Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.
Генетическое и морфологическое разнообразие вьетнамской популяции Burkholderia thailandensis
Журнал: Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2022;40(1): 37‑45
Прочитано: 2335 раз
Как цитировать:
Burkholderia thailandensis — аэробная, подвижная, грамотрицательная, неферментирующая сапрофитная бетапротеобактерия, филогенетически близкая возбудителям мелиоидоза и сапа (B. pseudomallei и B. mallei) и занимающая с B. pseudomallei одни и те же экологические ниши. Является оппортунистическим внутриклеточным патогеном. Впервые B. thailandensis была выделена из почвы в Таиланде и до получения в 1998 г. видового статуса [1] считалась слабовирулентным биотипом B. pseudomallei, отличающимся способностью утилизировать арабинозу [2].
Известные случаи заболевания людей, обусловленные B. thailandensis, немногочисленны, возможно, по причине сложности дифференциации B. thailandensis и B. pseudomallei. Тем не менее описаны и локализованные [3], и генерализованные формы инфекции. Причем этиологическим агентом тяжелых форм заболевания являлись как вариантные штаммы B. thailandensis [4], так и штаммы основной популяции вида [5] и клиническую значимость этой обитающей в почве бактерии еще предстоит выяснить.
B. thailandensis и B. pseudomallei имеют единый план организации геномов, каждый из которых представлен двумя высокосинтенными кольцевыми хромосомами со сравнимым количеством кодирующих последовательностей (CDS) при общем репертуаре генов основных и вспомогательных путей метаболизма [6]. B. thailandensis экспрессирует гомологи большинства известных факторов вирулентности B. pseudomallei. Оба вида при инфекции используют схожие молекулярные стратегии для внутриклеточного размножения и межклеточного распространения путем индукции образования многоядерных гигантских клеток (MNGC) [7, 8].
Одним из основных факторов вирулентности B. pseudomallei является капсула [9]. Кластер генов (wcb оперон) биосинтеза и экспорта капсульного полисахарида (CPS) размером 34,5 т.п.н., состоящий из 24 генов wcbT — manC, локусы BPS_RS14975 — BPS_RS15090, локализован у типового штамма B. pseudomallei K96243 (NC_006350.1) между 3327179 и 3361667 нуклеотидами первой хромосомы. Вместо кластера CPS у большинства штаммов B. thailandensis присутствует кластер генов биосинтеза экзополисахарида (EPS) [10] размером 33,3 т.п.н., в состав которого входит 21 ген (локусы BTH_RS18945 — BTH_RS19040). Так же, как и у возбудителя мелиоидоза, у B. thailandensis кластер локализован на первой хромосоме (у типового штамма E264 (NC_007651.1) между 1485538 и 1518832 нуклеотидами). Фланкирующие гены оперона имеют у этих видов достаточно высокое сходство (в среднем, около 76%), а гены средней части гомологичными не являются. Предполагают, что EPS является исходным, а CPS был приобретен B. pseudomallei позже путем горизонтального переноса. Считается, что замена ранее существовавшего экзополисахарида альтернативным вариантом, способным противостоять иммунному прессу инфицированного хозяина, была одним из ключевых событий в эволюции патогенности возбудителя мелиоидоза [6]. К настоящему времени установлено, что полисахаридная капсула предотвращает опсонизацию и фагоцитоз B. pseudomallei [11, 12], а также обеспечивает снижение уровня формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек (NETs) [13].
В последнее десятилетие было обнаружено существование вариантных по структуре капсул штаммов B. thailandensis, обозначенных BTCV (Burkholderia thailandensis capsular variant), у которых вместо кластера EPS присутствует оперон, обладающий высокой гомологией (около 95%) с кластером генов CPS B. pseudomallei, получивший название Bp-like CPS. BTCV штаммы филогенетически отличны от основной популяции B. thailandensis и формируют отдельную кладу [4, 10].
Подобно wcb оперону, кластер генов Bp-like CPS у BTCV штаммов имеет признаки, свидетельствующие о его горизонтальном приобретении [10]. Bp-like CPS B. thailandensis структурно неотличим от CPS, экспрессируемого B. pseudomallei [14], и вариантные штаммы демонстрируют ряд свойств, присущих возбудителю мелиоидоза морфологию колоний на плотных питательных средах, особенно на агаре Эшдауна, устойчивость к связыванию комплемента, выживание в макрофагах [7, 10] и ингибирование зависимого от активных форм кислорода образования NET [13].
Вопрос глобальной распространенности вариантных штаммов в настоящее время привлекает пристальное внимание. Первый из почвенных изолятов (B. thailandensis E555) был выделен в Камбодже в 2005 г. [10]. В последние годы BTCV штаммы обнаружены в почве ряда стран Юго-Восточной Азии, на юге Северной Америки и в Пуэрто-Рико, а также в Западной и Центральной Африке [4, 15—17].
В настоящей работе показано присутствие BTCV штаммов B. thailandensis на территории Вьетнама и исследовано влияние структурных особенностей отдельных белковых продуктов, обеспечивающих у B. thailandensis синтез экзополисахарида, на морфологические характеристики штаммов.
Бактериальные штаммы и методы идентификации. В работе изучены 87 штаммов B. thailandensis и 2 штамма B. pseudomallei, выделенных из почвы южного и центрального Вьетнама в ходе совместных российско-вьетнамских мониторинговых исследований в 2016—2019 гг. Все работы с живыми культурами проведены на базе лаборатории молекулярной биологии Российско-Вьетнамского Тропического научно-исследовательского и технологического центра (Ханой, СРВ). Видовую принадлежность определяли методом мультиплексной ПЦР, описанным ранее [18]. Для анализа преимущественно отбирали штаммы B. thailandensis, образующие шероховатые колонии. Морфологию колоний исследованных штаммов сравнивали по фотографиям с типовым штаммом B. thailandensis E264 из коллекции ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (любезно предоставлен доктором D.E. Woods, университет Калгари, Канада).
Выделение ДНК и ПЦР. ДНК выделяли из предварительно обеззараженной согласно МУ 1.3.2569-09 бактериальной суспензии с использованием GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific, Литва) в соответствии с инструкцией производителя. Наличие кластера генов Bp-like CPS определяли в ПЦР с разработанным набором из 6 пар праймеров (табл. 1).
Таблица 1. Характеристики праймеров
| Праймер | Последовательность 5’—3’ | Генетическая мишень | Размер ампликона (п. н.) | Температура отжига (°C) |
| wcbO-F | CTACCAGCCTCCGTCCAAAA | Ген биосинтеза капсульного белка B. thailandensis 2003015869 (Genbank ac. CP013360.1, локус WI24_03735) | 400 | 59,1 °C |
| wcbO-R | TGCAGCTCAATTCCGACTCC | |||
| wcbJ-F | TTCTCGAAACGCGCAGAACT | Ген биосинтеза капсульного белка B. thailandensis 2003015869 (Genbank ac. CP013360.1 локус WI24_03705) | 342 | 58,6 °C |
| wcbJ-R | TCGGCTTTCCTACGTGTTCTC | |||
| wcbI-F | AAACCACTCGAACTGCTCCA | Ген биосинтеза капсульного белка B. thailandensis 2003015869 (Genbank ac. CP013360.1 локус WI24_03700) | 332 | 58,4 °C |
| wcbI-R | GTGAAAACGACGGTGGGAAG | |||
| wcbH-F | TTTCCGACGCCAACTTCTCC | Ген гликозилтрансферазы B. thailandensis 2003015869 (Genbank ac. CP013360.1 локус WI24_03695) | 337 | 60,8 °C |
| wcbH-R | CTGGACGGTTTCGTTCACCA | |||
| wcbF-F | CGCACAAGCGGAGTAGTCAA | Ген биосинтеза капсульного белка B. thailandensis 2003015869 (Genbank ac. CP013360.1 локус WI24_03685) | 278 | 58,9 °C |
| wcbF-R | GTCCTTGGACGTTGGACAGG | |||
| wcbD-F | TCAGTGCAGAGGCAAGAAGC | Ген биосинтеза капсульного белка B. thailandensis 2003015869 (Genbank ac. CP013360.1 локус WI24_03665) | 349 | 59,0 °C |
| wcbD-R | GGTGCGGAAGCCAAGGTAAA |
Поиск генетических мишеней проводили путем сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей ортологичных wcb оперонов штаммов B. thailandensis сиквенс типа ST101: двух независимых сиквенсов первой хромосомы клинического штамма 2003015869 (CP013360.1:821456-786960 и CP008914.2: 246676-281172) с известным присутствием кластера Bp-like CPS, а также трех вероятных BTCV штаммов 2002721121 (NZ_CP013409.1:792505-825098), FDAARGOS_238 (CP020392.1: 2006990-2039583) и H0587 (CP004089.1: 1106864-1139457). Кроме того были использованы шотган полногеномные сиквенсы (WGS) двух штаммов ST696: B. thailandensis E555 (NZ_AECN00000000, локализация кластера AECN01000020.1:1055-35529) и 2.1 (PHRD00000000, локализация кластера PHRD01000004.1:1154-35624), а также WGS штамма 2002721621 сиквенс типа ST73 (NZ_LNNG00000000, локализация кластера LNNG01000001.1:1868142-1900747). В качестве референсных использовали последовательности wcb оперонов B. pseudomallei K96243 (ST10) (NC_006350.1:3327179-3361667) и B. thailandensis E264 (ST80) (NC_007651.1:1485538-1518832). Все последовательности — из базы данных GenBank NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Анализ проводили с использованием инструмента Nucleotide BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) с визуализацией результатов при помощи веб-инструмента Kablammo [19] (https://kablammo.wasmuthlab.org/).
Биоинформационные ресурсы и инструменты. Для подбора праймеров и оценки их специфичности использовали Primer-BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Множественное выравнивание нуклеотидных и аминокислотных последовательностей осуществляли при помощи программного пакета MEGA X [20]. Анализ филогенетических связей между ортологами поликетидсинтазы типа I B. thailandensis проводили с использованием веб-сервиса NGPhylogeny.fr [21] (https://ngphylogeny.fr) методами MrBayes, PhyML+SMS (с параметрами по умолчанию) и FastME при параметрах: эволюционная модель LG, попарная оценка равновесных частот, параметр гамма-распределения — 1,0, попарное удаление пробелов. Для построения начального дерева выбирали алгоритмы Neighbor Joining (NJ) или BIONJ, для уточнения топологии — метод ближайших соседних развязок (NNI) или обрезку поддеревьев и реструктуризацию (SPR). Визуализацию дендрограммы проводили с помощью сервиса iTOL (https://itol.embl.de/tree/). Статистическая достоверность узлов оценивалась бутстрап-анализом 1000 случайных выборок. Доверительный интервал для оценки среднего значения бутстреп-индекса рассчитывали в MS EXCEL (2016). 3D-модели доменов PksER конструировали с использованием в качестве матрицы 2-enoyl thioester reductase Etr1p/Etr2p (SMTL ID 1n9g.1) с помощью сервиса SWISS-MODEL [22] (https://swissmodel.expasy.org/).
Секвенирование и сборка генома. Секвенирование проводили на платформах IonTorrent (Thermo Fisher Scientific, США), Illumina MiSeq (Illumina Inc., США) и Oxford Nanopore MinION (Oxford Nanopore Technologies, Великобритания), используя рекомендованные производителями наборы реагентов. Геномы собирали de novo с помощью программ SPAdes v. 3.1.0 [23] и MaSuRCA v. 3.3.2 [24]. Аннотацию осуществляли при помощи сервиса NCBI PGAP v. 4.10 [25].
Полученные в настоящей работе полногеномные шотган сиквенсы штаммов B. thailandensis 2.1, 012, 382f, а также B. pseudomallei 4811 и V1607 депонированы в GenBank NCBI (Accession Numbers PHRD00000000.1, WOXA00000000.1, WOWZ00000000.1, QLUX00000000.1 и WTLF00000000.1, соответственно).
Мультилокусное сиквенс-типирование (MLST). Определение сиквенс-типов (ST) штаммов B. thailandensis проводили по схеме Godoy [26]. Аллели исследуемых локусов определяли автоматически путем анализа полученных WGS с использованием инструментария базы данных Burkholderia pseudomallei pubMLST (https://pubmlst.org/bpseudomallei/).
Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Подготовку инактивированных формалином клеток B. pseudomallei для СЭМ проводили методом обезвоживания этанолом с последующей сушкой в критической точке, без напыления токопроводящим слоем. Образцы просматривали на сканирующем электронном микроскопе с катодом с полевой эмиссией MIRA 3 LMH (Tescan, Brno, Czech Republic).
Выбор генетических мишеней и создание праймеров. Проведенное сравнение нуклеотидных последовательностей кластера генов биосинтеза CPS, Bp-like CPS и EPS 10 штаммов B. pseudomallei и B. thailandensis, опубликованных в базе данных GenBank NCBI, позволило уточнить негомологичные области оперонов у штаммов B. thailandensis, принадлежащих к разным филогенетическим кладам, а также показало высокое сходство исследуемых оперонов (99,99%) у вариантных штаммов вне зависимости от их сиквенс-типа. Необходимо отметить, что ST101 и ST696 отличаются по единственному из 7 локусов, включенных в схему MLST. Кроме того, при проведении сравнительного анализа было обнаружено, что принадлежность к ST101 не всегда означает наличие Bp-like CPS. Интересно, что последовательности оперонов клинических штаммов B. thailandensis FDAARGOS_238, H0587 и 2002721121, источник выделения которого не указан, по набору генов соответствуют EPS-кластеру B. thailandensis E264, но уровень гомологии 5 локусов, расположенных в 3’-области оперона, с паралогами E264 несколько ниже, чем у других EPS-штаммов — идентичность 99,3 и 99,96—100% соответственно. При этом процент идентичности с аналогичной областью BTCV штамма 2003015869 оказался незначительно выше, чем у EPS штаммов (77,16 и 76,93%) (рис. 1, а, см. https://mediasphera</strong>.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_01_040_add.zip).
На основании полученных данных в качестве генетических мишеней для выявления кластера генов Bp-like CPS были выбраны ортологи генов wcbO, wcbJ, wcbI, wcbH, wcbF и wcbD B. pseudomallei у вариантного штамма ST101 B. thailandensis 2003015869 (см. рис. 1, а, см. https://mediasphera</strong>.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_01_40_add.zip). Из 18 пар праймеров, предложенных программой Primer-BLAST, после in silico оценки было отобрано 6 пар, детектирующих в виртуальной ПЦР искомые мишени в геномах BTCV штаммов B. thailandensis и B. pseudomallei, при отсутствии гомологии со штаммами B. thailandensis основной популяции. Полученные in silico результаты были проверены в ПЦР с ДНК B. pseudomallei ВКМ900, B. thailandensis 2.1 и E264. Во всех шести реакциях получены продукты ожидаемого размера у B. pseudomallei ВКМ900 и B. thailandensis 2.1, при их отсутствии у типового штамма B. thailandensis E264 (см. рис. 1, б, см. https://mediasphera</strong>.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_01_040_add.zip).
Детекция и анализ полиморфизма wcb оперонов. Для выявления BTCV штаммов среди почвенных изолятов B. thailandensis была проведена серия ПЦР с использованием сконструированных праймеров. У 11 штаммов B. thailandensis (12,6%) были обнаружены все 6 ожидаемых ампликонов. У 60 (69%) штаммов наблюдалась вариабельность количества и комбинаций полученных ампликонов, и у 16 (18,4%) штаммов специфические ампликоны отсутствовали (см. рис. 1, в, см. https://mediasphera</strong>.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_01_041_add.zip).
Для подтверждения присутствия в геномах полных кластеров генов биосинтеза EPS или CPS и определения сиквенс-типов для отдельных штаммов из групп отрицательных (1-я группа) и положительных (2-я группа) в ПЦР для всех генов-мишеней провели определение полногеномных последовательностей.
У трех штаммов первой группы идентифицировано три сиквенс-типа — ST77 (B. thailandensis 012), ST80 (382f) и ST76 (H37). Оба исследованных штамма 2-й группы (B. thailandensis 2.1 и H16) имели общий сиквенс-тип — ST696.
В геномах штаммов из 2-й группы были выявлены полноценные опероны биосинтеза Bp-like CPS: координаты кластера у штамма H16 NODE_1_length_609537_cov_94.814670:1151-35647, у штамма 2.1 — PHRD01000004.1:1154-35624. Взаимное сравнение нуклеотидных последовательностей выявленных кластеров Bp-like CPS показало их практически полную идентичность (99,99%), за исключением наличия у штамма 2.1 четырех однонуклеотидных делеций. Три из них локализованы в межгенном пространстве, а четвертая — в локусе, кодирующем белок биосинтеза капсулы (ортолог WcbJ), что привело к сдвигу рамки считывания. Кроме того, по сравнению с B. thailandensis 2003015869, у исследованных штаммов в составе оперона обнаружено по одной синонимичной (молчащей) замене в генах ATP-связывающего белка ABC транспортера (PJO73058.1) и ортолога WcbQ — синтазы семейства LTA (PJO73047.1), а также несинонимичные замены, повлекшие изменения в белках WcbS (PJO73045.1):L121P и ManC (PJO73064.1):A100T.
У штаммов B. thailandensis первой группы в геномах были обнаружены кластеры генов EPS (идентичность с B. thailandensis E264 — 99,96%), расположенные у штаммов 012, 382f и H37 в скаффолдах WOXA01000001.1:2746931-2779524, WOWZ01000001.1:647632-680225 и NODE_1_length_486919_cov_88.766075:264364-296957 соответственно. По сравнению с референтным штаммом E264 в опероне штамма 012 обнаружено 18 SNV (single nucleotide variant), у 382f — 11 SNV и у H37 — 16 SNV, причем наиболее вариабельным оказался ген поликетидсинтазы типа I (ортолог wcbR).
Таким образом, показано, что тестирование выбранных 6 генов достаточно для определения наличия или отсутствия в геноме B. thailandensis оперона биосинтеза Bp-like CPS.
Морфологическая характеристика вьетнамских штаммов B. thailandensis. На агаре Эшдауна исследованные BTCV штаммы B. thailandensis росли преимущественно в виде морщинистых колоний (рис. 2, d, e, см. https://mediasphera</strong>.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_01_041_add.zip) подобных колониям возбудителя мелиоидоза (см. рис. 2, g, h, см. https://mediasphera</strong>.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_01_041_add.zip), что является одним из фенотипических проявлений наличия в геноме кластера генов Bp-like CPS. Типичные штаммы B. thailandensis, как правило, образуют единообразные колонии S-формы (см. рис. 2, f, см. https://mediasphera</strong>.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_01_041_add.zip). Исследованные штаммы, продуцирующие EPS, по морфологии роста отличались как между собой, так и от типового штамма E264. У каждого штамма присутствовало, по меньшей мере, два морфотипа колоний (см. рис. 2, a, b, c, см. https://mediasphera</strong>.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_01_041_add.zip). У штаммов 382f и H37 присутствовал тип колоний (см. рис. 2, a, c, см. https://mediasphera</strong>.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_01_041_add.zip), схожий с описанным нами ранее [27] уникальным для вьетнамских штаммов B. pseudomallei морфотипом «B» («пуговицы», buttons), колонии с интенсивным металлическим блеском, валиком по окружности и центром в виде одного или нескольких бугорков, или плоским (см. рис. 2, i, см. https://mediasphera</strong>.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_01_041_add.zip).
Анализ ультрамикроморфологии клеток трех штаммов B. pseudomallei, включая штамм 4811 (рис. 3, а, см. https://mediasphera</strong>.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_01_041_add.zip), колонии которых росли в виде вариаций морфотипа «B», показал явные отличия в структуре клеточной поверхности по сравнению с клетками других морфологических вариантов колоний возбудителя мелиоидоза (рис. 3, см. https://mediasphera</strong>.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_01_041_add.zip).
Сравнительный анализ единичных аминокислотных замен в последовательностях белков, общих для EPS и CPS кластеров. Всего в поликетидсинтазе типа I (2 543 а.к.) EPS штаммов B. thailandensis основной клады выявлено 9 позиций с аминокислотными заменами, в числе которых — три уникальных для исследованных вьетнамских штаммов (R666H и A2535G — у штамма 382f, S1073А — у штамма 012). Обнаруженные единичные аминокислотные варианты и их локализация в белке приведены на рис. 4 (см. https://mediasphera</strong>.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_01_041_add.zip).
У штамма H37 выявлены замены A27V и F138C в последовательности белка семейства LTA синтаз из группы идентичных протеинов (ГИП) WP_009889313.1, а у штамма 012 — R391W в метилтрансферазе семейства FkbM (MUV22179.1).
В связи со сходством морфологии колоний штаммов B. thailandensis H37 и 382f с морфотипом «B» возбудителя мелиоидоза был проведен анализ последовательностей общих для CPS и EPS белков B. pseudomallei 4811 и V1607, колонии которых имели идентичную морфологию (см. рис. 2, i). В сравнении с гомологами референтного штамма B. pseudomallei K96243 у обоих штаммов в поликетидсинтазе типа I (WcbR) (RAP94645.1 и MWJ55265.1) было обнаружено по 2 идентичных замены (H1052D, L1950Q). Аминокислотная последовательность LTA синтазы (WcbQ) у обоих штаммов (RAP94752.1 и MWJ55266.1) была полностью идентична гомологу K96243.
В составе поликетидсинтазы типа I присутствует 5 консервативных доменов: ацилтрансферазный (PksD), метилтрансферазный (AdoMet MTases), димер дегидратазы (SDR), еноилредуктаза (Pks ER) и сайт связывания фосфопантетеина (PP-binding). Явного домена тиоэстеразы, которая катализирует прекращение синтеза гликановой цепи, нет, однако эта функция может быть обеспечена белком семейства LTA синтаз (WcbQ), обладающего тиоэстеразной активностью.
Сравнение локализации аминокислотных замен в поликетидсинтазах морфологически сходных штаммов B. thailandensis (MUV22166.1, MUV26054.1) и B. pseudomallei (RAP94645.1 и MWJ55265.1) показало присутствие аминокислотных замен в домене эноилредуктазы (PksER) у штаммов обоих видов. Штаммы 382f и H37 B. thailandensis имели 2 идентичные замены: T1942A в домене PksER и L1629S между доменами AdoMet MTases и SDR. В LTA синтазе (WcbQ) B. thailandensis H37 замены A27V и F138C находились вне консервативных доменов. Последовательности LTA синтазы B. thailandensis 382f (MUV26055.1) и B. pseudomallei 4811 (RAP94752.1) были идентичны ортологам у типовых штаммов B. thailandensis E264 и B. pseudomallei K96246 соответственно.
Филогенетический анализ поликетидсинтазы типа I EPS штаммов B. thailandensis. Для проведения анализа в перечень сравниваемых ГИП помимо поликетидсинтазы типа I (2543 а.к.) классических EPS штаммов B. thailandensis были добавлены две группы, включающие WcbR EPS штаммов из отдельной филогенетической клады, — WP_025404770.1 и WP_045600193.1 (табл. 2). Оценка уровня гомологии ортологов WcbR EPS штаммов B. thailandensis из обеих клад показала их консервативность (идентичность в пределах 99,02—100%), при наличии 19 вариабельных локусов, что нашло свое отражение в их кластеризации на филогенетическом дереве (рис. 5, см. https://mediasphera</strong>.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_01_042_add.zip).
Филогенетический анализ полных аминокислотных последовательностей WcbR EPS штаммов B. thailandensis с использованием различных алгоритмов и внешних групп — близкой (общая для B. thailandensis и B. humptydooensis WP_015600982.1) и более отдаленных (WP_009904089.1 BTCV B. thailandensis и WP_004550042.1 B. pseudomallei) — во всех случаях показал наличие двух стабильных клад, обозначенных I и II. Кладу I составили ГИП штаммов основной популяции B. thailandensis (см. рис. 5, см. https://mediasphera</strong>.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_01_042_add.zip). Среднее значение бутстреп-индекса клады I равно 92,9% (95% ДИ 88,5—97,8). Для внутренних узлов в пределах клады I при всех вариантах анализа значения бутстреп-индекса не превышали 63,5%. В кладу II вошли ГИП штаммов B. thailandensis ST73 и ST101, экспрессирующих EPS. Среднее значение бутстреп-индекса клады II равно 98,9% (95% ДИ 97,8—99,8).
Таблица 2. Перечень групп идентичных протеинов WcbR
| Группа идентичных протеинов WcbR | Размер | Штамм | ST | Место выделения /тип штамма | Клада |
| WP_165981610.1 | 2543 а.к. | B. thailandensis BPM | 76 | Китай/клинический | I |
| B. thailandensis H37 | 76 | Вьетнам/природный | |||
| WP_059844290.1 | 2543 а.к. | B. thailandensis E1 | 669 | Папуа-Новая Гвинея/нет данных | |
| WP_043296074.1 | 2543 а.к. | B. thailandensis E254 | 345 | Таиланд/нет данных | |
| B. thailandensis FDА.К.RGOS_244 | 345 | Таиланд/природный | |||
| WP_161654383.1 | 2543 а.к. | B. thailandensis E426 | 77 | Таиланд/природный | |
| WP_156628074.1 | 2543 а.к. | B. thailandensis 382F | 80 | Вьетнам/природный | |
| WP_043036326.1 | 2543 а.к. | B. thailandensis Phuket 4W-1 | 80 | Таиланд/природный | |
| WP_043295064.1 | 2543 а.к. | B. thailandensis MSMB59 | 699 | Австралия/природный | |
| B. thailandensis MSMB60 | 699 | Австралия/природный | |||
| WP_156530076.1 | 2543 а.к. | B. thailandensis 012 | 77 | Вьетнам/природный | |
| WP_011402028.1 | 2543 а.к. | B. thailandensis E264 | 80 | Таиланд/природный | |
| B. thailandensis 2002721723 | 80 | Нет данных/клинический | |||
| B. thailandensis 2002721643 | 80 | Нет данных/нет данных | |||
| B. thailandensis FDА.К.RGOS_240 | 80 | Нет данных/клинический | |||
| B. thailandensis FDAARGOS_236 | 80 | Нет данных/природный | |||
| B. thailandensis FDAARGOS_425 | 80 | Нет данных/нет данных | |||
| WP_161653985.1 | 2543 а.к. | B. thailandensis E421 | 77 | Таиланд/природный | |
| WP_025369787.1 | 2543 а.к. | B. thailandensisE444 | 79 | Таиланд/природный | |
| WP_038712449.1 | 2543 а.к. | B. thailandensis Malaysia_#20 | 80 | Малайзия/нет данных | |
| WP_045600193.1 | 2547 а.к. | B. thailandensis 2002721643 | 73 | Австралия/природный | II |
| B. thailandensis 34 | 73 | Нет данных/нет данных | |||
| B. thailandensis 2002721621 | 73 | Франция/нет данных | |||
| B. thailandensis FDAARGOS_243 | 73 | Нет данных/природный | |||
| WP_025404770.1 | 2543 а.к. | B. thailandensis H0587 | 101 | США/нет данных | |
| B. thailandensis 2002721121 | 101 | США/нет данных | |||
| B. thailandensis FDAARGOS_238 | 101 | Нет данных/клинический | |||
| WP_009904089.1 | 2544 а.к. | B. thailandensis TXDOH | 101 | США/клинический | III* |
| B. thailandensis E555 | 696 | Камбоджа/природный | |||
| B. thailandensis 2.1 | 696 | Вьетнам/природный | |||
| WP_015600982.1 | 2561 а.к. | B. thailandensis (humptydooensis) MSMB121 | 1023 | Австралия/природный | * |
| B. humptydooensis MSMB122 | 1023 | Австралия/природный | |||
| B. thailandensis FDAARGOS_426 | 1023 | нет данных/природный | |||
| WP_004550042.1 | 2546 а.к. | B. pseudomallei K96243 | 10 | Таиланд/клинический | * |
Примечание. * — внешние группы для филогенетического анализа аминокислотных последовательностей ортологов поликетидсинтазы типа I EPS штаммов B. thailandensis.
Впервые о существовании вариантных штаммов B. thailandensis было сообщено в работе B.M. Sim и соавт. в 2010 г. [10], обнаруживших среди штаммов, выделенных в Таиланде, Камбодже и США, 5 штаммов сиквенс-типов ST73, ST101 и ST696, формировавших отдельную филогенетическую кладу. Два изолята из этой группы — E555 и 2003015869 (также известный как Bp0073, CDC3015869 и TXDOH) — экспрессировали Bp-like CPS. ST вариантных штаммов B. thailandensis имеют приуроченность к макрорегиону происхождения изолятов: все известные BTCV штаммы из стран Юго-Восточной Азии относятся к ST696, американские — к ST101, при этом эти два сиквенс-типа представляют собой однолокусные варианты (SLV — single locus variants) друг друга. В последние годы эта генетическая клада была пополнена рядом африканских штаммов, ST которых являются одно-, двух- и трехлокусными вариантами ST73. Пока неясно, присутствует ли у африканских штаммов кластер Bp-like CPS, но они показали положительный результат в реакции латекс-агглютинации с моноклональными антителами (МКА) к капсульным антигенам B. pseudomallei и характерную для возбудителя мелиоидоза морфологию колоний [17].
В группе исследованных штаммов, показавших в ПЦР вариабельность количества и комбинаций полученных ампликонов, мы также наблюдали варианты pseudomallei-подобной морфологии роста на агаре Эшдауна и, в отдельных случаях, положительные результаты в реакции латекс-агглютинации с мелиоидозными МКА (данные не показаны). Вопрос о принадлежности этих штаммов к числу вариантных пока остается открытым и требует дополнительных исследований генного состава и структуры оперона биосинтеза экзополисахарида. У пяти подробно охарактеризованных в настоящей работе штаммов выявлено 4 ST — оба вариантных штамма ожидаемо имели ST696, а у 3 штаммов основной филогенетической клады идентифицировано 3 различных сиквенс-типа (ST76, 77 и 80), что свидетельствует о высоком уровне внутривидового полиморфизма консервативных генов среди штаммов вьетнамской популяции B. thailandensis. Неудивительно, что такая генетическая вариабельность сопровождается разнообразием фенотипических признаков.
Известно, что на морфологию колоний грамотрицательных бактерий могут оказывать влияние изменения в экспресии генов биосинтеза экзополисахарида [28]. Для B. thailandensis было показано, что мутанты, дефектные по структурным или регуляторным генам EPS, в отличие от родительских штаммов, имеющих и гладкие, и шероховатые колонии, образуют колонии исключительно S-формы [10, 29]. Также установлено, что у B. pseudomallei не все гены являются критично необходимыми для синтеза гликана. При направленной инактивации каждого из генов manC, wcbA, wcbJ, wcbN, wcbP, wcbQ и wcbR продукция капсульного полисахарида сохранялась, но при пониженном уровне по сравнению со штаммом дикого типа. При этом у разных мутантов наблюдали вариации представленности эпитопов CPS на поверхности клеток [30].
Все выявленные аминокислотные замены у исследованных в настоящей работе штаммов локализованы в генах из этой группы, причем наиболее вариабельным оказался белок поликетидсинтаза типа I.
Из проанализированных ГИП поликетидсинтазы типа I B. thailandensis только 4 (WP_011402028.1, WP_043295064.1, WP_059844290.1 и WP_156530076.1) содержат в положении 1942 (домен PksER) треонин, и в их число входят WcbR штаммов B. thailandensis E264 и 012, образующих преимущественно гладкие колонии. У всех BTCV штаммов B. thailandensis, как и у большинства EPS штаммов, в этой позиции находится аланин. Интересно отметить, что штамм B. thailandensis BPM, вызвавший фатальный сепсис у больного в Китае [5], и исследованный штамм H37, имеют общий сиквенс-тип ST76 и сходную морфологию колоний. При этом аминокислотные последовательности WcbR у обоих штаммов оказались полностью идентичными. То есть присутствие в позициях 1629 и 1942 поликетидсинтазы типа I остатков серина и аланина соответственно, ассоциировано с формированием у EPS штаммов B. thailandensis колоний pseudomallei-подобного морфотипа «пуговицы».
На модели ER, построенной на основе фермента E. coli QOR семейства MDR, к которому относится домен PksER, было показано, что эноилредукция носит стереоспецифический характер. И в зависимости от присутствия в активном сайте ER остатков тирозина, валина или аланина происходит переключение конфигурации метильной ветви и образование стереоизомеров продукта синтеза [31]. Возможно, что у штаммов B. thailandensis и B. pseudomallei формирование колоний морфотипа «B» обусловлено именно образованием стереоизомерной формы капсульного полисахарида. Наличие вариабельных позиций в консервативной последовательности поликетидсинтазы типа I является еще одним аргументом в пользу предположения о влиянии аминокислотных замен в этом мультидоменном белке на морфологическое разнообразие колоний B. thailandensis.
Проведенный филогенетический анализ поликетидсинтазы типа I EPS штаммов B. thailandensis с использованием различных алгоритмов и внешних групп во всех случаях показал единый план общей топологии дендрогамм, состоящих из двух стабильных клад (I и II). ГИП WcbR BTCV штаммов составила отдельную кладу (III). Проведенные ранее филогенетические исследования B. thailandensis, основанные на анализе полногеномных последовательностей, показали, что штаммы сиквенс-типа ST101 распределены по двум ветвям филогенетического дерева [10, 32], и полученные в настоящей работе данные подтверждают гетерогенность штаммов этого сиквенс-типа.
Проведенные исследования позволили впервые установить присутствие во вьетнамской популяции B. thailandensis вариантных штаммов, относящихся к отдельной филогенетической кладе и экспрессирующих Bp-like CPS. Поскольку штаммы целенаправленно отбирали по pseudomallei-подобной морфологии колоний и исследованная выборка не является репрезентативной, полученные данные не позволяют судить о количественном соотношении вариантных и классических штаммов B. thailandensis в биоценозах Вьетнама, и этот вопрос нуждается в проведении отдельной работы.
Среди штаммов B. thailandensis основной популяции обнаружен высокий уровень внутривидового полиморфизма консервативных генов, включенных в схему MLST. Кроме того, в последовательности ортологов поликетидсинтазы типа I штаммов основной филогенетической клады обнаружено 6 позиций аминокислотных замен, общих для изолятов различного географического происхождения, а также три уникальные для исследованных вьетнамских штаммов мутации. Выявлено влияние аминокислотных замен L1629S и T1942A в последовательности поликетидсинтазы типа I на формирование у EPS штаммов B. thailandensis колоний pseudomallei-подобного морфотипа.
Выявленная высокая степень генетической и фенотипической гетерогенности внутри вьетнамской популяции B. thailandensis, с одной стороны, отражает многообразие экологических условий Вьетнама, определяемых положением страны на стыке нескольких природных зон, с другой, — свидетельствует, что субрегион Меконга был и остается горячей точкой в Юго-Восточной Азии для эволюции не только B. pseudomallei, но и близкородственной B. thailandensis.
Благодарности
Авторы выражают благодарность дистрибьютору компании TESCAN в России ООО «ТЕСКАН» за предоставленную возможность проведения исследования. Также мы искренне благодарим специалистов компании М. Лукашову (M. Lukashova) и А. Дергачева (A. Dergachev) за оказанную техническую поддержку.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Литература / References:
Подтверждение e-mail
На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.
Подтверждение e-mail
Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.
