Получение и характеристика крысиных моноклональных антител против антигена PAL Legionella spp.

Легионеллезные пневмонии, по разным данным, составляют от 0,5 до 16% всех случаев инфекций нижних дыхательных путей [1]. Представители рода Legionella устойчивы во внешней среде и способны колонизировать водные системы, в том числе искусственные. Являясь факультативными внутриклеточными паразитами, представители вида L. pneumophila несут серьезные риски развития заболевания, особенно у иммунокомпрометированных людей, людей старшей возрастной группы, людей с сопутствующими заболеваниями дыхательных путей и факторами риска [2]. Существенная доля случаев пневмонии в РФ, в том числе с летальным исходом, имеет неуточненную природу, что может быть связано с несовершенством применяемых методов диагностики [3]. Между тем определение этиологического агента при пневмониях, особенно с тяжелым течением, играет значительную роль для выбора эффективной антибиотикотерапии и тактики лечения, а препаратами выбора в этом случае становятся фторхинолоны и макролиды как единственные препараты с доказанной эффективностью в отношении рода Legionella [2, 4].

В настоящее время для всех пациентов с диагнозом «пневмония» рекомендованы микробиологические исследования отделяемого дыхательных путей, выявление ДНК-возбудителя, выявление специфических иммуноглобулинов в динамике, а также экспресс-тесты на пневмококковую и легионеллезную антигенурию. Однако выполнение бактериологического посева с выделением и определением патогенной культуры занимает в среднем 4—5 сут, а отрицательный результат определения уринарного антигена легионелл и ДНК легионелл не исключает диагноза легионеллезной инфекции, поскольку эти тесты валидированы только для легионелл 1-й серогруппы. А нарастание титров антилегионеллезных антител определяется не ранее чем через 3 нед от начала заболевания [5]. Основным этиологическим агентом легионеллезных пневмоний действительно является L. pneumophila (до 90% случаев), а внутри этой группы превалируют легионеллы серогруппы I (не менее 80% случаев [6]). Но также патогенными для человека считаются представители иных серогрупп L. pneumophila, а кроме них, заболевание вызывают также L. micdadei, L. longbeacheae, L. dumoffii, L. bozemanii и некоторые другие [7].

Пептидогликан-ассоциированный липопротеин (peptidoglycan-associated lipoprotein, PAL) представляет собой белок внешней мембраны грамотрицательных бактерий, обеспечивающий в том числе патогенез бактерий. Белок PAL родоспецифичен для Legionella spp., может быть применен как для детекции легионелл, так и для иммунопрофилактики [8]. PAL можно определить в моче пациентов с легионеллезной пневмонией иммунохимическими методами, начиная со 2—3-го дня от манифестации заболевания, такие тесты не требуют накопления бактериологического материала и могут быть выполнены достаточно быстро — за несколько часов [9, 10].

Цель данной работы — получение крысиных моноклональных антител (МКА) против рекомбинантного белка PAL L. pneumophila, характеризующихся родоспецифичностью, что впоследствии позволит использовать их в качестве основы для разработки новых экспресс-тестов для выявления патогенных легионелл в образцах мочи пациентов с подозрением на легионеллез.

Получение рекомбинантного белка PAL L. pneumophila. Получение экспрессионной конструкции, экспрессия рекомбинантного белка PAL (rPAL) в клетках Escherichia coli, его выделение и очистка описаны в более ранних работах [11, 12].

Схема иммунизации крыс и выбор животных для получения спленоцитов. В качестве антигенной эмульсии для иммунизации лабораторных животных использовали полный адъювант Фрейнда («Sigma-Aldrich», США), смешанный в объемном соотношении 1:1 с белком PAL (исходная концентрация 1 мг/мл). Для иммунизации одного животного использовали 150 мкг белка. Антиген вводили внутримышечно в основание хвоста молодым самкам крыс линии Wistar (Филиал «Андреевка» ФГБУН «НЦБМТ» ФМБА, Андреевка, Россия). Бустерную дозу антигена животным вводили через 3 нед в том же количестве, но без добавления адъюванта. Специфическую активность иммуноглобулинов класса G сыворотки крови иммунизированных животных в отношении rPAL определяли методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Для этого кровь на анализ отбирали из ретроорбитального синуса крыс не ранее, чем через 2 нед после первой иммунизации и через 2 дня после второй. Сыворотку крови крыс титровали против иммобилизованного в лунках планшета rPAL (1 мкг/лунка). Связывание иммуноглобулинов с антигеном детектировали при помощи козьих антител против целой молекулы крысиного IgG, конъюгированных с пероксидазой хрена. Реакцию визуализировали при помощи хромогенного реактива тетраметилбензидина (TMB; «Thermo», США), учитывали оптическую плотность в лунках планшета при помощи планшетного спектрофотометра при длине волны детектора 450 нм. Предельным титром считали такое разведение сыворотки, значения оптической плотности которого вдвое превышало значения в лунке отрицательного контроля. Значения оптической плотности в отрицательном контроле не превышали 0,15. Животных с наибольшим значением титров специфических антител подвергали эвтаназии на 3-й день от последней иммунизации, после чего изымали селезенку.

Получение гибридом-продуцентов МКА. Спленоциты крыс получали перетиранием селезенки через нейлоновое сито с диаметром пор 100 мкм («Fisherbrand», США) с последующим отделением лимфоцитарной фракции на градиенте плотности при помощи раствора Ficoll-Paque PLUS («GE Healthcare», Великобритания). В качестве партнера для слияния использовали мышиную миеломную линию клеток Sp2/0-Ag14 («ATCC», США). Гибридизацию производили двумя методами: классическим методом Келера и Мильштейна с использованием в качестве агента для слияния раствора PEG-DMSO [13], а также методом электрослияния на приборе BTX ECM2001 («Harvard Apparatus», США) с использованием микрослайда Model 453 («BTX», США) в среде BTXpress Cytofusion Medium C («BTX», США). В обоих случаях для слияния использовали спленоциты и клетки миеломной линии Sp2/0-Ag14 в соотношении 3:1. Брали равное количество клеток для осуществления гибридизации каждым из методов.

Процедуру электрослияния осуществляли следующим образом: преэлектропорационный диэлектрофорез клеток проводили при значении напряжения 50 В в течение 30 с, затем подавали 2 прямоугольных импульса напряжением 500 В продолжительностью 30 мкс каждый (электропорация), после чего проводили постэлектропорационный диэлектрофорез при значении напряжения 50 В в течение 30 с с последующим затуханием до нуля за 9 с. После электрослияния содержимое микрослайда оставляли на 30 мин при комнатной температуре.

После слияния клетки культивировали в 96-луночных планшетах без фидерного слоя в среде DMEM («Sigma», США) с добавлением 20% эмбриональной бычьей сыворотки (HyClone, «GE Healthcare», США), 2 мМ L-глутамина («ПанЭко», Россия), 100 мкг/мл гентамицина («ПанЭко», Россия), с однократным раствором гипоксантина-аминоптерина-тимидина (HAT) (Gibco, «Thermo Fisher», США). Селекцию на среде с HAT проводили в течение 3 нед с заменой среды по мере закисления.

Скрининг гибридом-продуцентов МКА. Скрининг культуральной жидкости из лунок планшетов, содержащих гибридные клетки, осуществляли методом непрямого твердофазного ИФА в отношении rPAL, начиная с 10-го дня после гибридизации. Для скрининга из каждой исследуемой лунки, содержащей гибридомы, отбирали 100 мкл культуральной жидкости, которую помещали в лунку планшета с иммобилизованным на его поверхности белком rPAL. Последующие условия исполнения ИФА аналогичны описанным выше. Скрининг каждой перспективной лунки с гибридными клетками проводился трижды. Гибридомы из лунок, показавших стабильные или прогрессирующие результаты в ИФА, подвергали клонированию методом предельных разведений. Моноклональность гибридом в лунках культурального планшета контролировали визуально при помощи микроскопа. Продукцию специфических к rPAL антител класса G контролировали при помощи ИФА, как описано выше. Процедуру клонирования проводили не менее 2 раз для каждого продуцента. Каждый раз отбирали клоны-продуценты со стабильно высокими значениями оптической плотности в ИФА, а также морфологически однородные. Все полученные клоны культивировали с масштабированием, штаммы полученных гибридом подвергали криоконсервации.

Оценивали количество стабильных клонов-продуцентов МКА, полученное в результате слияния крысиных спленоцитов с мышиной миеломной линией каждым из двух методов.

Определение специфической активности антител. Активность полученных МКА определяли методом дот-блот-иммуноанализа. В анализируемую панель вошли исходный белок-мишень, штаммы L. pneumophila разных серогрупп и иные представители рода Legionella, а также штаммы грамотрицательных бактерий, белок PAL которых был максимально идентичен легионеллезному (согласно базе данных UniProt), возбудители пневмоний и инфекций мочевыводящих путей (см. таблицу). Все штаммы были получены из ГКПМ ФБУН «ГНЦ ПМБ». Взвеси микроорганизмов, изначально приготовленные в концентрации 10⁹ м.к./мл, перед проведением анализа были инактивированы кипячением. Антигены наносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond ECL («GE Healthcare», Великобритания) с помощью системы микрофильтрации Bio-Dot («Bio-Rad», США) в количестве 1 мкг/пятно (для белкового антигена) или 10⁶ м.к./пятно (для инактивированных бактериальных взвесей). Свободные валентности мембраны блокировали обезжиренным безлактозным молоком. Затем мембраны инкубировали в культуральной жидкости, полученной вследствие культивирования монослоя клонированных гибридом-продуцентов МКА. Детектировали связывание МКА из культуральной жидкости с мишенями на мембране при помощи козьих антител против целой молекулы крысиного IgG, конъюгированных с пероксидазой хрена. Визуализировали связывание раствором диаминобензидина с добавлением хлоридов никеля и кобальта (все — «Sigma», США).

Выбор крысиной модели для получения антител к rPAL обусловлен рядом преимуществ: иммунная система крыс более выраженно реагирует на простые белковые антигены, нежели мышиная; а также, несмотря на более низкую эффективность клеточного слияния, полученные гибридомы остаются стабильными годами и довольно редко нуждаются в повторном клонировании [14].

Крысы были иммунизированы по короткому протоколу, исходя из предположения о том, что между 2-й и 3-й неделями после первой инъекции идет наибольшая выработка специфичных антител класса G [15]. Титры антител к rPAL через 2 нед после иммунизации у разных животных варьировали от 1:4000 до 1:32 000, через 3 нед — от 1:8000 до 1:256 000. В итоге из 6 животных были отобраны 3 гипериммунных крысы с титрами не менее 1:128 000.

Эффективность гибридизации при использовании разных методов слияния на начальном этапе оценивали по количеству позитивных по результатам ИФА лунок с гибридомами через 10 дней после процедуры слияния. Общая эффективность при электрослиянии составила 9,17%, а при слиянии с использованием PEG-DMSO — 16,46% [15]. После проведения клонирования оценивали количество полученных стабильных клонов-продуцентов. В результате было получено 12 стабильных индивидуальных клонов гибридом: 5 — методом электрослияния и 7 — методом Келера и Мильштейна. Эти результаты не могут быть обработаны с применением методов статистики ввиду того, что в эксперименте участвовало недостаточное количество животных.

Все полученные крысиные МКА высокоспецифичны к целевому белку rPAL, с разной степенью интенсивности взаимодействуют со всеми используемыми в панели штаммами вида L. pneumophila как референсными, так и клиническими изолятами, а также с представителями других видов Legionella spp. (см. таблицу). Это можно объяснить различной экспрессией белка-мишени PAL у разных штаммов. МКА склонны, но по-разному, взаимодействовать с остальными представителями Legionella spp., что говорит о структурных различиях белка PAL внутри рода Legionella. При сравнительном анализе наиболее схожих с исходным антигеном PAL (P26493 (PAL_LEGPN)) последовательностей, найденных в системе UniProt, внутривидовая идентичность PAL составляет 100%, а внутри рода — до 71,2%. Все полученные МКА не проявляют специфичности ни к каким иным бактериальным штаммам, кроме представителей вида Staphylococcus aureus, что является предсказуемым результатом, так как данный вид синтезирует мембранный белок A, с которым взаимодействуют любые иммуноглобулины класса G [16]. Таким образом, ложноположительные результаты при взаимодействии антител со S. aureus в любом исследовании методами иммуноанализа не могут быть полностью исключены.

Результаты скрининга специфической активности анти-rPAL моноклональных антител

№	Серогруппы		Клоны крысиных моноклональных антител (mabPAL)
			2.4	2.16	2.33	5.2	5.10	5.14	6.2	6.3	6.23	6.48	6.58	6.75
1	rPAL		+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++
Микроорганизмы рода Legionella:
2	Legionella pneumophila ssp pneumophila АТСС 33152	Серогруппа 1	++	+	++	+	++	+	++	++	++	+	+	++
3	Legionella pneumophila ssp. pneumophila АТСС 33215	Серогруппа 6	++	+	++	+	++	+	++	+	++	++	+	++
4	Legionella pneumophila ssp. pneumophila Strain Bloomington АТСС 33155	Серогруппа 3	++	+	++	+	+	+	+	+	+	+	+	+
5	Legionella pneumophila ssp. fraseri АТСС 33156	Серогруппа 4	+++	++	+++	+	+++	+	+++	++	+++	+	++	+++
6	Legionella pneumophila ssp. pneumophila (Калининград)	Серогруппа 1*	+++	++	+++	++	+++	++	+++	++	+++	++	++	+++
7	Legionella pneumophila ssp. pneumophila Белоус (Пыжма)	Серогруппа 1*	+++	++	+++	+	+++	+	+++	+	+++	+	+	+++
8	Legionella pneumophila 0146 (Сочи)	Серогруппа 2-14*	++	+	+++	+	++	+	+	+	++	+	+	+
9	Legionella pneumophila 0225 (Сочи)	Серогруппа 1*	+++	++	+++	+	+++	++	+++	++	+++	++	++	+++
10	Legionella pneumophila 439-406 (Санкт-Петербург)	Серогруппа 1*	+++	++	+++	++	+++	++	+++	++	+++	++	++	+++
11	Legionella pneumophila №13 (Ростов)	Серогруппа 1*	+++	++	+++	++	+++	++	+++	++	+++	++	++	+++
12	Legionella pneumophila №1742 (Хабаровск)	Серогруппа 1*	++	++	+++	+	+++	+	+++	+	+++	+	+	+++
13	Legionella longbeacheae ATCC 33462		+++	+	++	+	+++	+++	+++	—	—	+++	+	+
14	Legionella micdadei NCTC 11371		+++	—	+++	—	—	—	—	+	—	—	—	+++
Гетерологичные микроорганизмы:
15	Acinetobacter baumannii 1401		—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—
16	Acinetobacter baumannii1388		—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—
17	Burkholderia cenocepacia 1615		—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—
18	Burkholderia cepacia 1939		—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—
19	Citrobacter freundii 1297		—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—
20	Enterobacter aerogenes ATCC 13048		—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—
21	Escherichia coli 675		—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—
22	Escherichia coli O104:H7 (Германия)		—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—
23	Haemophilus influenzae ATCC 9006		—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—
24	Klebsiella pneumoniae ATCC 700603		—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—
25	Moraxella catarrhalis ATCC 27853		—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—
26	Morganella morganii 39(51)		—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—
27	Proteus mirabilis 46		—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—
28	Proteus vulgaris HX 19222		—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—
29	Pseudomonas aeruginosa 3016		—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—
30	Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853		—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—
31	Pseudomonas stutzeri 903		—	—	—	—	—	—	—	—	В настоящий момент в России производятся только 2 тест-системы для идентификации легионелл с использованием моноклональных или поликлональных антител — иммунохроматографический тест на основе меченных золотом антител против ЛПС L. pneumophila 1 (набор реагентов для быстрой идентификации возбудителя легионеллеза «Тест-полоска L. pneumophila 1», РЗН 2013/742) и латексная тест-система на основе антител против мембранного белка p29 L. pneumophila 1 (набор реагентов для быстрой идентификации LEGIONELLA PNEUMOPHILA в реакции латекс-агглютинации, жидкий, «латексная тест-система LEGIONELLA PNEUMOPHILA серотип 1», РЗН 2013/1278 производства ФБУН «ГНЦ ПМБ», Оболенск). Также доступны, зарегистрированы и применяются в РФ тест-системы на основе иммуноанализа для выявления легионеллезного антигена в моче производства «Alere Inc.», США: ИХ-тест BinaxNOW Legionella Urinary Antigen Card и ИФА-тест Binax Legionella Urinary Antigen EIA (ФСЗ 2008/02110). Обе тест-системы валидированы только для определения в моче антигена L. pheumophila серогруппы 1. С использованием полученных нами крысиных МКА (например, mabPAL 2.4 или 2.33) возможно создать диагностическую тест-систему, способную эффективно выявлять не только серогруппу 1 L. pneumophila, но и легионелл прочих серогрупп и видов. Несмотря на то что подавляющее количество случаев легионеллезной инфекции вызвано L. pneumophila 1, другие серогруппы и виды вызывают не менее тяжелые пневмонии. Важно на ранних сроках заболевания идентифицировать легионеллезную инфекцию независимо от того, каким видом легионелл она была вызвана, поскольку длительная неэффективная антибиотикотерапия усугубляет течение болезни и увеличивает шанс неблагоприятного исхода. Сконструированная на основе полученных антител тест-система будет определять не только наиболее значимую L. pneumophila серогруппы 1, но и остальных легионелл в пределах рода. Данные литературы подтверждают эту возможность [8], но для более точного определения специфичности полученных МКА ко всем легионеллам необходимо расширить коллекцию штаммов для дальнейшего исследования специфической активности полученных МКА. Заключение Оба использованных в работе метода получения гибридных клеток-продуцентов крысиных МКА, по нашему мнению, показали хороший результат. Несмотря на сравнительно бóльшую эффективность слияния классическим методом с применением PEG-DMSO на начальном этапе (16,46% положительных по продукции лунок против 9,17% после электрослияния), конечный результат, выражающийся в получении стабильных клонов, продуцирующих специфические МКА, для обоих методов слияния не имеет значительных отличий. Полученные в результате работы МКА обладают, вероятно, различной эпитопной специфичностью в отношении rPAL, потому имеют отличающийся профиль детекции в отношении использованной панели микроорганизмов. Применение комбинации МКА mabPAL_2.4 и mabPAL_2.23 позволяет получить смесь, успешно детектирующую все представленные в работе штаммы рода Legionella, mabPAL_6.23 можно использовать в качестве дополнения, выявляющего лишь представителей вида Legionella pneumophila. Финансирование. Работа выполнена в рамках НИР 054 «Разработка нового поколения высокоэффективных тест-систем для детекции возбудителей нозокомиальных инфекций на основе метода иммуно-аптамерной ПЦР». Соблюдение этических стандартов. Все протоколы экспериментов с животными одобрены Комитетом по биоэтике ГНЦ ПМБ, все работы проводили в соответствии с ГОСТ 33216—2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными». Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей в качестве объектов исследований. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Литература / References Чучалин А.Г., Синопальников А.И., Тартаковский И.С., Карпова Т.И., Дронина Ю.Е., Садретдинова О.В. и др. Практические рекомендации по диагностике и лечению легионеллезной инфекции, вызываемой Legionella pneumophila серогруппы 1. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2009;11(1):4-13. Чучалин А.Г., Синопальников А.И., Козлов Р.С., Авдеев С.Н., Тюрин И.Е., Руднов В.А., и др. Клинические рекомендации. Внебольничная пневмония у взрослых. 2019. Ссылка активна на 30.10.20. https://rushiv.ru/vnebolnichnaya-pnevmoniya-u-vzroslyh-klinicheskie-rekomendatsii/ Груздева О.А., Филатов Н.Н., Тартаковский И.С., Марьин Г.Г. Эпидемиологические особенности легионеллеза в Российской Федерации. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2017;22(2):86-90. https://doi.org/10.18821/1560-9529-2017-22-2-86-92 Чучалин А.Г., Синопальников А.И., Козлов Р.С., Авдеев С.Н., Тюрин И.Е., Руднов В.А. и др. Клинические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике тяжелой внебольничной пневмонии у взрослых. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2015;17(2):84-126. Профилактика легионеллеза: Санитарно-эпидемиологические правила 3.1.2.2626-10. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора; 2010;22. Тартаковский И.С. Диагностика и профилактика легионеллеза. Поликлиника. 2015;2-1:40-43. Ерусланов Б.В., Светоч Э.А., Мицевич И.П. Легионеллез и его лабораторная диагностика. Бактериология. 2018;3(3):58-67. Kim MJ, Sohn JW, Park DW, Park SC, Chun BC. Characterization of a lipoprotein common to Legionella species as a urinary broad-spectrum antigen for diagnosis of Legionnaires’ disease. Journal of clinical microbiology. 2003;41(7):2974-2979. https://doi.org/10.1128/jcm.41.7.2974-2979.2003 Jarraud S, Descours G, Ginevra C, Lina G, Etienne J. Identification of Legionella in Clinical Samples. In: Buchrieser C., Hilbi H. (eds) Legionella. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Totowa, NJ: Humana Press; 2012;954:27-56. https://doi.org/10.1007/978-1-62703-161-5_2 Shimada T, Noguchi Y, Jackson JL, Miyashita J, Hayashino Y, Kamiya T, et al. Systematic Review and Metaanalysis. Chest, Elsevier; 2009;136(6):1576-1585. https://doi.org/10.1378/chest.08-2602 Зенинская Н.А., Козырь А.В., Колесников А.В., Рябко А.К., Марьин М.А., Лисицкая Л.А. и др. Способ получения рекомбинантного пептидогликан-ассоциированного липопротеина (PAL) Legionella pneumophila. Патент РФ на изобретение №2634385/26.10.2017 Бюл. №30. Ссылка активна на 30.10.20. https://new.fips.ru/registers-doc-view/fips_servlet?DB=RUPAT&DocNumber=0002634385&TypeFile=htm Зенинская Н.А., Рябко А.К., Колесников А.В., Козырь А.В., Марьин М.А., Фирстова В.В. и др. Получение и иммуногенные свойства рекомбинантного пептидогликан-ассоциированного липопротеина (PAL) Legionella pneumophila. Иммунология. 2018;39(1):50-55. Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975;256(5517):495-497. https://doi.org/10.1038/256495a0 Campbell A. Monoclonal Antibody and Immunosensor Technology — The Production and Application of Rodent and Human Monoclonal Antibodies. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Elsevier; 1991. https://doi.org/10.1016/s0075-7535(08)70055-x Sado Y, Inoue S, Tomono Y, Omori H. Lymphocytes from Enlarged Iliac Lymph Nodes as Fusion Partners for the Production of Monoclonal Antibodies after a Single Tail Base Immunization Attempt. ACTA HISTOCHEMICA ET CYTOCHEMICA. 2006;39(3):89-94. https://doi.org/10.1267/ahc.06001 Hober S, Nord K, Linhult M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B. 2007;848(1):40-47. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2006.09.030 Рекомендуем статьи по данной теме: Иммунология остеопороза: от механизмов к терапевтическим стратегиям.Адаптивная медицинская иммунология и вопросы общественного здоровья. 2026;2(1):30-36 Клиническая эффективность моноклонального антитела дупилумаб в терапии рецидивирующего полипозного риносинусита тяжелого течения без бронхиальной астмы.Российская ринология. 2025;33(4):32-37 Моноклональные антитела в терапии рецидивирующего полипозного риносинусита. Обзор литературы.Вестник оториноларингологии. 2025;90(4):96-104