Введение

Белок Annexin A2 (ANXA2), кодируемый геном ANXA2, выполняет целый ряд биологических функций. В настоящее время есть данные, полученные in vitro, которые указывают на вовлечение ANXA2 в кальций-зависимый экзоцитоз. ANXA2 участвует в этапах стыковки (докинга), подготовки везикул к слиянию (прайминга) и непосредственно в выделении содержимого везикул. При этом, ANXA2 претерпевает пост-трансляционные модификации во время этих этапов экзоцитоза [1].

Также в настоящее время имеется целый ряд данных, указывающих на вовлечение белка ANXA2 в эндоцитоз. Установлено, что в мономерной форме ANXA2 может взаимодействовать с холестерином и PIP2 (фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат), что позволяет ANXA2 локализоваться на плазматической мембране клеток и на мембране ранних эндосом [2]. Также показано, что ANXA2 может играть роль адаптера между везикулами и F-актином, что указывает на участие ANXA2 почти на всех стадиях эндоцитоза [3, 4].

Известные данные о биологических функциях данного белка позволяют предположить, что нарушение функционирования ANXA2 может служить причиной для развития патологических процессов в нервной клетке [3, 5]. При этом нарушения функциональной активности гена ANXA2 выявлены, в первую очередь, при опухолевых заболеваниях [6], и на данный момент мало изучено влияние этого гена на развитие и функционирование нервной системы. Однако для этого гена была показана роль при заболеваниях нервной системы, таких как болезнь Альцгеймера [7, 8], болезнь Ниманна-Пика типа С [9]. Ранее нами было показано, что ген ANXA2 может быть связан с развитием болезни Паркинсона (БП) [10]. Однако в настоящее время практически нет данных о роли белка ANXA2 в развитии и функционировании нервной системы в норме и при патологии.

В связи с этим в первую очередь наиболее интересным является изучение влияния подавления экспрессии белка ANXA2 на состояние нервной системы, а также на экспрессию его непосредственных мишеней и регуляторов.

Для проведения подобного рода исследований одним из наиболее оптимальных подходов является моделирование подавления экспрессии генов на рыбах Danio rerio (D. rerio) с использованием морфолино. D.rerio (Zebrafish) имеют большую плодовитость и быстрый цикл размножения [11]. Одним из преимуществ этих рыб является наличие прозрачного эмбриона, благодаря чему есть возможность фиксировать разные стадии онтогенеза [12]. Несомненным и одним из самых значительных особенностей этих модельных объектов является то, что основные анатомические структуры, клеточные популяции и биохимические показатели нервной системы у D. rerio и человека эволюционно консервативны. Их мозг достаточно развит для того, чтобы изучать общие принципы функционирования нервной системы и отдельных генов [13]. Так, у человека и рыб имеется 70% генов-ортологов [14].

Ключевую роль в изучении влияния подавления экспрессии гена anxa2a на эмбриональное развитие D. rerio играет правильный подбор структуры и количества используемых морфолино, а также выбор подходящих временных точек для проведения исследования его влияния на функционирование нервной системы. В связи с этим целью настоящего исследования был подбор оптимальной последовательности и количества вводимых морфолино путем анализа фенотипа мальков D. rerio на разных сроках эмбрионального развития.

Материал и методы

Содержание рыб

Рыб Danio rerio линии AB содержали в проточной аквариумной системе (Aqua Schwarz GmbH, Германия) при температуре 28 °C. Световой режим поддерживался автоматически и составлял цикл 14/10 ч день/ночь. Кормление производили в соответствии с возрастом. Взрослых рыб кормили один раз в день науплиями Artemia salina («Барром», Россия) и сухим кормом Sera Vipan (Sera GmbH, Германия). Мальков в возрасте 4 дпф и далее кормили инфузориями Paramecium caudatum (Barrom, Russia) Исследование было проведено в соответствии с руководством ARRIVE 2.0 [15]. Всю экспериментальную работу осуществляли в соответствии с правилами Европейской Конвенции о защите позвоночных животных (СДСЕ №123) и нормами биоэтики (https://cioms.ch/images/ stories/CIOMS/IGP2012.pdf). Работы с животными одобрены этическим комитетом НИЦ «Курчатовский институт» — ИМГ (№12-2017).

Дизайн морфолино

Дизайн последовательностей проводился компанией GeneTools LLC (США). Заказ морфолино проводился также в этой компании. Нами были выбраны 5’-нетранслируемая область (5’НТО) и область старт-кодона гена anxa2a, в соответствии с рекомендациями по подбору морфолиноолигонуклеотидов [15—17]. После подбора морфолино нами проводилось выравнивание последовательностей при использовании ресурса BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). В качестве контроля влияния морфолино на организм эмбриона была выбрана стандартная контрольная последовательность морфолино. Данная последовательность не нацелена на какую-либо последовательность гена и имеет низкую биологическую активность. Также нами использовалась стандартная последовательность, нацеленная на блокирование экспрессии гена p53 для устранения возможных неспецифических эффектов [17]. Последовательности морфолиновых олигонуклеотидов представлены в табл. 1.

Таблица 1. Последовательности морфолиновых олигонуклеотидов

Методика введения морфолиновых олигонуклеотидов

Перед проведением эксперимента лиофилизат разводили в воде MilliQ до стокового 1 мМ раствора. До начала использования аликвоты стоковых растворов хранили при –20 °C. Разведение до рабочих количеств осуществляли в среде Danieau (pH 7,4—7,6). Растворы рабочих количеств вещества хранили при комнатной температуре. Микроинъекцию морфолино в эмбрионы Danio rerio проводили на стадии первого деления дробления в течение 20 мин после оплодотворения с использованием микроманипулятора M-152 (Narishige, Япония) и пневматического микроинъектора PicoPump PV820 (World Precision Instruments Inc., США) под контролем стереомикроскопа Olympus SZX7 (Olympus, Япония). Инъецируемый материал объемом 1 нл вводили в оплодотворенные икринки в желточную область под сформировавшимся бластодиском под углом 45° относительно поверхности, на которой располагался объект. Используемые капилляры с внешним диаметром 20 мкм были получены из стеклянных заготовок #BF100-50-10 (Sutter Instrument, США) на устройстве для вытягивания капилляров Micropipette puller (Sutter Instrument, США). Было проведено 3 повторности каждого эксперимента, количество проинъецированных икринок приведено в табл. 2 и 3.

Таблица 2. Подбор оптимального количества вещества и последовательности морфолино

Примечание. Данные представлены в виде среднего значения наличия деформаций (±) со стандартной ошибкой. Жирным шрифтом выделены достоверные отличия (p-value 0,05) от группы Ко-Ин.

* — в 1 случае вводили по 0,75 нг каждого из морфолниов, суммарное количество 1,5 нг. Во 2-м случае — 1,5 нг + 1,5 нг, суммарное количество 3,0 нг; ** — в 1 случае вводили по 1,5 нг каждого из морфолино, суммарное количество 1,5 нг. Во 2 случае — 3,0 нг + 3,0 нг, суммарное количество 6,0 нг; n — общее количество проанализированных икринок для каждого эксперимента

Таблица 3. Специфические деформации на 2-й дпф

Примечание. Данные представлены в виде среднего значения наличия деформаций (±) со стандартной ошибкой. n — общее количество проанализированных икринок для каждого эксперимента

Оценка эффективности модели.

Оценку эффективности модели на данном этапе проводили посредством анализа изменения фенотипа организма D. rerio с 1-го дня после фертилизации (дпф) по 4-й дпф. Наблюдение за фенотипом производили с использованием микроскопа Микромед MC-2-Zoom вар. 2 CR. Выживаемость эмбрионов и мальков, тип и количество деформаций учитывали каждый день. Общее количество эмбрионов для каждой временной точки принимали за 100%. Долю аномальных эмбрионов рассчитывали отношением к количеству животных, выживших к данному дню. Основной эмбриотоксический эффект оценивали со 2-го дпф. Определялись следующие типы деформаций: аномалии головного отдела, хвостовой части, нарушение развития хорды, циркуляторные эффекты (аномалии развития сердца и околосердечной сумки).

Статистическая обработка.

Статистическую обработку данных осуществляли в программе Statistica (version 8.0. www.statsoft.com). Для сравнительной оценки количества деформаций использовался критерий χ².

Результаты

Изучение влияния морфолино на эмбрионы рыб проводили в несколько этапов. На первом этапе исследовали влияние на эмбрионы D. rerio контрольных морфолино и среды для их разведения. Контрольные морфолино инъецировались в количестве 3 нг. В связи с этим было сформировано три группы животных: интактные, которые не были инъецированы (Ко-Ин), группы мальков с введением контрольных морфолино, разведенных в PBS (Ко-Мо-PBS) и в среде Danieau (Ко-Мо-D). Процент (%) деформаций у группы Ко-Мо-PBS (13,5±4,2) был выше по сравнению с группой Ко-Мо-D (9,3±3,3).

На следующем этапе был проведен анализ на двух временных точках: 2-й дпф и 4-й дпф. Нами проводился выбор оптимального количества вводимых морфолино и их последовательностей.

Результаты количества наблюдаемых деформаций на 4-й дпф представлены в табл. 2.

Так, введение экспериментальных морфолино, направленных на область старт-кодона и 5’НТО приводит к повышению процента деформаций по сравнению с группами Ко-Ин и Ко-Мо-D на 4-й дпф. Максимальный процент деформаций (>50%) наблюдался в группах, которым вводили морфолино, нацеленные на область старт-кодона и 5’НТО в количестве 3,0 нг. Качественная оценка фенотипов показала (рис. 1), что к 4-му дпф у мальков наблюдались следующие деформации: искривление хорды, отек околосердечной сумки и деформации хвоста, а также смешанные деформации (например, одновременный отек околосердечной сумки и изогнутость). Такие типы деформаций наблюдались и в контрольных группах.

Рис. 1. Фенотип мальков к 4-му дпф:

а — нормальный фенотип; б — малое искривление хорды, отек околосердечной сумки; в — искривление хорды, водянка околосердечной сумки; г — искривление хорды, деформация хвостового плавника; д — искривление тела, отек околосердечной сумки, деформация хвоста.

Также нами проводилась количественная и качественная оценка наблюдаемых деформаций при совместном введении морфолино p53 и морфолино, нацеленных на старт-кодон и 5’НТО. В случае совместного введения морфолино 5’НТО+p53 и Старт-кодон+p53 в количестве 3 нг наблюдалось увеличение процента деформаций. При совместном использовании 5’НТО+p53 в количестве 6 нг наблюдалось снижение доли деформаций, но это снижение не является радикальным. При этом наблюдаемые при совместном введении деформации к 4-му дпф фенотипически не отличаются от деформаций, наблюдаемых при введении только морофолино к старт-кодону и 5’НТО, то есть являются неспецифическими при введении морфолино в обеих концентрациях. Таким образом, использование морфолино p53 не оказывает значительного влияния на вызванные морфолино к гену anxa2a нарушения фенотипа к 4-му дпф.

При анализе более ранней временной точки на 2-й дпф был выявлен другой паттерн деформаций, а именно увеличение заднемозгового желудочка и снижение пигментации (рис. 2). При этом данные деформации наблюдались только при введении морфолино к гену anxa2a в количестве 3 нг (см. табл. 3). Наблюдаются некоторые отличия в частоте разных типов деформаций при использовании морфолино к 5’НТО и старт-кодону.

Рис. 2. Специфические деформации на 2-й дпф, 3,0 нг.

а, б — нормальный фенотип; в—д — снижение пигментации, увеличение заднемозгового желудочка. Стрелками обозначено увеличение заднемозгового желудочка.

Следует отметить, что ко 2-му дпф также не выявлены никакие деформации при введении экспериментальных морфолино в количестве 1,5 нг (данные не представлены).

Обсуждение

Ранее нами было показано повышение экспрессии гена Anxa2 на уровне мРНК на ранних стадиях развития процессов нейродегенерации. Предполагается, что изменение экспрессии данного гена может быть связано с развитием компенсаторных механизмов при нейродегенерации через усиление процесса везикулярного транспорта [10]. Для исследования данной гипотезы нами начато изучение роли белка ANXA2 на функционирование нервной системы посредством подавления экспрессии гена anxa2a на модели D. rerio с использованием морфолино.

На первом этапе была проведена оценка влияния среды для разведения морфолино на развитие эмбрионов D. rerio. Нами было показано, что процент деформаций у группы Ко-Мо-PBS (13,5±4,2) был выше по сравнению с группой Ко-Мо-D (9,3±3,3). Поэтому для дальнейшего разведения морфолино нами была выбрана среда Danieau. Полученные нами данные по оценке пригодности оптимальной среды для разведения морфолино подтверждаются другими исследованиями, в которых показано использование среды Danieau [18].

На следующем этапе был проведен выбор оптимального количества вводимых морфолино и последовательностей на двух временных точках: 2-й дпф и 4-й дпф. Оценка деформаций к 4-му дпф показала, с одной стороны, наибольшее количество деформаций у групп, которым вводили последовательности, направленные на области старт-кодона и 5’НТО в количестве 3 нг. С другой стороны, в контрольных группах наблюдался небольшой процент деформаций. Качественная оценка фенотипов показала, что к 4-му дпф у мальков наблюдались схожие типы деформаций как в экспериментальных, так и в контрольных группах, что позволяет предположить, что данные деформации являются неспецифическими.

Также нами было проведено исследование влияния на количество наблюдаемых деформаций совместного введения морфолино p53 и морфолино, нацеленных на область старт-кодона и 5’НТО anxa2a. Как известно, введение морфолино p53 может способствовать устранению возможных неспецифических эффектов [17]. В целом, количественная оценка наблюдаемых деформаций указывает на то, что только в случае введения морфолино в суммарном количестве 6 нг происходит снижение процента деформаций. В случае введения морфолино в суммарном количестве 3 нг снижение деформаций не является радикальным. Совокупность полученных данных указывает на то, что при подавлении экспрессии anxa2a использование морфолино p53 не ведет к устранению неспецифических эффектов.

В то же время на 2-й дпф при введении морфолино, направленных на области старт-кодона и 5’НТО, а также при их совместном введении, наблюдалось увеличение заднемозгового желудочка и снижение пигментации (см. рис. 2, табл. 3).

При этом у контрольных групп никаких деформаций не наблюдалось. На основании данных табл. 3 и рис. 2 можно сделать вывод, что у рыб из всех экспериментальных групп наблюдался сходный фенотип с формированием двух типов нарушений — аномальной пигментации и увеличения размера задемозгового желудочка. Это может указывать на то, что наблюдаемые изменения фенотипа специфичны при подавлении экспрессии гена anxa2a на временной точке 2-й дпф.

Наблюдаемые на 2-й и 4-й дпф различные нарушения морфогенеза мальков начинают развиваться в разных временных точках и на разных этапах эмбриогенеза. Деформации в виде увеличения заднемозгового желудочка и нарушения пигментации фиксируется именно на 2-й дпф, причем только при введении морфолино к гену anxa2a. При дальнейшем развитии эти деформации могут привести как к гибели эмбрионов, так и формированию другого спектра деформаций к 4 дпф. Необходимо также отметить, что при переходе от 2-го дпф к 4-му дпф происходит вылупление эмбриона из икринки, что, в свою очередь, сильно сказывается на характере и спектре как спонтанных, так и индуцированных нарушений фенотипа.

Исходя из всего вышеизложенного, морфолино как к старт-кодону, так и к 5’НТО, влияют на развитие эмбрионов сходным образом в отношении увеличении размера заднемозгового желудочка. При этом морфолино к 5’НТО более активно вызывают нарушения пигментации. Но, с учетом данных литературы [19], для дальнейших исследований на первом этапе нами была выбрана последовательность старт-кодона в количестве 3 нг.

Заключение

Нами показано, что для блокирования экспрессии белка anxa2a наиболее подходят разведенные в среде Danieau морфолино, направленные на область старт-кодона, причем для анализа эффектов морфолино максимально подходит временная точка 2-й дпф. В этой временной точке эффекты морфолино к гену anxa2a являются специфичными. На точке 2-й дпф у развивающихся мальков D.rerio наблюдается деформация заднемозгового желудочка, что позволяет предположить, что изменение экспрессии гена anxa2a может приводить к нарушению функционирования нервной системы.

Финансирование. Работа поддержана Российским научным фондом (номер гранта 22-75-00013).

Соблюдение этических стандартов. В ходе исследования были соблюдены все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных. Исследование было проведено в соответствии с руководством ARRIVE 2.0 [15]. Вся экспериментальная работа осуществлялась в соответствии с правилами Европейской Конвенции о защите позвоночных животных (ETS №123) и нормами биоэтики (https://cioms.ch/images/ stories/CIOMS/IGP2012.pdf). Работы с животными одобрены этическим комитетом НИЦ «Курчатовский институт» — ИМГ (№12-2017).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.