассет с генами устойчивости к АБС, множество кассет с генами метаболизма и вирулентности.
Процессы внедрения транспозона в какое-либо место генома или генной кассеты в сайт интегрона являются актами рекомбинации. Рекомбинация — это объединение сегментов ДНК. Существуют различные типы рекомбинации: гомологическая, сайт-специфическая и незаконная. При горизонтальном переносе, т.е. наследовании клеткой неродственной генетической информации, судьба привнесенной ДНК может быть различной: она может быть унаследована в автономном состоянии (если передана с плазмидой), либо внедриться в хромосому при передаче с помощью плазмиды, бактериофага или трансформирующей ДНК. Интеграция в хромосому всегда происходит за счет того или иного типа генетической рекомбинации. Мы подошли к очень важному моменту: ни один тип генетической рекомбинации не происходит без участия повторов. Мы видели это на примере транспозиции (это незаконная рекомбинация), но и сайт-специфическая рекомбинация, например, внедрение кассеты в сайт интегрона и гомологическая рекомбинация тоже обеспечиваются повторами. Иногда повторы присутствуют и в донорном сегменте ДНК (как, например, в составе транспозонов или attC-сайтов кассет), но они всегда есть в сайте интеграции. То есть, возможность внедрения в ДНК любого нового фрагмента всегда определяется наличием повторов в сайте внедрения. При этом, какой именно ген (фрагмент) может внедриться, зависит от того, какие повторы находятся в потенциальном сайте внедрения. Получается, что геном-реципиент сам отбирает ту информацию, которую он готов принять. Автор назвал этот первичный отбор будущих резидентов генома полинуклеотидным выбором (Пн-выбор) [10].
Теперь представим себе, что фрагмент ДНК, содержащий некий ген, встроился в хромосому. Если информация, закодированная в этом гене, полезна для клетки в данных условиях, такая клетка будет иметь некоторое преимущество перед другими, будет успешно размножаться и, таким образом, сохранит приобретенный ген. То есть важнейшей гарантией сохранения новой информации является востребованность ее фенотипического проявления, полезность в данных условиях. Это естественный отбор. А что будет, если новый ген оказался бесполезным и на протяжении длительного времени так и не пригодился клетке? По логике школьного учебника он должен быть утрачен геномом, как лишний груз. Однако этого не происходит. Геномы содержат значительное количество поврежденных генов, частей генов (их называют псевдогенами), и сохраняют их тысячелетиями. Было подсчитано что ориентировочное время полужизни ненужного гена составляет 50 млн лет [11]. В то же время, есть участки ДНК, которые содержат вполне полноценные гены, но спонтанно удаляются из генома с высокой вероятностью (10-4 — 10-3 на клетку) [12]. И снова все зависит от контекста самого генома. Оказалось, что нестабильность участка генома определяется наличием повторов, окружающих этот участок. Делециям (то есть выпадениям генов из генома) способствуют прямые повторы. Если ген не востребован, но не окружен прямыми повторами, клеткам данного штамма придется подождать миллионы лет, чтобы от него освободиться.
Итак, повторы нужны не только для внедрения в геном нового фрагмента ДНК, но и для удаления из генома того или иного участка. Сами же повторы скорее всего возникают в ходе репликации ДНК [13,14]. Обычно репликация происходит безошибочно, но один тип «ошибок» — генерацию повторов она производит регулярно. При этом повторяются не какие-то определенные нуклеотидные последовательности, а различные и разной протяженности. Более того, в бактериях разных видов репертуар повторов отличается, т.е. получается, что эти ошибки репликативного комплекса не случайны, а видоспецифичны [15]. Кроме того, поскольку повторы присутствуют во всех геномах от бактерий до человека, их приходится считать необходимым атрибутом генетической информации вообще. То есть любая генетическая программа генерирует, а любой генетический текст содержит повторы.
Повторы, которые мы здесь рассматриваем, как правило, не кодируют признаков, влияющих на фенотип клетки. Длинные повторы полноценных IS-элементов кодируют транспозазы, необходимые для их собственной миграции, но это внутренние процессы генома, которые чаще всего никак не сказываются на фенотипе, а значит не видимы для естественного отбора. Собственно, повторы любого типа, изобилующие в геномах бактерий разных видов, сами по себе никак не влияют на фенотип, но тем не менее стабильно присутствуют в ДНК. То же можно сказать и о компонентах интегронов. Пока в интегрон не попала кассета с геном устойчивости к АБС или иным геном, влияющим на фенотип, ни одна из частей интегрона не сказывается на свойствах бактерии. Следовательно, естественный отбор не может «видеть», чем занимается бактерия, собирающая платформу интегрона несколько сотен миллионов лет, и не может влиять на этот процесс. Что же тогда влияет, что направляет и руководит?
Мы уже говорили о том, что без повторов нет рекомбинации, а без рекомбинации в геноме не появятся новые гены. Геномы бактерий различных видов отличаются друг от друга наборами своих повторов [10, 15]. Это означает, что внедрение посторонней ДНК в геномы бактерий разных видов будет происходить с разной вероятностью и в разные предпочтительные сайты в зависимости от типа присутствующих в геноме повторов и их локализации. Отсюда следует, что и сама возможность поступления гена в геном реципиента, и место, куда с определенной вероятностью внедрится новый фрагмент ДНК, зависит от распределения в этом геноме повторяющихся последовательностей. Важно то, что это распределение никоим образом не зависит от внешней среды, то есть не подвержено естественному отбору. Однако работает другой отбор — Пн-выбор, в ходе которого контекст генома реципиента выбирает, какой фрагмент ДНК стоит включить в свой состав и в какое место его определить. Это начальный этап эволюции генома. Последующие этапы попадут под контроль обычного естественного отбора. А это означает, что естественный отбор действует, опираясь на те фенотипические признаки, которые кодируют гены, в свое время получившие «въездную визу» от контекста самого генома.
Заключение
Таким образом, эволюция оперирует двумя видами отбора: начальный полинуклеотидный выбор оперирует на уровне генома и определяет его структуру, последующий классический естественный отбор действует через фенотип и закрепляет в популяции признаки, благоприятствующие фитнесу (приспособленности к условиям окружающей среды) определенного организма.
Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.
1Автор умышленно не ссылается на литературные источники, когда в тексте используются обозначения базовых понятий и процессов, таких как хромосома, плазмида, конъюгация, мутация, транспозиция и т.п,. так как при желании читатель может получить необходимую информацию в учебниках или в сети.