Введение

Несмотря на соблюдение правил асептики и антисептики и использование новых антисептических средств, обладающих высоким бактерицидным действием, инфекционно-воспалительные осложнения до сих пор являются серьезной проблемой в медицине. Большинство ран полностью заживают при минимальном вмешательстве, но в 10—20% случаев происходит инфицирование, представляющее серьезный риск для здоровья пациентов [1]. Колонизация раны бактериями начинается почти сразу после травмы и обычно происходит с участием условно-патогенных бактерий из окружающей среды или бактерий собственного микробиома пациента [2, 3]. Инфекционные агенты нередко способны к образованию бактериальных биопленок в раневом ложе. Биопленки представляют собой сложные бактериальные сообщества, погруженные в матрикс из экзополимерных веществ, и демонстрируют отличающуюся по сравнению с планктонными клетками физиологию и измененную экспрессию генов [4—6]. Эти свойства биопленок делают их устойчивыми к факторам окружающей среды и иммунитета хозяина, а также значительно снижают восприимчивость к антибиотикам.

Одной из возможных альтернатив использованию антибиотиков рассматриваются наночастицы (НЧ) металлов с выраженными антибактериальными свойствами [7]. НЧ вызывают быстрое повреждение клеток, нарушая целостность клеточной мембраны, создавая окислительный стресс и вызывая апоптоз клеток-мишеней. Один из механизмов разрушения бактерий наночастицами основывается на токсическом действии активных форм кислорода, генерирующихся на поверхности наночастиц. Энергия активных форм кислорода, генерируемых на поверхности наночастиц в первые секунды формирования наночастиц, в несколько раз превышает энергию основного состояния. Основное энергетическое состояние кислорода — триплетное. Это состояние соответствует наименьшему уровню молекулярной энергии. В моменте формирования наночастиц электроны могут остаться на разных орбиталях, но иметь разные спины, или же попасть на одну орбиталь. Такие положения соответствуют первому и второму синглетным состояниям. Они превышают энергию основного состояния на 95 кДж/моль (22.5 ккал/моль) и 158 кДж/моль (31.5 ккал/моль) соответственно. В первом синглетном состоянии время жизни молекулы составляет от 40 до 72 мин, а во втором — 7.1 с. Соответственно на поверхности наночастиц металлов активные формы кислорода сохраняются примерно в течение часа, не более. Эти состояния являются неустойчивыми, так как кислород стремится вернуться в основное состояние. Наша исследовательская группа получает наночастицы металлов методом лазерной абляции [8—10]. Этот способ позволяет синтезировать стабильные наночастицы металлов и не требует использования блокирующих и стабилизирующих агентов или восстановителей. При лазерной абляции мишень облучается лазерным пучком, плотность энергии которого превышает порог абляции вещества, происходит непосредственно удаление материала с поверхности мишени в виде плазменного факела. Завершающим этапом является затухание плазменного факела, после чего метастабильные фазы аблированного вещества «замерзают», тем самым синтезируя наночастицы [11]. Нами разработан метод прямого лазерно-индуцированного переноса наночастиц, который показал высокое антимикробное и антибиопленочное воздействие в экспериментах in vitro. Такой метод позволяет использовать наночастицы металлов практически с первых секунд формирования и в разы увеличить их антимикробные свойства.

В нашей работе использована ex vivo модель раневой инфекции, сформированной на коже свиньи. Такая модель хорошо подходит для изучения образования биопленок на ранней стадии и методов борьбы с ними. В результате проведенных исследований продемонстрирован потенциал местного аппликационного лечения ран, инфицированных клинически значимыми бактериями Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii и Pseudomonas aeruginosa.

Материал и методы

Бактерии и условия роста. Материалом для исследований служили микроорганизмы IV группы патогенности входящие в группу «ESKAPE»: Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и E.coli. Бактериальные культуры получены из рабочей коллекции лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов ФГБУ НИЦЭМ им Н.Ф. Гамалеи.

Бактериальные культуры выращивали на жидкой и твердой (1,5%) среде Luria-Bertani (LB), используя стандартные сухие питательные среды, выпускаемые фирмой Дифко (США) и на триптон-соевом бульоне (TSB), фирмы Panreac, Испания.

Сбор и хранение свиной кожи. Для экспериментов ex vivo была приобретена реберная часть свиной туши со шкуркой. Кожу отделяли, очищали теплой водой и дезинфицировали 70%-м этанолом. Далее высушивали стерильной марлей и делили на фрагменты размером примерно 5×10 см, используя хирургический скальпель. Фрагменты кожи были упакованы в стерильные пластиковые пакеты и хранились в морозильнике при -20 °C. Замороженные фрагменты свиной кожи размораживали при комнатной температуре в течение 10 мин. С помощью скальпеля из-под кожи удаляли излишки жировой ткани, а нижнюю поверхность разглаживали для получения равномерной толщины кожи. Далее с помощью стерильного 8-миллиметрового пункционной биопсионного медицинского инструмента вырезали фрагменты диаметром 8 мм переносили в стерильную посуду (рис. 1, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_03_039_add.zip).

Моделирование инфекции на поверхности кожи. Образцы кожи диаметром 8 мм помещали в стерильную чашку Петри и в центр фрагмента вносили по 20 мкл 1·10⁸ КОЕ/мл бактерий. Образцы оставляли при комнатной температуре до полного высыхания и далее обрабатывали наночастицами металлов. На контрольные образцы наночастицы не наносили.

Моделирование биопленки на свиной коже. На фрагменты кожи диаметром 8 мм наносили неглубокие царапины размером 3—5 мм (имитировали рану) и помещали в стерильный культуральный планшет на 24 лунки по одному в каждую лунку. Далее в центр каждого фрагмента кожи помещали по 20 мкл 10⁷ КОЕ/мл бактериальной культуры. Для поддержания влажности тканей в пустые лунки вносили стерильную воду. Чтобы предотвратить испарение, крышку планшета герметично фиксировали с помощью гибкой ленты «Parafilm M», переносили в термостат и инкубировали при температуре 37 °C в течение 72 ч.

Обработка наночастицами. Инфицированные фрагменты свиной кожи переносили на стерильные предметные стекла, помещали под лазерный аппарат и напыляли наночастицами металлов Ag, Cu, Zn и Au. Время экспозиции наночастиц — 5 мин. Контрольные образцы не обрабатывали.

Генерация наночастиц. Для получения наночастиц использовались металлические пленки, которые предварительно были подготовлены методом магнетронного напыления в атмосфере аргона. Толщина пленок составляла 100 нм. Генерация наночастиц производилась методом лазерно-индуцированного прямого переноса (рис. 2, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_03_039_add.zip). Использовали лазер HTF MARK («Булат», Россия) с длиной волны 1064 нм, длительностью импульса 120 нс, частотой следования импульсов 20 кГц. Сканирование производили со скоростью 1000 мм/с, плотность энергии при этом составляла 28 Дж/см². Средний размер частиц варьировал от 80 до 250 нм.

Анализ количества жизнеспособных бактерий. Для количественного определения жизнеспособных бактерий, фрагменты кожи, обработанные наночастицами переносили в стерильные пробирки с 2 мл NaCl 0,9%. Затем пробирки с образцами 10 мин активно встряхивали на лабораторном вортексе. Далее методом серийных разведений и высева на чашки Петри определяли количество бактерий в смывах. Чашки Петри инкубировали при температуре 37 °C в течение18 ч, а затем подсчитывали выросшие колонии и определяли КОЕ/мл.

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Визуализация фрагментов свиной кожи до и после воздействия на нее наночастиц меди производилась с помощью сканирующего электронного микроскопа Tescan Vega (Tescan, Чехия). Для анализа использовался режим низкого вакуума (7 Па).

Флюоресцентная микроскопия — окрашивание методом LIVE/DEAD. Исследование проводили в микроскопе Nikon H600L (Eclipse Ni, Япония) с увеличением объектива Х40. Образцы биопленок окрашивали набором флуоресцентных красителей (SYTO 9 и propidium iodide) Live/Dead Biofilm Viability Kit (ThermoFisher, USA) согласно инструкции.

Результаты и обсуждение

Ранее разработанный нашим коллективом метод прямого лазерно-индуцированного переноса наночастиц металлов, показал высокое антимикробное и антибиопленочное воздействие в экспериментах in vitro. Но результаты работы in vitro сложно экстраполировать на биологию живого организма. Более достоверными клиническими результатами могут обеспечить исследования, проведенные на моделях животных. In vivo модели значительно улучшают понимание инфицирования и формирования раневой биопленки. Наиболее схожей морфологией с человеческой кожей обладает свиная кожа. Свиные in vivo модели обеспечивают наилучшее представление о коже человека и заживлении ран. Однако их использование зависит от этических и экономических соображений. Использование животных моделей для первоначальных исследований трудно оправдать как с этической, так и с финансовой точки зрения. В нашей работе мы использовали ex vivo модель раневой инфекции на коже свиньи. Такая модель имеет относительно высокую производительность, низкую стоимость и хорошо подходит для изучения и оценки образования биопленок на ранней стадии. Такая модель хорошо имитирует процесс формирования биопленок в раневом ложе.

Целью проведенных исследований являлось показать эффективность использования метода прямого лазерно-индуцированного переноса наночастиц металлов на сформированные биопленки в экспериментах ex vivo.

На первом этапе исследований была проведена сканирующая электронная микроскопия, которая позволяет визуализировать морфологию кожи свиньи, сформированную бактериальную биопленку на его поверхности и результат напыления наночастиц. Для этого свежую суточную бульонную культуру Pseudomonas aeruginosa разводили в 100 раз и разливали по стерильным пробиркам по 3 мл. Далее фрагменты кожи диаметром на 8 мм погружали в пробирки и инкубировали термостате при температуре 37 °C в течение 48 ч для формирования биопленок. Образцы аккуратно переносили на предметные стекла и на поверхность кожи напыляли наночастицы. Генерация наночастиц производилась методом лазерно-индуцированного прямого переноса. Использовался лазер HTF MARK («Булат», Россия). Нанесение наночастиц на поверхность занимала примерно 5—30 с. Температура поверхности кожи в процессе эксперимента не превышала 35 ^оС.

Была проведена сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) участка чистой свиной кожи, кожи с биопленкой, а также образцов кожи с биопленкой обработанных наночастицами. Результаты представлены на рис. 3 (см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_03_040_add.zip).

Эпидермис в свиных шкурах довольно толстый. Мощный эпидермис своими выступами проникает глубоко в дерму и это придает поверхности кожи своеобразный рисунок. Проведенные микроскопические исследования показали, что поверхность чистой свиной кожи сравнительно однородна, с характерным рисунком, без признаков слизи (см. рис. 3, а). Образец, который инкубировали в бульонной культуре 48 ч, имеет рыхлую поверхность с ярко выраженной слизью. Рисунок поверхности отличается. Такая структура характерна для сформированной биопленки. При более высоких увеличениях под слизью визуализируются скопления морфологических единиц сходных по форме и размеру бактериям (см. рис. 3, б). Образец чистой кожи, обработанный наночастицами меди, сохраняет характерный рисунок без видимых повреждений поверхности. Это указывает на то, что наночастицы не повреждают кожу термически или механически. При более высоких увеличениях видны наночастицы сферической формы (см. рис. 3, в). Образец кожи, который инкубировали в бульонной культуре 48 ч и далее обрабатывали наночастицами, имеет менее выраженную в сравнении с образцом (см. рис. 3, б) слизистую поверхность. На данном образе практически не визуализируются морфологические единицы, похожие на бактерии, но при этом хорошо видны наночастицы (см. рис. 3, г). При энерго-дисперсионной рентгеновской спектроскопии (ЭДРС) получены подтверждения присутствия меди на образцах, которые подвергались прямому переносу наночастиц меди (см. рис. 3, б, г).

Известно, что колонизация раны бактериями начинается почти сразу после травмы. Для оценки антибактериальных свойств наночастиц металлов, на поверхности кожи было смоделировано инфекционное заражение микроорганизмами: Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii и Pseudomonas aeruginosa. Для этого образцы кожи помещали в стерильную чашку Петри и в центр фрагмента вносили по 20 мкл 1·10⁸ КОЕ/мл бактерии. Образцы оставляли при комнатной температуре до полного высыхания и затем напыляли наночастицами серебра, меди, цинка и золота. Образцы переносили в пробирки с NaCl 9% и активно встряхивали на лабораторном вортексе в течении 10 мин. Далее методом серийных разведений определяли количество бактерий в смывах. Контролем служили инфицированные образцы необработанные наночастицами. Полученные результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1. Оценка антибактериальных свойств наночастиц металлов, нанесенных на планктонные формы микроорганизмов, инфицирующих поверхность свиной кожи

При проведении исследований получены данные, что наночастицы металлов серебра, меди и цинка проявляют высокие антимикробные свойства и вызывают практически полную гибель бактерий. Полученные нами наночастицы золота такими свойствами не обладают. При этом нужно отметить — формы, размеры и температура наночастиц в процессе формирования (напыления) практически одинакова для всех полученных нами НЧ. Известно, что молекулярные формы кислорода, адсорбированные на поверхности наночастиц золота, обладают крайне низкой реакционной способностью окисления. Мы можем предположить, что выраженные антимикробные свойства наночастиц связаны с окислительными свойствами активных форм кислорода, которые активно генерируются на поверхностях наночастиц меди, серебра и цинка на ранних сроках формирования частиц. Метод прямого аппликационного переноса наночастиц металлов меди, серебра и цинка является высокоэффективным методом для обеззараживания инфицированной поверхности.

Микроорганизмы, вызывающие инфекции, нередко способны к образованию бактериальных биопленок в раневом ложе. Биопленки представляют собой сложные бактериальные сообщества, устойчивые к факторам окружающей среды и иммунитета хозяина. На сегодняшний день актуальной задачей является разработка мер против биопленок, которые воспроизводимы в клинических условиях и могут быть внедрены в безопасную клиническую практику. Для выполнения этой задачи мы создали ex vivo модель раневой биопленочной инфекции на коже свиньи. Для этого на фрагменты кожи свиньи одинакового размера наносили неглубокие царапины (имитировали рану) и в центр каждого фрагмента наносили бактериальную культуру. Далее образцы помещали в стерильный культуральный планшет (по одному в каждую лунку) и инкубировали в термостате при температуре 37 °C в течение 72 ч. Для сохранения влажности планшет герметично фиксировали с помощью гибкой ленты «Parafilm M». После формирования биопленок свиную кожу аккуратно переносили на предметные стекла и обрабатывали наночастицами меди, серебра и цинка. Контрольные образцы биопленок наночастицами не обрабатывали. Далее образцы помещали в пробирки с NaCl 9% и активно встряхивали на лабораторном вортексе в течение 10 мин. Количество бактерий в смывах определяли методом серийных разведений. Контролем служили инфицированные образцы, не обработанные наночастицами. Результаты исследования представлены в табл. 2.

Таблица 2. Оценка антимикробного воздействия наночастиц металлов на биопленки, сформированные на коже свиньи

В процессе формирования биопленки микроорганизмы колонизируют не только поверхность кожи и раневого ложа, а также активно размножаются в поврежденных тканях, глубоко внедряются в здоровые ткани. Воздействовать на микроорганизмы находящихся в более глубоких слоях биопленок очень сложно. Состав, структура и плотность матрикса биопленок влияют на окислительные свойства наночастиц. Мы можем предположить, что наночастицы металлов активно действуют на верхние слои биопленок, что приводит к гибели подавляющего количества микроорганизмов. Проведенные исследования показали, что однократная обработка инфицированной раны наночастицами металлов серебра, меди и цинка вызывает гибель микроорганизмов в сформированной за 72 ч биопленке на 5—6 порядков. Такой результат воздействия наночастиц является клинически выраженным и перспективным в лечении инфицированных ран.

Результаты микробиологических исследований воздействия наночастиц металлов на биопленки, сформированные на поверхности кожи свиньи, подтвердились проведенными микроскопическими исследованиями. Исследование проводили при помощи флуоресцентного микроскопа Nikon H600L (Eclipse Ni, Япония). Образцы биопленок, сформированных на поверхности кожи, окрашивали набором флуоресцентных красителей SYTO 9 и propidium iodide согласно инструкции производителя. Микрофотографии представлены на рис. 4 (см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_03_041_add.zip).

Этот метод исследования позволяет выявлять живые и мертвые клетки бактерий. Живые бактерии флюоресцируют зеленным цветом, а мертвые — красным. На полученных микрофотографиях образцов хорошо видна структура кожи. Поверхность с неоднородным рельефом, бактерии на поверхности распределены не однородно. Визуализируются участки, где интенсивность флуоресценции более высокая, что указывает на более плотные скопления микроорганизмов. На фото контрольного образца (см. рис. 4, а) преобладает зеленый цвет. Это указывает на то, что микроорганизмы на поверхности кожи живые. Образцы кожи, обработанные наночастицами, флюоресцируют красным цветом с незначительными включениями зеленого, что соответствует результатам микробиологических исследований.

Заключение

Метод получения наночастиц сильно влияет не только на свойства наноструктуры, но и на время ее жизни — то есть период, в течение которого частица способна проявлять уникальные свойства. По истечении определенного срока наночастицы либо окисляются, либо агрегируются в микрочастицы. Предложенный нами метод является принципиально новым подходом в лечении раневых инфекций. Генерация (получение) наночастиц металлов непосредственно на зараженной поверхности позволяет полностью раскрыть весь антимикробный потенциал наночастиц металлов. Активные формы кислорода, которые формируются на поверхности наночастиц в первые секунды их генерации, являются одним из основным фактором токсичности. Наночастицы, полученные методом лазерной абляции, являются экологичными, так как не требует использования блокирующих и стабилизирующих агентов или восстановителей. Проведенные эксперименты показали, что метод прямого переноса наночастиц металлов является высокоэффективным методом для аппликационного обеззараживания инфицированной поверхности раны. Такой метод может стать новой стратегией борьбы с раневыми инфекциями, для обеспечения хорошего клинического результата.

Финансирование. Работа поддержана Министерством науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение № 075-15-2023-603).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.