Список сокращений:

БАП — биологически активный пептид

ВКМ — внеклеточный матрикс

РС — рекомбинантный спидроин

ГБ(RGDS) — гибридный белок, содержащий тетрапептид RGDS

ГБ(HBP) — гибридный белок, содержащий гепарин-связывающий пептид (HBP)

ГБ(GRGGL) — гибридный белок, содержащий пентапептид GRGGL

BDNF — нейротрофический фактор мозга (brain derived neurotrophic factor)

CV — кристаллический фиолетовый (crystal violet)

Ret — ретиноевая кислота (retinoic acid)

Введение

Тканевая инженерия направлена на разработку клеточных конструктов, содержащих матриксы, клетки и биологически активные макромолекулы, являющихся биологическими заменителями, способными восстанавливать, поддерживать или улучшать функции поврежденной ткани. Несмотря на заметные успехи в создании различных тканеинженерных конструкций, в отношении нервной ткани до сих пор остается нерешенной задача получения матриксов с оптимизированными свойствами, обеспечивающими достаточную для нормального функционирования реконструированной ткани степень выживаемости трансплантируемых нервных клеток, направленную дифференцировку нейрональных предшественников в нейроны требуемых типов, а также высокую степень и скорость васкуляризации и иннервации [1].

Перспективной основой для создания тканеинженерных конструкций для нервной системы являются образующие нити каркаса паутины пауков-кругопрядов белки спидроин 1 и спидроин 2, характеризующиеся уникальным сочетанием высочайших показателей прочности и эластичности [2]. Были получены рекомбинантные аналоги спидроинов (РС), свойства которых во многом близки к природным спидроинам и характеризуются биосовместимостью, неиммуногенностью, неаллергенностью и биоразлагаемостью [3—5].

РС могут быть модифицированы введением в их структуру различных биологически активных пептидов (БАП), в том числе, мотивов белков внеклеточного матрикса (ВКМ), способствующих клеточной адгезии, что потенциально позволяет получать матриксы с уникальными заданными свойствами [6]. В данной работе мы исследовали подложки (2D матриксы), полученные нанесением на поверхность полистирольных планшетов для адгезионных культур клеток (см. Материал и методы) смесей РС rS1/9 и rS2/12 с гибридными белками (ГБ), содержащими мономер rS1/9 и один из рекомбинантных БАП [7—9]. В качестве БАП были использованы: пептид RGDS (входящий в состав некоторых белков ВКМ и связывающийся с клеточными интегринами) [10, 11], гепарин ltabc связывающий пептид (HBP), входящий в состав ламинина [12], участвующий в связывании различных ростовых факторов и взаимодействующий с синдеканами, и пептид GRGGL (содержащийся также в составе молекулы rS1/9), связывающийся с нейральными молекулами клеточной адгезии (NCAM) [13, 14].

Цель данного исследования — оценка влияния различных комбинаций спидроиновых подложек с БАП на жизнеспособность клеток нейробластомы человека линии SH-SY5Y и уровни экспрессии в них ключевых синапс-специфичных генов (являющиеся показателем зрелости нейронов ) при направленной холинергической дифференцировке этих клеток. Использованная линия клеток является широко применяемой клеточной моделью для изучения нейрональной дифференцировки и функционирования нейронов [15—17].

Материал и методы

Рекомбинантные аналоги спидроинов и гибридные белки. Полноразмерные РС rS1/9 и rS2/12 выделяли из водонерастворимой фракции клеток штаммов-продуцентов S. cerevisiae и очищали с помощью ионно-обменной хроматографии, как описано ранее [18]. ГБ, содержащие разные БАП, были сконструированы по одной схеме: H₆-SUMO-1F1-G(SGG)₄S-(БАП), где H_{6 —} his-tag для очистки на Ni-колонке; SUMO (Small Ubiquitin Like Modifier) — пептид — продукт гена Smt3 дрожжей, способствующий повышению выхода белка в клетках E. coli; 1F1- мономер РС rS1/9, выполняющий роль «якоря» при взаимодействии с полноразмерными РС; G(SGG)₄S — нейтральный линкер, способствующий экспозиции БАП над поверхностью матрикса; БАП — любой из клонированных БАП. Получение и очистку ГБ, приготовление смешанных растворов и покрытие поверхности планшетов исследуемыми растворами проводили, как описано ранее [19].

Были исследованы следующие варианты подложек: 1) смесь [rS2/12 + ГБ(RGDS)] (вариант SP1); 2) rS2/12 (вариант SP2); 3) смесь [rS2/12 + rS1/9 + ГБ(RGDS) + ГБ(HBP)] (вариант SP3); 4) смесь [rS1/9 + rS2/12] (вариант SP4); 5) смесь [rS2/12 + ГБ(GRGGL)] (вариант SP5); 6) контроль (поверхность культуральных планшетов без нанесения на них вышеуказанных смесей).

Культивирование и направленная дифференцировка клеток. Клетки нейробластомы человека линии SH-SY5Y (ATCC CRL-2266; «Спутник-К», Россия) культивировали в среде DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium High Glucose, «Gibco», США), содержащей добавку Glutamax («Gibco», США) и 10% инактивированной эмбриональной сыворотки коровы («HyClone», США) при 37 °C в атмосфере, содержащей 5% CO₂. Через 24 ч после засева клеток на культуральные планшеты проводили направленную нейрональную дифференцировку клеток согласно описанной ранее двухстадийной схеме в указанной культуральной среде без сыворотки, содержащей дополнительно добавку B-27 («Gibco», США) и 10 мкМ ретиноевой кислоты (Ret) (all-trans-Retinoicacid, «Sigma», США) в течение 5 дней (первая стадия дифференцировки). Далее в среду вводили нейротрофический фактор мозга BDNF (50 нг/мл, «Peprotech», Великобритания) и через 4 дня повторно вводили BDNF (общее время инкубации с BDNF составляло 7 дней, заключительная стадия дифференцировки).

В работе использовали 12- и 96-луночные полистирольные планшеты для адгезионных клеточных культур (Cat.No. 30012 и 30096 «SPL LifeSciences», Республика Корея). Полистирольная поверхность этих планшетов модифицирована производителем в целях оптимальной адгезии клеток. Поверхность планшетов, не покрытая исследуемыми 2D матриксами, служила в качестве контроля [20].

Оценка жизнеспособности клеток. Использовали два колориметрических метода (CV-тест и MTT-тест) согласно описанным стандартным методикам — с применением красителя кристаллического фиолетового (crystal violet, CV) и 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромида (MTT) («Sigma», США). Оптическую плотность (соответствующую количествам связавшегося красителя CV или образовавшегося из MTT формазана и являющуюся характеристикой жизнеспособности клеток), измеряли с использованием многоканального спектрофотометра при длине волны 600 нм [21, 22].

Определение уровней транскрипции генов. Выделение тотальной РНК проводили с помощью набора ExtractRNA («Евроген», Россия), очистку от примесей геномной ДНК проводили с помощью набора ThermoScientificDNaseI («ThermoFisherScientific», США), обратную транскрипцию и ПЦР в реальном времени проводили с помощью смесей MMLVSK022L и 5xqPCRmix-HSSYBR («Евроген», Россия) согласно инструкциям производителей. Результаты ПЦР анализировали с помощью метода 2(-Delta Delta C(T)). Для проведения ПЦР использовали опубликованные ранее последовательности праймеров: синапсин I, синапсин II, синаптофизин, PSD-95. В качестве референсного гена использовали бета-актин [23—28].

Статистическая обработка результатов. Анализ данных проводили с помощью программы GraphPad Prism. Сравнения групп осуществляли с помощью одно- и двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA); множественные сравнения групп проводили с помощью теста Холма—Шидака. Нормальность выборок проверяли тестом Шапиро—Уилка. Однородность дисперсий проверяли тестом Брауна—Форсайта. Примененные тесты ANOVA, уровни значимости различий между группами и объемы групп указаны в подписях к рисункам.

Результаты

Сравнение жизнеспособности клеток SH-SY5Y на различных стадиях направленной нейрональной дифференцировки на исследуемых 2D матриксах. Уровни жизнеспособности клеток перед началом дифференцировки (стадия «0» на рисунках) на подложках SP1, SP5, SP2 не различались между собой и от контроля по данным обоих тестов жизнеспособности (рис. 1 а, б). По данным CV-теста (см. рис. 1, а) различий не обнаружено также после первой стадии дифференцировки (стадия «Ret» на рисунках). После заключительной стадии дифференцировки (стадия «BDNF») обнаружено значимое снижение жизнеспособности клеток, культивированных на подложках SP2 (rS2/12) и SP1 [rS2/12 + ГБ(RGDS)] по сравнению с контролем. В то же время, на подложке SP5 [rS2/12 + ГБ(GRGGL)] жизнеспособность клеток была значимо выше, чем на подложках SP2 и SP1, и не отличалась от контрольной. По данным MTT-теста (рис. 1, б) после первой стадии дифференцировки происходит значимое снижение жизнеспособности клеток, культивированных на SP2 по сравнению с контролем и подложкой SP1. После заключительной стадии дифференцировки обнаружена тенденция к значимому (p=0,08) снижению жизнеспособности клеток при их культивировании на SP2 по сравнению с контролем и значимое повышение жизнеспособности при культивировании на подложке SP5 по сравнению с SP2. Таким образом, на подложке SP2 после первой стадии дифференцировки (по MTT-тесту) и после заключительной стадии дифференцировки (по CV-тесту) наблюдалась более низкая жизнеспособность клеток, чем на контрольной поверхности. В то же время, по обоим тестам жизнеспособность клеток при дифференцировке на подложке SP5 была выше, чем на SP2.

Рис. 1. Жизнеспособность клеток SH-SY5Y по данным CV-теста (а, в) и MTT-теста (б, г) на различных стадиях нейрональной дифференцировки на исследуемых подложках.

Обозначения: 0 — до начала дифференцировки, Ret — после первой стадии дифференцировки, BDNF — после заключительной стадии. Жизнеспособность на контрольной поверхности на каждой стадии принята за 100%. Двухфакторный ANOVA, тест Холма—Шидака. Mean±SEM, N=5. * — P<0,05, ** — P<0,01, *** — P<0,001, **** — P<0,0001.

Жизнеспособность клеток на подложке SP4 [rS1/9 + rS2/12] по данным CV-теста (рис. 1, в) и MTT-теста (рис. 1, г) не отличалась от контроля на всех стадиях дифференцировки. При культивировании на подложке SP3 [rS2/12+ rS1/9 + ГБ(RGDS) + ГБ(HBP)] обоими тестами не обнаружено различий в жизнеспособности клеток перед началом дифференцировки, но по данным CV-теста (см. рис. 1, в) выявлено значимое повышение жизнеспособности по сравнению как с контрольной поверхностью, так и с подложкой SP4 после первой стадии и заключительной стадии дифференцировки. По данным MTT-теста (см. рис. 1, г) на первой стадии обнаружено повышение жизнеспособности только по сравнению с подложкой SP4, а на заключительной стадии — по сравнению и с подложкой SP4, и с контролем. Таким образом, при дифференцировке клеток на подложке SP3 наблюдалась более высокая жизнеспособность клеток, чем на контрольной поверхности и подложке SP4, причем на заключительной стадии дифференцировки повышение жизнеспособности обнаружено по данным обоих тестов.

Изменения уровней транскрипции генов синапс-специфичных белков на различных стадиях дифференцировки клеток SH-SY5Y на контрольной поверхности. Уровни экспрессии синапс-специфичных генов рассматриваются как показатель зрелости нейронов. Так как данные об экспрессии этих генов при направленной нейрональной дифференцировке клеток SH-SY5Y в литературе отсутствуют, нами была проведена оценка изменений уровней транскрипции синапсина I, синапсина II, синаптофизина и PSD-95 в процессе нейрональной дифференцировки на контрольной поверхности. После первого этапа дифференцировки клеток обнаружено значимое повышение уровней мРНК синапсина I (рис. 2, а), синаптофизина (рис. 2, в) и PSD-95 (рис. 2, г) по сравнению с недифференцированными клетками. При этом не было значимого различия между уровнями мРНК синапсина II (рис. 2, б) до начала и после первой стадии дифференцировки.

Рис. 2. Уровни транскрипции синапс-специфичных генов на различных стадиях дифференцировки клеток SH-SY5Y на контрольной поверхности: синапсин I (а), синапсин II (б), синаптофизин (в), PSD-95 (г).

Обозначения: 0 — до начала дифференцировки, Ret — после первой стадии дифференцировки, BDNF — после заключительной стадии дифференцировки. Уровни мРНК до начала дифференцировки (стадия 0) приняты за 100%. Однофакторный ANOVA, тест Холма—Шидака. Mean±SEM, N=4—6. * — P<0,05, ** — P<0,01, *** — P<0,001, **** — P<0,0001.

Обнаружено значимое повышение уровней мРНК всех исследуемых генов после заключительной стадии дифференцировки по сравнению как с первой стадией, так и с недифференцированными клетками (см. рис. 2, а—г). Таким образом, направленная нейрональная дифференцировка клеток SH-SY5Y сопровождается существенным повышением уровней транскрипции ключевых синапс-специфичных генов, что указывает на ее эффективность.

Сравнение уровней транскрипции генов синапс-специфичных белков на разных стадиях нейрональной дифференцировки клеток SH-SY5Y на исследуемых матриксах. На всех стадиях дифференцировки не было обнаружено различий в уровнях мРНК синапсина I, синапсина II и синаптофизина между всеми исследованными подложками (данные не приведены). Для уровней мРНК PSD-95 также не обнаружено различий между подложками SP1, SP5, SP2 и контролем на всех стадиях (рис. 3, а, в), но они значимо повышены для подложки SP3 по сравнению с контролем после первой (Ret) (рис. 3, б) и заключительной (BDNF) (рис. 3, г) стадий дифференцировки. При этом после первой стадии дифференцировки клеток повышение в них уровней мРНК PSD-95 при культивировании на SP3 по сравнению с SP4 близко к значимому (p=0,054) (см. рис. 3, б), а после заключительной стадии уровень мРНК PSD-95 для SP3 значимо превышает уровень для SP4 (рис. 3, г).

Рис. 3. Уровни транскрипции гена постсинаптического белка PSD-95 после первой (Ret) (а, б) и заключительной (BDNF) (в, г) стадий дифференцировки при культивировании клеток SH-SY5Y на исследуемых подложках.

а, в — уровни мРНК PSD-95 при дифференцировке на подложках SP1 [rS2/12 + ГБ(RGDS)], SP5 [rS2/12 + ГБ(GRGGL)] и SP2 (rS2/12); б, г — уровни мРНК PSD-95 при дифференцировке на подложках SP3 [rS2/12 + rS1/9 + ГБ(RGDS) + ГБ(HBP)] и SP4 [rS1/9 + rS2/12]. Уровни мРНК PSD-95 в клетках на контрольной поверхности приняты за 100%. Однофакторный ANOVA, тест Холма—Шидака. Mean±SEM, N=6. * — P<0,05.

Обсуждение

Полученные результаты свидетельствуют о том, что адгезионные свойства исследованных подложек в отношении недифференцированных клеток нейробластомы человека SH-SY5Y (соответствующих нейрональным предшественникам) сопоставимы по данным обоих тестов оценки жизнеспособности клеток. Однако при проведении направленной дифференцировки клеток нейробластомы на разных подложках обнаружены различия как в жизнеспособности клеток, культивируемых на различных подложках, так и в результатах двух использованных тестов жизнеспособности в отношении клеток на одной и той же подложке. В CV-тесте оценка основана на способности красителя связываться с клеточными макромолекулами. Нейрональная дифференцировка и нейрональный морфогенез включают в себя такие процессы, как рост нейритов и синаптогенез, требующие постоянного синтеза de novo белков и соответствующих мРНК [29]. Обнаруженное нами по данным CV-теста повышение жизнеспособности культивируемых клеток на обеих стадиях дифференцировки только при использовании подложки SP3 может свидетельствовать о большей интенсивности роста нейритов и процессов синаптогенеза при культивировании на данной подложке, чем на других подложках, и более высоком содержании в клетках белков и мРНК, связывающих краситель CV. Таким образом, уровни жизнеспособности клеток по CV-тесту в ходе нейрональной дифференцировки клеток нейробластомы могут отражать не только количество живых клеток, но и интенсивность процесса нейрональной дифференцировки.

В MTT-тесте оценка основана на измерении активности присутствующих в живых клетках NADPH-зависимых оксидоредуктаз, что отражает как количество живых клеток, так и их митохондриальный статус [22]. Обнаруженное на заключительной стадии дифференцировки на подложке SP3 повышение уровня жизнеспособности клеток не только по CV-тесту, но и по MTT-тесту может отражать повышенную потребность дифференцированных нейронов в обеспечении энергией функционирования синапсов, что обусловливает концентрирование митохондрий в пре- и постсинаптических областях [30]. Эти предположения о повышенном синтезе клеточных макромолекул и возрастающем митохондриальном статусе нейронов согласуются с более высокими уровнями транскрипции гена постсинапического белка PSD-95 при дифференцировке на подложке SP3. Подложка SP3 содержит в своем составе наиболее богатый набор БАП: пептид GRGGL (18 копий в составе РС rS1/9), пептиды RGDS и HBP, все способные взаимодействовать с разными мишенями (соответственно, с NCAM, с интегринами и синдеканами), вызывая таким образом более разнообразный клеточный ответ.

Снижение жизнеспособности клеток по данным обоих тестов по сравнению с контролем при дифференцировке на подложках SP1 и SP2 может свидетельствовать о меньшей эффективности подложек на основе только РС rS2/12. Введение в смесь с rS2/12 ГБ с БАП RGDS, который взаимодействует с интегринами и положительно влияет на адгезию и пролиферацию многих видов клеток, существенно не повышало эффективность подложки. Однако введение ГБ с БАП GRGGL (лиганд NCAM) повышало ее до уровня контроля, что указывает на перспективность использования в тканеинженерных конструкциях ГБ с этим БАП и РС rS1/9, содержащего 18 копий этого пептида.

Представленные данные о наибольшей эффективности подложки SP3 при проведении нейрональной холинергической дифференцировки линии нейробластомы человека SH-SY5Y соответствуют полученным нами ранее результатам на модели дофаминергической дифференцировки нейрональных предшественников, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Полученные там результаты также свидетельствовали о наиболее высокой по MTT-тесту жизнеспособности клеток и повышенных уровнях транскрипции генов ряда синапс-специфичных белков, включая PSD-95, при культивировании на подложке SP3. Таким образом, первичная оценка и сравнение эффективности разрабатываемых матриксов в отношении нейрональной дифференцировки клеток человека может проводиться с использованием более простой и доступной клеточной модели на основе линии SH-SY5Y.

Заключение

Проведенное сравнение нескольких комбинированных подложек на основе рекомбинантных аналогов спидроинов и БАП указывает на наиболее эффективную для проведения направленной нейрональной дифференцировки клеток нейробластомы человека SH-SY5Y подложку, состоящую из смеси РС rS1/9 и rS2/12 и ГБ на основе мономера РС rS1/9, слитого с БАП RGDS (лиганд интегринов) и HBP (лиганд ряда ростовых факторов и синдеканов). Подложки, состоящие только из РС rS2/12 или смеси rS2/12 с ГБ(RGDS), обеспечивали более низкую эффективность нейрональной дифференцировки клеток, однако, использование пептида GRGGL, взаимодействующего с NCAM и входящего также в состав РС rS1/9, приводит к повышению этой эффективности.

Финансирование работы

Работа поддержана Министерством науки и высшего образования РФ (соглашение № 075-15-2023-324).

Соблюдение этических стандартов

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.