Введение

Распространение множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) среди бактерий рассматривается как глобальный кризис, угрожающий устойчивому развитию человечества и здравоохранения во всем мире [1]. Во всем мире регистрируется высокий уровень случаев туберкулеза, вызванных возбудителями с МЛУ. Наибольшую опасность представляет распространение устойчивости к наиболее эффективным противотуберкулезным препаратам — изониазиду и рифампицину, когда, дополнительно к МЛУ, возбудитель туберкулеза устойчив к препаратам, являющимся основой современной комплексной терапии лекарственно устойчивого туберкулеза (ТБ) — к фторхинолонам и одному из инъекционных препаратов второго ряда, а с 2021 г. — с МЛУ и дополнительно устойчивостью к одному из фторхинолонов, а также к линезолиду и бедаквилину [2—4]. Россия внесена ВОЗ в список стран с высоким бременем МЛУ-ТБ [4]. В последние годы в России отмечается рост доли случаев МЛУ-ТБ среди впервые выявленных пациентов с туберкулезом органов дыхания: 28,2% в 2017 г., 31,8% — в 2018 г. и 32,8% в 2019 г. [5].

Актуальность проблемы резистентности возбудителя ТБ Mycobacterium tuberculosis (МБТ) к противотуберкулезным препаратам (ПТП) индуцировала широкие исследования механизмов их действия и возникновения у возбудителя заболевания резистентности к ним. Данные о мутациях, приводящих к устойчивости МБТ к ПТП, постоянно расширяются и пересматриваются. В последнее десятилетие были разработаны и внедрены в клиническую практику новые ПТП с оригинальными механизмами действия и высокой клинической эффективностью. В обзоре приведены новейшие данные о механизмах резистентности как давно применяемых ПТП, так и новейших препаратов, о находящихся на этапах доклинических и клинических испытаний веществах с противотуберкулезной активностью, а также о мутациях, которые с высокой вероятностью связаны с резистентностью возбудителя к ПТП.

Механизмы резистентности к ПТП и мутации, ассоциированные с устойчивостью к ним

Наличие мутаций, приводящих к снижению жизнеспособности бактериальной клетки, неблагоприятно для бактерии. Однако, если среди случайно возникающих мутаций появляется дополнительная, уменьшающая неблагоприятные последствия первой, потомки такой бактериальной клетки получат преимущества при выживании и распространении. Примером такой компенсирующей мутации у M. tuberculosis является ahpC мутация. У некоторых бактерий появление мутации ahpC на фоне katG мутации приводит к активации другого механизма защиты от пероксидного стресса — фермента щелочная гидроксид пероксидаза (мутация ahpC приводит к повышению экспрессии гена, кодирующего синтез этого фермента). Микобактерии, имеющие katG и ahpC мутации, приобретают устойчивость и к изониазиду, и к окислительному стрессу в фагосомах [6—8].

Другим примером компенсаторных мутаций может быть положительное влияние второй мутации в гене 16S рРНК, приводящей к стабилизации вторичной структуры этого компонента бактериальной рибосомы. Мутации, приводящие к устойчивости микобактерий к аминогликозидам, вызывают нарушение вторичной структуры 16S субъединицы бактериальной рибосомы, негативно влияя на ее функционирование. Вторая мутация может исправить этот дефект. Необходимо отметить, что и ahpC мутация, и мутации, стабилизирующие 16SрРНК, редко встречаются в клинических образцах. Значительно чаще выявляются компенсаторные мутации в генах M. tuberculosis, кодирующих РНК-полимеразу. Эти мутации локализуются в генах, кодирующих α- и β’-субъединицы РНК-полимеразы (гены rpoA и rpoC), и повышают жизнеспособность rpoB мутантов (с измененной структурой β-субъединицы РНК-полимеразы), устойчивых к действию рифампицина. Доля таких мутантов среди клинических изолятов M. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью достигает 30% [9]. Однако у микобактерий туберкулезного комплекса механизм горизонтального переноса генов отсутствует. Возникновение лекарственной устойчивости у этих микроорганизмов происходит только в результате накопления мутаций [10—12].

Ингибиторы транскрипции

Рифамицины

Рифампицин (рифампин) и его аналоги с различными заместителями в макроциклической структуре — рифамбутин и рифампентин, являются полусинтетическими аналогами природного антибиотика рифамицина SV, продуцируемого бактериями Amycolatopsis rifamycinica, антибиотиками широкого спектра действия, оказывающими бактерицидное действие на активно делящиеся микобактерии (микобактерии туберкулезного комплекса, нетуберкулезные микобактерии и M. lepra) [13].

Мишенью действия рифамицинов является β-субъединица ДНК-зависимой РНК-полимеразы, кодируемая геном rpoB, результатом ингибирования которой является остановка процесса транскрипции генов. В 95% случаях резистентность клинических изолятов МБТ к рифамицинам определяет сравнительно небольшой участок ДНК, получивший обозначение RRDR (rifampicin resistance determining region). Мутации в RRDR приводят к различным уровням резистентности: в кодонах 526 и 531 — к резистентности высокого уровня ко всем рифамицинам (минимальные ингибирующие концентрации МИК >32,0 мг/л для рифампицина), в кодонах 511, 516, 518 и 522 — к низкому уровню резистентности к рифампицину и рифапентину (МИК <20 мг/л для рифампицина) при возможном сохранении чувствительности к рифабутину [14]. В незначительной части случаев резистентность к рифамицинам связана с мутациями в других участках гена rpoB [15].

Описаны компенсаторные мутации МБТ, способствующие восстановлению жизнеспособности МБТ с измененной РНК-полимеразой при сохранении их резистентности к рифампицину, локализующиеся в генах, кодирующих α- и β’-субъединицы РНК-полимеразы (гены rpoA и rpoC). Частота встречаемости компенсаторных мутаций в rpoA и rpoC генах среди клинических изолятов МБТ с МЛУ достигает 30% [16, 17].

Синтез клеточной стенки

Производные изоникотиновой кислоты

Среди ПТП три препарата относятся к производным изоникотиновой кислоты: препарат первого ряда изониазид и препараты второго ряда — тионамиды (этионамид и протионамид) [3, 13].

Изониазид

Изониазид — один из наиболее активных ПТП, вместе с рифампицином является основой режима химиотерапии больных туберкулезом, вызванным микобактериями, не имеющими устойчивости к этому препарату или МЛУ. Изониазид оказывает бактерицидное действие на делящиеся клетки МБТ и бактериостатическое — на неделящиеся [3, 12, 18].

Изониазид является гидразидом изоникотиновой кислоты и структурным аналогом никотинамида (витамина PP), входящего в состав никотинамиддинуклеотида (НАД) — кофермента оксидаз, участвующих в переносе химических групп при синтезе высокомолекулярных липидов, гликолипидов и гликопептидов, в том числе при росте цепей миколовых кислот в клетках МБТ [11, 18]. Изониазид является пролекарством и модифицируется в активную форму при участии фермента чувствительных к нему МБТ каталазы-пероксидазы, кодируемой katG геном. Продукт преобразования изониазида неизвестен. Предполагают, что это изоникотиновая кислота [18, 19]. Активированный изониазид (но не сам изониазид) прочно связывается с НАДН-зависимой редуктазой белка-переносчика эноил-ацильного остатка (enoyl-acyl carrier protein — ACP) и с НАДФН-зависимой оксо-ацил ACP редуктазой, участвующими в удлинении жирных кислот микобактерий. Редуктазы кодируются генами inhA и fabG1(mabA) [20]. Активированная форма изониазида связывается с никотинамидом, входящим в состав НАД и НАДФ, в активном центре фермента, что приводит к его ингибированию [19—21]. В результате, в микобактериальной клетке происходит нарушение синтеза миколовых кислот — основных составляющих клеточной стенки и одного из факторов патогенности МБТ — корд-фактора.

Устойчивость микобактерий к изониазиду возникает в результате нарушения образования активного вещества в результате мутационного повреждения фермента каталазы-пероксидазы (мутации в области katG) или в результате уменьшения числа его молекул (мутации в области furA katG). Такие мутации приводят к различным уровням резистентности микобактериальных клеток к изониазиду. МИК мутантных вариантов увеличивается в 10—5000 раз [13, 16].

Утрата каталазы-пероксидазы приводит к снижению жизнеспособности МБТ в условиях пероксидного стресса внутри фагосомы макрофага. Компенсаторные мутации позволяют снизить негативный эффект от мутации в katG: мутации в промоторной области ahpC гена приводят к активации oxiR- ahpC регулона и повышают экспрессию ahpC гена, кодирующего фермент щелочную гидроксидпероксидазу, что восстанавливает жизнеспособность МБТ в фагосомах [6—8]. У 8,9% штаммов МБТ, несущих мутации в katG, встречаются компенсаторные мутации, восстанавливающие способность бактериальной клетки к защите от окислительного стресса — мутации в oxiR-ahpC регулоне [6, 7, 8, 17].

Мутационное изменение ферментов-мишеней — ACP-редуктаз, снижающее сродство активированного изониазида к активному центру фермента без изменения его редуктазной активности — мутации inhA или fabG1 (mabA), также приводит к резистентности МБТ к изониазиду [3, 20—22]. Гены inhA или fabG1 (mabA) входят в один общий оперон. Суммарная доля мутаций в ДНК МБТ, устойчивых к изониазиду, в области inhA или fabG1 (mabA) не превышает 10—15%, все они приводят к устойчивости к изониазиду низкого уровня [22, 23].

Тионамиды

К тионамидам — производным изоникотиновой кислоты — относятся два близких по структуре препарата второго ряда — этионамид и протионамид. Эти два препарата близки по своей структуре и, предположительно, по механизмам действия, поэтому данные о механизме действия и мутациях, ассоциированных с устойчивостью к ним, в публикациях приводятся, в основном, для этионамида. Этионамид так же, как и изониазид, является пролекарством. Однако в его активации участвует не каталаза-пероксидаза, а монооксидаза, кодируемая геном ethA. Как и в случае изониазида, формула активированного этионамида неизвестна. Можно предположить, что и в этом случае активным веществом также является изоникотиновая кислота. Мутации в генах inhA и fabG1(mabA), приводящие к устойчивости низкого уровня к изониазиду, приводят к высокому уровню устойчивости к этионамиду. Устойчивость к этионамиду развивается также в результате мутационного повреждения монооксидазы (кодируется геном ethA), которая, по-видимому, активирует этионамид [3, 10, 15, 18].

В экспериментах in vitro был обнаружен еще один ген, mshA, мутационное изменение которого приводило к повышению МИК этионамида. Ген mshA кодирует гликозилтрансферазу, участвующую в биосинтезе микотиола. Микотиол — важнейший компонент клетки МБТ с антиоксидантной функцией, обеспечивающий микобактериям защиту в макрофагах [24]. Однако данные об обнаружении мутаций в mshA гене в клинических изолятах отсутствуют.

Этамбутол

Этамбутол — ПТП 1 ряда, применение которого для лечения ТБ началось в 1961 г. Этамбутол оказывает бактериостатическое действие на делящиеся микобактерии [12, 13], ингибируя арабинозилтрансферазы — ферменты, участвующие в синтезе липогликозидов клеточной оболочки микобактерий (арабиногалактана — АГ, и липоарабиномананна — ЛАМ). Арабинозилтрансферазы кодируются генами embB и embA (синтез АГ) и embC (синтез ЛАМ) [12, 25, 26].

Среди клинических изолятов МБТ, устойчивых к этамбутолу, более 85% несут мутации в embB гене. Частота мутаций в других генах embABC оперона не превышает в сумме 10% [18, 27]. Еще один ген, мутации в котором ассоциируются с высокой степенью резистентности МБТ к этамбутолу (по данным бактериологических тестов), — ubiA, кодирующий трансферазу, участвующую в синтезе клеточной стенки МБТ. Гиперэкспрессия этого гена приводит к резистентности к этамбутолу высокого уровня [26, 27].

Пиразинамид

Пиразинамид — синтетический аналог никотинамида, являющегося одной из форм витамина B₃ (ниацина, витамина PP) и входящего в состав коферментов дегидрогеназ — НАД и НАДФ, участвующих в окислительно-восстановительных процессах клетки МБТ, в метаболизме липидов и гликолипидов клеточной стенки бактерий, протеинов, пуринов, глюконеогенезе [3, 13].

Пиразинамид так же, как и производные изоникотиновой кислоты, является пролекарством. Внутри бактериальной клетки в результате процесса дезаминирования при участии фермента пиразинамидазы/никотинамидазы, он превращается в активное вещество — предположительно, пиразиновую кислоту. Основная функция никотинамидазы в клетках МБТ — превращение никотинамида в никотиновую кислоту (ниацин). Антибактериальное действие этого препарата в наибольшей степени проявляется при pH <5,5 [13]. В опытах in vitro пиразинамид проявлял активность и в отношении неделящихся бактерий, а в опытах in vivo — стерилизующую активность в очагах воспаления при кислых pH [28]. Пиразинамид оказывает бактерицидное действие на бактерии M. tuberculosis, но не на M. bovis или M. canetti, у которых отсутствует никотинамидазная активность [18].

Механизм действия пиразинамида до настоящего времени не установлен. Накопление пиразиновой кислоты может приводить к нарушению системы поддержания трансмембранного потенциала цитоплазматической мембраны бактериальной клетки, снижению внутриклеточного pH, приводящим к нарушению транспорта веществ внутрь клетки, а также работы ферментов, в том числе участвующих в синтезе жирных кислот, входящих в состав клеточной стенки [29]. Пиразиновая кислота связывается с рибосомальным белком S1-RpsA (rpsA ген), участвующим в нормально проходящем процессе трансляции и в процессе транс-трансляции высвобождающим заблокированные рибосомы. Блокировка рибосомы может возникнуть в результате трансляции неполноценной мРНК, голодания или в других неблагоприятных для бактерий условиях, в тех же условиях, которые приводят к персистенции. Связываясь с RpsA белком, пиразиновая кислота может препятствовать переключению заблокированной рибосомы на трансляцию нормальной мРНК, что приводит к гибели персистирующих клеток МБТ [27]. Однако среди клинических изолятов МБТ достоверно устойчивых к пиразинамиду мутантов по rpsA гену не обнаружено [15].

Все клинические изоляты МТБ, устойчивые к пиразинамиду, несут точечные мутации или делеции в структурном гене (в районе 561 п.о.) или в регуляторной области (в районе 82 п.о.) гена pncA, кодирующего синтез фермента пиразинамидазы (никотинамидазы) [3, 18]. Однако анализ мутаций в этом гене у устойчивых к пиразинамиду и чувствительных к нему изолятах показал, что среди многочисленных мутаций, обнаруженных в этом гене, большая часть ассоциирована с устойчивостью к пиразинамиду с достоверностью среднего уровня, небольшая же часть вовсе не ассоциирована с устойчивостью к этому препарату [15].

Среди клинических изолятов в незначительном количестве встречаются устойчивые к пиразинамиду изоляты МТБ (низкий уровень устойчивости), сохраняющие ген pncA неизменным. Предполагают, что у этих бактерий нарушено проникновение пиразинамида или пиразиновой кислоты в микобактериальную клетку, или происходит их активный выброс из клетки [29].

Ингибиторы транскрипции

Аминогликозиды

В настоящее время для лечения туберкулеза применяются три аминогликозидных антибиотика — стрептомицин (препарат 1 ряда), канамицин и амикацин (препараты 2, резервного ряда) [18, 30]. К аминогликозидам относят природные и полусинтетические антибиотики, в состав молекул которых входит аминосахарид, соединенный гликозидной связью с гексозой. Различия аминогликозидов определяются структурой остатка гексозы (стрептидин у стрептомицина и 2-дезокси-D-стрептомин у остальных аминогликозидов) и числом аминосахаридных остатков. Существуют три структурных аналога канамицина (A, B и C), различающиеся заместителями одного из аминосахаридных остатков, входящих в его молекулу. Наибольшее клиническое применение имеет сульфат канамицина A, хорошо растворимый в воде [13, 31]. Амикацин является синтетическим производным канамицина A [31].

Аминогликозиды оказывают бактерицидное действие на широкий спектр патогенных бактерий, в том числе и на микобактерии туберкулезного комплекса. В экспериментах in vitro было показано, что активность аминогликозидов зависит от pH среды: наибольшая активность проявляется при щелочных значениях, в кислой среде она снижается. Негативное влияние на активность этих антибиотиков оказывают и высокие концентрации моновалентных и двухвалентных катионов (например, Ca²⁺ или Mg²⁺). Эти свойства аминогликозидов позволяют предполагать их низкую эффективность в организме в участках с более кислой средой или в биологических жидкостях с высокой концентрацией солей (например, в моче) [31]. Мишенью антибактериального действия аминогликозидов является синтез полипептидной цепи на рибосомах [13, 31]. Связывание антибиотика с сайтом, образованным S12 белком рибосомы и 16S рРНК и участвующим в присоединении тРНК к растущей полипептидной цепи, приводит к образованию недостроенных, нефункциональных пептидов [13, 31].

Мутации, приводящие к устойчивости к аминогликозидам, встречающиеся в клинических изолятах МБТ, фенотипически устойчивых к этим препаратам, связаны с изменением структуры рибосомального белка S12 и 16S рРНК (в том числе, их метилированием), входящих в 30S субъединицу бактериальной рибосомы. Среди изолятов МБТ с высоким уровнем устойчивости к аминогликозидам — мутанты по структурным генам рибосомального белка S12 и 16S рРНК, входящих в состав 30S субъединицы рибосомы [13, 18]. Высокий уровень устойчивости к аминогликозидам у точечных rrs мутантов МБТ с измененной структурой 16S рРНК является видовой особенностью этих бактерий. Это может быть связано с тем, что у МБТ имеется только одна копия гена rrs [31].

Мутации, приводящие к низким уровням устойчивости к амингликозидам, могут быть также связаны с нарушением структуры клеточной стенки, белков-поринов, участвующих в транспорте молекул аминогликозидов внутрь микобактериальной клетки, систем энергозависимого транспорта аминогликозидов из клеток МБТ и повреждением этих систем [31]. Однако такие мутации не описаны для клинических изолятов МБТ [15].

Устойчивость к стрептомицину связана с модификацией рибосомального белка S12 (ген rpsL), 16S рРНК (ген rrs), а также с ферментом, метилирующим 16S рРНК (ген gidB). Мутации gidB относятся к группе с умеренной достоверностью ассоциации с устойчивостью к стрептомицину [15]. Суммарная чувствительность выявления устойчивости к стрептомицину МГМ с привлечением мутаций как с высокой, так и с умеренной степенью достоверности ассоциации с резистентностью к этому препарату, составляет всего 75,2% со специфичностью 98,0% [15].

Устойчивость к канамицину и амикацину также связана с генами rrs и eis (кодируют фермент, инактивирующий аминогликозид — аминогликозид аминоацилтрансферазу). Среди мутаций в rrs и eis генах есть мутации, располагающиеся в промоторной области и, по-видимому, приводящие к гиперэкспрессии этих генов, но не к утрате функции соответствующих белков/ферментов, поэтому эксперты отнесли эти мутации к группе с умеренной степенью достоверности ассоциации с резистентностью к аминогликозидам [32].

Нарушения структуры рибосомального белка S12 и 16S рРНК могут приводить к снижению жизнеспособности клетки МБТ. Описаны компенсаторные мутации, восстанавливающие жизнеспособность МБТ, связанные с генами, кодирующими 16S рРНК (обеспечение стабильности структуры 16S рРНК) [7, 8, 33].

Капреомицин

Капреомицин относится к полипептидам и отличается от аминогликозидов по своей химической структуре. Однако в противотуберкулезной химиотерапии аминогликозиды (канамицин и амикацин) и капреомицин обычно рассматриваются в одной группе в связи с тем, что все они являются инъекционными антибиотиками, имеют сходную фармакокинетику и токсичность. Все три препарата относят к препаратам 2 ряда [18].

Капреомицин является природным антибиотиком и образуется бактериями Streptomyces capreous [13]. Данных о механизме действия капреомицина недостаточно. Несмотря на различия химических структур аминогликозидов и капреомицина, механизм действия последнего также связан с процессом трансляции, большинство мишеней действия связаны с 16SрРНК и 30S субъединицей [13].

Несмотря на общую мишень действия аминогликозидов и капреомицина, их сайты связывания с мишенью отличаются в зависимости от их химической структуры. Это приводит к неполной перекрестной устойчивости к ним: устойчивые к стрептомицину клинические изоляты могут сохранять чувствительность к канамицину, амикацину и капреомицину, а устойчивые к канамицину оказываются устойчивыми и к стрептомицину, но могут сохранять чувствительность к амикацину и капреомицину. Устойчивость к амикацину приводит к устойчивости ко всем препаратам, а устойчивые к капреомицину изоляты могут сохранять чувствительность к аминогликозидам [13].

Ингибиторы ДНК-топоизомеразы II

Фторхинолоны

Фторхинолоны — синтетические антибактериальные препараты широкого спектра действия, относящиеся к группе хинолонов. Левофлоксацин (фторхинолон 3 поколения) и моксифлоксацин (фторхинолон 4 поколения) включены в число приоритетных препаратов второго (резервного ряда), применяемых для лечения туберкулеза, вызванного микобактериями с МЛУ [3, 30].

Мишенью действия хинолонов всех поколений являются бактериальные топоизомеразы типа II — ферменты, участвующие в расплетании суперспирализованных участков ДНК в процессе ее репликации [13, 34, 35]. ДНК-гираза — одна из бактериальных топоизомераз типа II (и единственная топоизмераза, описанная для МБТ), обеспечивает поддержание необходимой топологии молекулы ДНК, контролируя уровень суперспирализации ее участков. В состав ДНК-гиразы входят 4 субъединицы: две субъединицы A (у МТБ кодируются геном gyrA), осуществляющие разрезание двух цепей ДНК, расплетение витка суперспирали и последующее сшивание разреза, и две субъединицы B (у МТБ кодируются геном gyrB), обладающие АТФ-азной активностью и обеспечивающие энергией процесс расплетения суперспирали [9, 13]. В клетках большинства бактерий присутствуют две топоизомеразы типа II, однако, у M. tuberculosis — только ДНК-гираза [13, 34—36].

Молекула фторхинолона связывается с активным центром A субъединицы и разрезанной полинуклеотидной последовательностью, блокируя комплекс ДНК — ДНК-гираза. Фторхинолоны 3 и 4 поколений связываются также и с B субъединицей ДНК-гиразы, ингибируя ее АТФ-азную активность [13, 35—37]. Появление «незалеченного» разрыва ДНК в месте комплекса ДНК с ДНК-гиразой и фторхинолоном приводит к индукции синтеза эндонуклеаз системы репарации ДНК, избыток нуклеаз неконтролируемо повреждает молекулу ДНК, включая цепную реакцию ее разрушения, что и приводит к гибели клетки [13, 38].

Мутации, приводящие к резистентности к фторхинолонам, локализуются в консервативных нуклеотидных последовательностях гомологичных областей gyrA и gyrB, которые получили обозначение QRDR регион (Quinolone region drug resistant) [10, 35—39].

В клинических изолятах МБТ большая часть мутаций в gyrA и gyrB генах приводила к устойчивости к левофлоксацину и моксифлоксацину, что подтверждалось соответствующим увеличением МИК [15]. Вместе с тем, среди мутаций в gyrA гене (как синонимичных, так и несинонимичных) M. tuberculosis обнаружены не только мутации, приводящие к устойчивости к фторхинолонам, но и мутации, не приводящие к устойчивости микобактерий к ним. Исследователи предполагают, что их число в некоторых географических регионах может достигать 7% среди клинических изолятов МЛУ [22, 39]. Описаны и компенсаторные мутации, корректирующие последствия мутаций в gyrA гене, не изменяя резистентности микобактерий к фторхинолонам [8, 40]. Среди всех мутаций, рассмотренных экспертной группой ВОЗ и отнесенных к мутациям, с высокой и умеренной достоверностью ассоциированных с резистентностью к левофлоксацину или моксифлоксацину, только одна gyrB E501D мутация ассоциировалась с большим увеличением МИК (резистентности) для моксифлоксацина, чем для левофлоксацина [15].

Препараты с невыясненными механизмами действия

p-Аминосалициловая кислота (ПАСК)

ПАСК — один из старейших ПТП. Клиническое применение этого препарата началось в 1946 г. [13]. В настоящее время ПАСК относится к резервным препаратам 2 ряда [30]. Препарат оказывает бактериостатическое действие на микобактерии [18]. Предполагают, что ПАСК является пролекарством, при поступлении в клетку микобактерий происходит превращение ПАСК в результате двух последовательных реакций при участии дигидроптероат синтазы и дигидрофолат редуктазы в гидрокситетрагидрофолат [33,40]. Активированный ПАСК может ингибировать синтез салициловой кислоты и сидефора микобактина (хелатора железа) и/или фолатный цикл [32, 40—42]. Ингибирование фолатного цикла может приводить к нарушению синтеза нуклеотидов — компонентов нуклеиновых кислот. И нарушение поступления в микобактериальную клетку ионов железа, и недостаток нуклеотидов должны приводить к подавлению деления бактериальной клетки.

Мутации, полученные in vitro, приводящие к резистентности микобактерий, в том числе и МТБ, к ПАСК, были связаны с генами, кодирующими ферменты фолатного цикла. Возможно также повышение устойчивости микобактерий к этому препарату происходит за счет интенсификации его энергозависимой экскреции [3, 32]. Данные о мутациях в клинических изолятах МБТ, приводящих к резистентности к ПАСК, обнаружить не удалось.

Циклосерин

Циклосерин также один из старейших ПТП, включенный в настоящее время в число резервных препаратов [13, 18]. D-циклосерин является структурным аналогом аминокислоты D-аланина и оказывает бактериостатическое действие на широкий спектр грамположительных и грамотрицательных бактерий. Мутации, связанные с устойчивостью к этому препарату, чаще всего обнаруживают в генах, кодирующих ферменты, участвующие в синтезе пептидогликана клеточной стенки, субстратами которых является d-аланин: d-аланил-d-аланин лигазы (ген ddl), d-аланин рацемазы (ген alr) [13, 43]. Гиперпродукция этих ферментов приводит к резистентности к циклосерину у Mycobacterium smegmatis. Определенная в опытах in vitro частота возникновения мутаций, связанных с устойчивостью к циклосерину, — 1 случай на 10¹⁰ клеток МБТ [43]. Подтверждение этих результатов при исследовании мутаций клинических изолятов МБТ обнаружить не удалось [15].

Новые противотуберкулезные препараты

К новым препаратам в данной статье отнесены препараты, применение которых для лечения туберкулеза началось после 2000 г.

Бедаквилин

Бедаквилин — препарат из класса диарихинолинов, проявляющий активность в отношении МТБ и некоторых нетуберкулезных микобактерий [13, 44]. Механизм действия бедаквилина уникален для антибактериальных препаратов: он действует на энергетический метаболизм бактериальной клетки, ингибируя активность АТФ-синтазы (atpE ген), связываясь с С-субъединицей фермента и нарушая образование жизненно необходимого для бактерии энергозапасающего соединения — АТФ. Бедаквилин действует на активно делящиеся и персистирующие МБТ [13, 45—48].

Начиная с 2014 г. бедаквилин начал широко применяться при лечении МЛУ туберкулеза. Параллельно с расширением применения этого препарата стали появляться публикации о нарастании числа устойчивых к этому препарату клинических изолятов [18, 41, 49, 50]. Однако в первые годы среди исследованных клинических изолятов доля мутантов по генам, кодирующим мишени бедаквилина — субъединицы АТФ-синтетазы (в том числе, в atpE гене), не превышала 30% [15].

По данным исследований последних лет, среди устойчивых к бедаквилину изолятов встречаются мутанты как по atpE гену, так и по генам rv0678 and pepQ (rv2535c) (кодирует пролинаминопептидазу) [45—48, 50]. Повреждение rv0678 гена, кодирующего репрессор транскрипции генов неспецифичной системы экскреции MmpL5, выводящей из бактериальной клетки субстраты различной химической структуры, приводит к увеличению числа таких систем в бактериальной клетке и появлению устойчивости низкого уровня к бедаквилину и клофазимину [46—48, 50]. Мутации в генах rv0678 и pepQ (rv2535c) приводят к перекрестной устойчивости низкого уровня к бедаквилину и клофазимину (МИК для бедаквилина увеличивается более, чем в 4 раза). Мутации в гене pepQ(rv2535c), по-видимому, приводят к нарушению синтеза или снижению активности одной из эндопептидаз — пролинаминопептидазы [46—48, 50].

Аналоги бедаквилина, синтезированные в последние годы и проходящие доклинические испытания, обладают большей антимикобактериальной активностью, в том числе в отношении изолятов МБМ с мутациями в rv0678 (см. таблицу) [45].

Разрабатываемые группы химических соединений с потенциальной антимикобактериальной активностью (приоритетные соединения Рабочей группы по новым противотуберкулезным препаратам Партнерства «Остановить туберкулез») [58, 59]

Примечание. * — в настоящее время проходят тестирования как антибактериальные препараты большое количество хинолонов — ингибиторов ДНК гиразы, однако данных об их действии как потенциальных препаратов недостаточно.

Клофазимин

Клофазимин — синтетический препарат, относящийся к риминофеназинам. применяющийся для лечения проказы с 1969 г., и для лечения МЛУ туберкулеза — с начала 2000 г. как препарат, рекомендованный для лечения туберкулеза в особых ситуациях — при необходимости обеспечения эффективного режима лечения пациентов, зараженных МБТ, устойчивыми к большинству или ко всем препаратам 1 и 2 рядов [13, 30]. Клофазимин оказывает подавляющее действие как на активно размножающиеся, так и на персистирующие, и находящиеся в условиях гипоксии МБТ [13, 23]. Механизм действия этого препарата изучен недостаточно. Предполагают его неспецифическое действие на цитоплазматическую мембрану, нарушающее транспорт ионов, и на окислительно-восстановительные процессы в бактериальной клетке [13, 46]. Среди мутаций, приводящих к устойчивости к клофазимину описаны только мутации, приводящие к низкому уровню устойчивости, обеспечивающие перекрестную устойчивость к клофазимину и бедаквилину, несмотря на различия в их химических структурах (см. выше). Клинические изоляты МБТ с перекрестной устойчивостью к бедаквилину и клофазимину выделялись и от пациентов, ранее не принимавших эти препараты [46].

Нитроимидазолы

Деламанид, претоманид — препараты из класса 4-нитроимидазолов. Деламанид и, по-видимому, претоманид является пролекарством, он превращается в активное вещество при попадании в клетку микобактерий. Эти препараты действуют на делящиеся МБТ в присутствии кислорода, на дормантные (персистирующие) бактерии в условиях гипоксии в гранулемах, в том числе и на МБТ с МЛУ [13, 50, 51]. Активированные препараты могут выступать как токсичные для бактерий азотсодержащие соединения (активные формы азота), участвующие в нитрозивном стрессе. Активные формы азота связываются и разрушают различные соединения — белки, НК, липиды, могут влиять на структуру цитоплазматической мембраны бактерий [51, 52].

Фермент, ответственный за превращение деламанида в активное вещество — де-азафлавин зависимая нитроредуктаза (DDN) — необычная для бактерий редуктаза, флавопротеин, встречающаяся у актиномицетов, к которым относятся и МБТ. В состав DDN входит необычный кофактор, участвующий в окислительно-восстановительных реакциях — F₄₂₀. Эти ферменты участвуют в детоксикации различных органических соединений, проводя их восстановление в процессе биодеструкции [53, 54]. Биосинтез F₄₂₀ важен для активации ПТП группы нитроимидазолов, что объясняет большое количество мутантов с нарушением синтеза этого кофермента, которые были получены в опытах in vitro: глюкоза-6 фосфат дегидрогеназа (fgd ген), продукты генов fbi A и D. Эти мутации, приводящие к утрате функций кодируемых ферментов, приводили к значительно более высоким значениям МИК для обоих препаратов, чем у изолятов МБТ дикого типа [54].

Мутационное повреждение ddn гена приводит к резистентности клинических изолятов к деламаниду и претоманиду [46, 50, 51], при этом сайты связывания деламанида и претоманида с DDN могут различаться [50, 55]. Мутации в гене ddn, приводящие к резистентности к ПТП-нитроимидазолам, сохраняют редуктазную активность DDN в отношении оксида азота. Активность фермента по восстановлению токсичного оксида азота (NO) до закиси азота (N₂O) важна для защиты МБТ от гипоксии [50, 55].

Деламанид и претоманид, подобно производным изоникотиновой кислоты, ингибируют синтез кето- и метокси-производных миколовых кислот. При этом мишень действия деламанида иная, чем изониазида — перекрестная устойчивость этих препаратов не описана [13, 15].

Мутации, влияющие на активность F₄₂₀ — де-азафлавин зависимой нитроредуктазы, могут снижать выживаемость МБТ в организме больного на фоне лечения. Данные об их клинической значимости недостаточны. Кроме того, в развитии устойчивости к этим препаратам могут участвовать мутации и в других генах — 17% мутаций, связанных с устойчивостью к претоманиду и полученных in vitro, не были связаны с перечисленными выше генами [56]. Анализ результатов исследований клинических изолятов, устойчивых к деламаниду, позволил охарактеризовать несколько ddn мутаций как ассоциированных с устойчивостью к этому ПТП с высокой достоверностью [15, 21]. Мутации в гене ddn обнаруживались и в клинических изолятах, полученных до начала лечения этими препаратами [50].

Исследователи генетического разнообразия МБТ показали, что чувствительность различных генетических линий претоманиду различна. Минимальная ингибирующая концентрация этого препарата для изолятов, относящихся к линии L1 (выделяемые в регионах Филиппин и Индийского океана) оказались значительно выше, чем для изолятов линий L2 (из региона Восточной Азии), L3 (из региона Восточной Африки и Индии), L4 (из региона Европы, Америки и Северной Африки), L5 (из региона Западной Африки 1), L7 (из Эфиопии), а для изолятов L5 (из региона Западной Африки 2) — заметно ниже, чем для изолятов L1-L5. Эти различия требуют пересмотра рекомендаций по применению претоманида в некоторых регионах мира [57].

Линезолид

Линезолид относится к классу оксазолидинонов, проявляет антибактериальное действие в отношении МБТ и рекомендован для лечения туберкулеза в 2000 г. [3, 30], а также включен в группу приоритетных противотуберкулезных препаратов, рекомендованных для лечения МЛУ ТБ [30]. Линезолид ингибирует синтез белка, связываясь с 23S рРНК, входящей в 50S субъединицу бактериальной рибосомы, ингибируя пептидилтрансферазную активность и элонгацию пептидной цепи при трансляции — механизм действия, отличный от действия ПТП других групп [18, 41, 46, 58]. Перекрестная устойчивость линезолида с препаратами других групп не выявлена [58].

Клинические изоляты МБТ, резистентные к линезолиду, встречаются редко (около 2% от всех изученных изолятов), и не несут мутации в гене, кодирующем 23S рРНК [18, 46]. Единственный ген, мутационные повреждения которого ассоциируются с резистентностью к линезолиду, найденный в клинических изолятах МБТ — ген rplC, кодирующий рибосомальный белок L3 50S субъединицы [15, 18, 50].

Новые вещества с антибактериальной активностью в отношении микобактерий туберкулезного комплекса

Помимо трех разрешенных после 2010 г. к применению для лечения туберкулеза препаратов (бедаквилин, деламанид/протеонамид, линезолид), по данным ВОЗ, с 2022 г. проводятся I, II, III фазы клинических испытаний и доклинические испытания 26 препаратов/веществ с противотуберкулезной активностью, относящиеся к 17 различным группам химических соединений [59, 60]. Среди потенциальных противотуберкулезных препаратов — вещества, ингибирующие дефосфорилазу рибозы, участвующую в синтезе клеточной стенки МБТ (decaprenylphosphoryl-D-ribose oxidase -DprE1), НАДН зависимую ACP-редуктазу (в отличие от применяемых препаратов изоникотиновой кислоты не требующие активации) и другие ферменты и белки, участвующие в синтезе клеточной стенки, ингибиторы энергетического метаболизма МБТ, ДНК-гиразы, альфа-субъединицы бактериальной ДНК-полимеразы III (продукта гена dna E) [59—63].

В таблице приведены вещества, проявившие антимикобактериальную активность, и препараты, проходящие клинические и доклинические испытания.

Заключение

Распространение устойчивости МБТ к ПТП представляет значительную угрозу эффективности лечения туберкулеза: исследования, представленные в обзоре, демонстрируют разнообразные механизмы, обеспечивающие микобактериям защиту от действия ПТП. Разнообразие и частота возникновения мутаций, ассоциированных с устойчивостью МБТ к новым препаратам (бедаквилину, деламаниду и претонамиду, линезолиду) увеличиваются по мере расширения их применения. Быстрая диагностика случаев устойчивого к ПТП туберкулеза может повысить эффективность лечения больных. В этой связи рекомендации ВОЗ по применению быстрых (в основном, молекулярно-генетических) методов [3] чрезвычайно важны. Однако эффективность их применения на практике снижена из-за отсутствия четких рекомендаций по клинической интерпретации результатов лабораторных исследований. Если критические концентрации ПТП, применяемые при бактериологических/ фенотипических исследованиях, в большей или меньшей степени привязаны к клиническому проявлению лекарственной устойчивости МБТ, заключения по результатам молекулярно-генетических исследований часто строятся на данных о полиморфизме в генах, связанных с механизмами антибактериального действия препаратов, или в геномах, устойчивых к определенным ПТП штаммов, полученных по результатам секвенирования и биоинформационного анализа [22]. «Золотой стандарт» доказательства появления той или иной мутации для проявления фенотипической устойчивости — генетические исследования разных аллелей генов [22, 34] — требует значительных материальных затрат, времени и трудозатрат. Отсутствие однозначного соответствия некоторых мутаций, выявляемых в устойчивых к ПТП изолятах, связано с тем, что наши знания роли отдельных генов микобактериальной клетки в ее жизнедеятельности недостаточны: знания о последовательности ДНК микобактерий пока значительно обогнали наши знания о физиологии микобактерий. Масштабные исследования для поиска мутаций, связанных с клинически проявляющейся устойчивостью с применением полногеномного секвенирования, целесообразно определение МИК штаммов — носителей выявленных мутаций для изучаемых ПТП, полученных бактериологическими методами [8]. При этом должны быть надежно исключены мутации, ассоциированные с проявлением резистентности, но не приводящие к ней, например, компенсаторные мутации.

В настоящее время в некоторые наборы для молекулярно-генетического выявления устойчивости МБТ к ПТП включены праймеры к подобным мутантным локусам, что приводит к появлению ложноположительных результатов [3, 8, 22, 64—66]. Необходимо также выделение мутаций, приводящих к низким уровням устойчивости, которые могут быть преодолены при лечении повышенными дозами препаратов (где это возможно), например, как в случае изониазида [65-67].

Первый шаг к проведению такой оценки огромного массива данных группой экспертов ВОЗ был сделан при подготовке Каталога мутаций Mycobacterium tuberculosis complex и их ассоциации с устойчивостью к ПТП [15]. Однако работы по такому анализу должны продолжаться и расширяться для формулировки однозначных рекомендаций по клинической интерпретации данных молекулярно-генетических исследований, включая новые ПТП. Клиническую значимость таких рекомендаций должны повысить новые данные о механизмах действия ПТП.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.