Введение
Колорадский жук Leptinotarsa decemlineata Say (Ld) — это важнейший вредитель картофеля [1]. Главной проблемой в защите картофеля от этого вредителя является формирование высокорезистентных к инсектицидам популяций Ld [2]. Почти все (90%) коммерческие биоинсектициды производятся на основе штаммов Bacillus thuringiensis [1]. Зачастую B. thuringiensis и Cry-токсины рассматриваются в том же аспекте, что и химические пестициды. Сообщается о штаммах B. thuringiensis, которые могут существовать эндофитно, то есть во внутренних тканях растений, где они защищены от внешних воздействий [3], и, по-видимому, способны индуцировать защитные реакции растений против фитофагов [5].
Цель исследования — влияние штаммов B. thuringiensis В-5351 и B. thuringiensis B-5658 на транскрипционную активность гена ингибитора протеиназ и активность его продукта в растениях картофеля и на смертность личинок колорадского жука после поедания растений, содержащих эндофитные бактерии.
Материал и методы
Использовали штаммы B. thuringiensis В-5351 и B. thuringiensis B-5658, пробирочные растения картофеля сорта Ранняя Роза, личинки Ld III возраста (сбор 2020 г., пос. Чишмы, Башкортостан). Об эндофитных свойствах бактерий судили по числу КОЕ бактерий на 1 г сырой массы растений через 7 дней после обработки [5], в тот же срок производили однократное кормление личинок растениями с эндофитами либо листьями с нанесенной на поверхность суспензией бактерий, выращенных на жидкой среде LB (108 кл/мл), как описано в [5], после чего на 10-е сутки подсчитывали смертность личинок колорадского жука. В каждом варианте исследовали не менее 30 личинок. Транскрипционную активность гена ингибитора трипсина AY089962 исследовали при помощи Real-Time ПЦР, активность его белкового продукта изучали с использованием субстрата БАПНА [6] через 1 ч после повреждения растений личинками Ld. В качестве контроля использовали неповрежденные растения, обработанные водой. Измерения проводили в трех биологических повторностях в двух независимых экспериментах. Для статистической обработки использовали «Статистика 2.0» (Россия), о значимости различий судили по t-тесту Тьюки.
Результаты и обсуждение
Во внутренних тканях растений количество бактерий B. thuringiensis B-5351 превышает количество B. thuringiensis B-5689 на один порядок (таблица). При этом суспензия последнего вызывает значительное увеличение смертности личинок. Питание растениями, содержащими эндофитные клетки B. thuringiensis B-5689, приводит к намного меньшей гибели личинок, а в случае B. thuringiensis B-5351 смертность личинок составляет более 50%.
Эндофитность штаммов B. thuringiensis и их влияние на смертность личинок Ld (10 сут после кормления).
| Показатель | Контроль | B-5689 | B-5351 | |
| КОЕ×103/г [CFU/×103/г] | 0 | 3,0±0,11a* | 70,0±12,3b | |
| Смертность, % | Суспензия | 4,2±0,5a | 64,6±8,3b | 28,7±7,2c |
| Эндофиты | 6,7±0,5a | 19,1±4,8b | 55,6±5,8c | |
Примечание. * — статистически значимые отличия по соответствующему параметру согласно t-тесту Тьюки.
Показано, что B. thuringiensis B-5351 увеличивает активность ингибитора трипсина как в интактных, так и в поврежденных личинками Ld растениях картофеля (рисунок, а). При этом содержание транскриптов гена AY089962 в поврежденных растениях, обработанных водой, увеличивалось в 2,5 раза по сравнению с контролем, а в обработанных B. thuringiensis B-5351 — в 3,4 раза. B. thuringiensis B-5689 не оказывал влияния на оба параметра (рисунок, б).
Также мы установили, что штамм B. thuringiensis В-5351 проникает во внутренние ткани растений пшеницы и картофеля, и его инсектицидный эффект против личинок Ld обусловлен как синтезом Cry-токсинов [7], так и стимуляцией транскрипции гена ингибитора протеиназ и его белкового продукта в растениях-хозяевах. Ингибиторы протеиназ являются важными защитными соединениями, снижающими активность ферментов пищеварительного тракта насекомых, и, соответственно, пищевую привлекательность растений. Отмечается, что ограничение развития резистентности насекомых к инсектицидам возможно при многофакторном воздействии на организм вредителей [2], как описано нами в случае обработки бактериями B. thuringiensis В-5351.
Влияние B. thuringiensis на активность ингибитора трипсина (а) и количество транскриптов кодирующего его гена AY089962 (б) через 1 ч после повреждения растений Ld. (различные буквы обозначают статистически значимые отличия по соответствующему параметру согласно t-тесту Тьюки).
Заключение
Смертность личинок после кормления суспензией бактерий B. thuringiensis-5689 была наиболее высокой, что говорит об эффективности продуцируемых ими токсинов, однако инсектицидный эффект этих бактерий, использованных в качестве эндофита, был существенно ниже, чем у B. thuringiensis В-5351, как мы предполагаем, из-за их низкой способности проникать во внутренние ткани растений и влиять на защитные реакции растений против фитофагов.
Финансирование. Работа выполнена в рамках проекта РНФ №20-76-00003.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
*Статья подготовлена по материалам доклада на IX Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике (март 2021 г.).