Производство биологически активных веществ (БАВ) — аминокислот, ферментов, витаминов, органических кислот — является приоритетной задачей микробиологической промышленности Российской Федерации (РФ). Современная методология генной инженерии позволяет за короткий срок конструировать микроорганизмы с измененными уровнями экспрессии генов и высоким выходом целевых продуктов. Во всех странах генетически-модифицированные микроорганизмы (ГММ) являются предметом государственного регулирования. Совершенствование методов оценки безопасности продукции, создаваемой с использованием ГММ, является важнейшей задачей РФ [1]. В Федеральной научно-технической программе развития генетических технологий РФ на 2019—2027 гг. подчеркивается необходимость надлежащего нормативно-правового регулирования для обеспечения эффективного и безопасного использования геномного редактирования [2]. При создании ГММ продуцентов БАВ необходимо исследовать поведение новых штаммов в условиях внешней среды, что даст представление о необходимых мерах защиты при использовании ГММ в промышленном производстве.
Цель исследования — нормативно-правовая оценка соответствия характеристик ГММ E. coli K-12 ВКПМ B-13285, продуцента ЯК, требованиям российского и международного законодательств, применяемых для промышленных ГММ продуцентов БАВ. Анализ поведения исходного и ГММ штаммов под влиянием факторов внешней среды (температура, УФ-излучение), оценка выживаемости штаммов в воде, почве, сточных водах. Идентификация ГММ штамма среди других представителей энтеробактерий методом ПЦР-анализа с использованием пар локус-специфических праймеров для проведения экологического мониторинга при промышленном производстве ЯК.
Материал и методы
Бактериальные штаммы и среды. Штаммы, использованные в работе, получены из Национального биоресурсного центра Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» — ГосНИИгенетика (табл. 1). ГММ штамм E. coli K-12 ВКПМ B-13285, обозначенный как SGM2.0Pyc-int, создан с помощью прецизионного геномного редактирования, основанного на методологии хромосомальной рекомбинационной инженерии [3]. Бактерии культивировали на полноценных питательных средах Luria-Bertani на Lysogeny Broth в жидкой (LB) и агаризованной (LBA) формах. Для выявления грамотрицательных энтеробактерий, бактерий из почвы и сточных вод использовали селективную диагностическую готовую среду MacConkey (BioMedia, Россия).
Таблица 1. Штаммы Escherichia coli, использованные в работе, и их генотипы
| Штамм | Генотип | Источник |
| B-6195 (E. coli K-12 MG1655) исходный родительский штамм | F-lambda- ilvG- rfb-50 rph-1 | ВКПМ/VKPM |
| NEB Turbo | F’ proA+B+ lacIq ∆lacZM15 / fhuA2 ∆(lac-proAB) glnV galK16 galE15 R(zgb-210::Tn10)TetS endA1 thi-1 ∆(hsdS-mcrB)5 | New England Biolabs |
| XL1-Blue | recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F’ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)] | Stratagene |
| B-5078 | pro thi, res-hsdR17 (rK- mK+) recA- (RP4-2-Tc::Mu Km::Tn7) Tpr Smr | ВКПМ |
| BLR(DE3) | F-ompT hsdSB(rB- mB-) gal lac ile dcm Δ(srl-recA) ::Tn10(tetR)(DE3) | Novogen |
| B-7188 | Продуцент аспартазы | ВКПМ |
| B-13285 (E. coli K-12 SGM2.0Pyc-int) | ∆ackA-pta, poxB::λattB-PL-pycABs, ∆ldhA, ∆adhE, PL-aceEF-lpdA. ГММ продуцент янтарной кислоты, полученный в НИЦ «Курчатовский институт» — ГосНИИгенетика, исследован в настоящей работе | ВКПМ |
Оценку ростовых характеристик штаммов проводили при температурах 25, 37 и 42 °C по стандартной методике анализа кривых роста бактериальных культур. Оптическую плотность (ОП) культур определяли с интервалом 2 ч при длине волны 590 нм с использованием фотоэлектрического колориметра («ЗОМЗ», Россия). Накопление биомассы штаммами оценивали по сырому весу на 24 ч роста в LB-среде [3]. Выживаемость клеток оценивали, определяя число колоний образующих единиц (КОЕ) на среде LBA на начальном и заключительном этапах эксперимента.
Облучение ультрафиолетовым светом штаммов ГММ и E. coli K-12 MG1655 проводили с использованием бактерицидной, газоразрядной лампы TUV 30W (Philips, Нидерланды) с излучением коротковолновых УФ-лучей и максимальной длиной волны 253,7 нм. Облучение НК проводили в стерильных чашках Петри (диаметр 90 мм, 15 мл НК), на расстоянии 50 см от УФ-лампы в течение 4 ч, с отбором проб 1 раз в час для определения КОЕ. Титр клеток штаммов, введенных в эксперимент, составлял 1×109 кл/мл.
Методики оценки выживаемости ГММ и E. coli K-12 MG1655
В водной среде проводили при инкубации клеток в колбах, содержащих 100 мл стерильной водопроводной воды (ВВ) или физиологического раствора (ФР), на роторной качалке при 220 об/мин. Длительность эксперимента — 4 мес. Ночные культуры (НК) штаммов (1 мл, титр 1×108 кл/мл) вносили в колбы, инкубировали при 37 °C, 14 сут. Анализ проб с определением КОЕ проводили 1 раз в 3 сут. Далее в течение 3,5 мес температуру инкубации снижали до +10 °C для уменьшения испарения воды, отбор и анализ проб проводили 1 раз в месяц.
В сточных водах. Сточная вода была взята из коллектора коммунальной канализации Москвы. Общую бактериальную обсемененность (ОБО) определяли высевом 0,1 мл воды на среды LBA и MacConkey. По 1 мл НК штаммов ГММ и E. coli K-12 MG1655 вносили в 100 мл сточной воды и культивировали при 28 °C. Высевы из колб проводили 1 раз в 3 сут в течение 15 сут на среды LBA и MacConkey, определяя КОЕ.
Наличие ГММ в сточных водах анализировали методом ПЦР с помощью пар локус-специфических праймеров. Общую геномную ДНК из образцов сточных вод выделяли с помощью набора DNeasyPowerMax Soil Kit (Qiagen, Германия), согласно рекомендациям изготовителя. Количество геномной ДНК, использованной в реакции — по 50 нг/20мкл реакционной смеси; праймеры в количестве 50 мкг/100 мкл реакционной смеси.
В почве. Для эксперимента использовали почву из парковой зоны московского района Южное Бутово. Характеристика почвы на основании данных экологического атласа Москвы определена как урбанозем (pH=5,5) [4]. Забор проб почвы осуществляли в соответствии с ГОСТ 17.4.4.02-2007—84 [5].
Определение ОБО почвы. Образцы почвы массой 1 г заливали 10 мл стерильной воды и перемешивали на Vortex, отбирали 1 мл суспензии и центрифугировали (5 мин, 5000 об/мин). Надосадочную жидкость высевали по 0,1 мл на среды LBA и MacConkey, инкубировали при 28 и 37 °C, 48 ч, определяли КОЕ.
Инокуляция образцов почвы бактериями E. coli K-12 MG1655 и ГММ. НК штаммов (титр ~108 кл/мл) разводили стерильной водой в 100 раз. Образцы почвы массой 10 г помещали в фальконы, две повторности для каждого штамма. В каждый из образцов почвы добавляли по 1 мл суспензии штаммов из разведения, тщательно перемешивали и оставляли при комнатной температуре в закрытых (не герметично) пластиковых флаконах. Концентрация клеток в образцах составляла ~105 кл на 1 г почвы. Отбор проб из образцов почвы проводили трижды, с интервалом 5 сут, высевали только на среду MacConkey по схеме, аналогичной определению бактериальной обсемененности почвы.
Идентификация ГММ штамма с использованием пар локус-специфических праймеров методом ПЦР-анализа. В табл. 2 представлены нуклеотидные последовательности праймеров, синтезированных в ЦКП НИЦ «Курчатовский институт» — ГосНИИгенетика. Геномную ДНК штамма ГММ выделяли с помощью наборов GeneJet Genomic DNA Purification Kit (Thermo, Литва), ПЦР идентификацию проводили с использованием Phusion Hot start II полимеразы (Thermo, Литва), согласно протоколу изготовителей. Количество хромосомной ДНК, использованной в реакции, составляло 10 нг/30 мкл реакционной смеси; праймеры использовали в количестве 50 мкг/100 мкл реакционной смеси. Режим ПЦР: (1) 95 °C — 3 мин; (2) 95 °C — 10 с; (3) 56 °C — 20 с; (4) 72 °C — 30 с; стадии 2—4 — 30 циклов; (5) 72 °C — 5 мин.
Таблица 2. Праймеры, использованные в работе, и их нуклеотидные последовательности
| Праймер | Последовательность 5’—3’ |
| VG1 | gggagatctgctccttgaaattg |
| VG2 | ggccatcatcgcttcgag |
| VG3 | gtcagatgaactaaacttgttaccg |
| VG4 | caagtatgcttcatccgctt |
В качестве отрицательных контролей использовали различные штаммы, не содержащие уникальной последовательности гетерологичного гена pycA B. subtilis, клонированной в ГММ (см. табл. 1).
Результаты и обсуждение
Нормативно-правовая оценка соответствия характеристик ГММ продуцента янтарной кислоты E. coli K-12 SGM2.0Pyc-int требованиям российского и международного законодательств. В РФ правовая политика в сфере генной инженерии базируется на Федеральном законе №86-ФЗ «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности» (1996 г.), действующим с некоторыми дополнениями до настоящего времени [6], постановлении Правительства РФ №839 «О государственной регистрации генно-инженерно-модифицированных организмов, предназначенных для выпуска в окружающую среду, а также продукции, полученной с применением таких организмов или содержащих такие организмы» (2013 г.) [7], периодически обновляемых СанПинах, ГОСТах и Методических указаниях. Важным документом, способствующим регистрации генно-модифицированных организмов (ГМО), является Общероссийский классификатор трансформационных событий, 2015 г. (ОКТС) [8]. ОКТС используется для классификации информации о характеристиках нового ГМО. Международное правовое регулирование при использовании штаммов реципиентов и создании ГММ имеет много общих положений, но есть и принципиальные различия. В США и ЕС существуют списки безопасных микроорганизмов. В США это список GRAS (Generally Recognized as Safe), в ЕС — QPS (Qualified Presumption of Safety). Штаммы, получившие статус GRAS и QPS, а также созданные на их основе продуценты, могут быть использованы в биотехнологии без дополнительных проверок безопасности реципиентов, что способствует быстрому внедрению штаммов в промышленное производство. Различается принцип отбора для включения в списки безопасных микроорганизмов. В США он основан на штамме и его характеристиках, а не на таксономическом виде. Так, штаммы E. coli K-12, широко используемые в лабораториях всего мира, разрешены в США к применению в промышленной биотехнологии как безопасные реципиентные штаммы, хотя другие штаммы этого вида могут проявлять патогенные свойства. В ЕС отбор базируется на виде как таксономической единицы, а не на штамме и его характеристиках. По этой причине E. coli K-12 не входят в этот список. Тем не менее на основе E. coli созданы продуценты и биопроизводства БАВ. В РФ по существующим нормативам ряд штаммов микроорганизмов, получивших за рубежом статус GRAS и QPS, запрещены к использованию, несмотря на длительную историю безопасного применения и отсутствие у них патогенности. В РФ затруднено быстрое продвижение генно-инженерных продуцентов на отраслевой рынок из-за отсутствия списка безопасных для применения в производстве штаммов реципиентов. Решением проблемы является формирование перечня безопасных микроорганизмов и ГММ, созданных на их основе.
Требования к генетическому материалу, вносимому в реципиентные штаммы, совпадают в правилах ВОЗ, США, ЕС и частично прописаны в законодательстве РФ [9]. Основные требования: отсутствие генов, а также их фрагментов, кодирующих токсины или определяющих вирулентность; генов, кодирующих устойчивость к антибиотикам; рамок считывания с неизвестными функциями; элементов транспозиции; генов, влияющих на иммунную систему или определяющих синтез аллергенов, суперпродукцию ферментов, способных негативно влиять на здоровье человека; не увеличивать выживаемость микроорганизма в окружающей среде; иметь минимальные размеры, подтверждаться анализом нуклеотидной последовательности клонируемого фрагмента ДНК.
Согласно принципам создания безопасного ГММ, в НИЦ «Курчатовский институт» — ГосНИИгенетика с использованием современных методов прецизионной хромосомальной рекомбинационной инженерии в сочетании с традиционными методами молекулярной генетики и микробиологии был сконструирован продуцент ЯК на основе штамма E. coli K-12 MG1655. Исходный штамм E. coli K-12 MG1655 в ходе анаэробной утилизации глюкозы синтезировал ЯК в количестве, составляющем ~5% от общего количества секретированных продуктов смешанно-кислотного брожения. На первом этапе был создан штамм E. coli SGM2.0 [pPYC], который содержал в составе плазмиды pPYC гетерологичный ген пируваткарбоксилазы — pycA — из штамма Bacillus subtilis 168, введенный в штамм для повышения эффективности анаэробного синтеза ЯК. Плазмида содержала ген bla, кодирующий бета-лактамазу, определяющую устойчивость штамма к ампициллину. Кроме того, в штамме были делетированны гены ackA, pta, poxB, ldhA и adhE, кодирующие ферменты, ответственные за протекание основных реакций смешанно-кислотного брожения, что способствовало эффективной продукции ЯК [10]. Вторым этапом было создание бесплазмидного и не содержащего генов устойчивости к антибиотикам продуцента ЯК. Ген pycA B. subtilis был интегрирован в хромосому штамма на место делетированного гена poxB под контролем сильного конститутивного промотора PL фага лямбда. Генетическая конструкция, использованная для переноса гена pycA, содержала в качестве маркерного ген cat, определяющий устойчивость к антибиотику хлорамфениколу. В дальнейшем ген cat был удален в результате эксцизионной рекомбинации с использованием Int/Xis системы сайт-специфической рекомбинации фага лямбда. Введенные модификации были подтверждены ПЦР-анализом с использованием пар локус-специфических праймеров. Заключительный этап проверки выявил соответствие ожидаемых и внесенных в геном изменений и был проведен при помощи технологии высокопроизводительного секвенирования методами картирования прочтений, геномной сборки, полногеномного и локального выравнивания нуклеотидных последовательностей.
Оценка биосинтетических характеристик полученного ГММ E. coli K-12 SGM2.0Pyc-int продемонстрировала возможность использования различных углеводов в качестве перспективных субстратов для эффективной продукции штаммом ЯК. Коэффициенты конверсии глюкозы и ксилозы в целевой продукт были сравнимы с показателями лучших современных продуцентов ЯК, созданных на основе E. coli, а доля ЯК, анаэробно синтезируемой штаммом, достигала 88% от всех секретированных метаболитов. Таким образом, ГММ штамм E. coli K-12 SGM2.0Pyc-int, удовлетворяет международным и российским требованиям промышленного производства, поскольку не содержит мобильных генетических элементов в составе плазмид, генов устойчивости к антибиотикам, характеризуется высоким уровнем биосинтеза целевого продукта. Штамм E. coli К-12 SGM2.0Pyc-int депонирован в НБЦ ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт» — ГосНИИгенетика как E. coli K-12 ВКПМ B-13285 [3].
Ростовые характеристики ГММ и E. coli K-12 MG1655. При организации промышленного производства БАВ с использованием ГММ необходимо иметь характеристики выживаемости продуцентов при вариациях температуры, как одного из наиболее важных факторов стресса для микроорганизмов в окружающей среде.
Сравнительный анализ физиологических характеристик — кривых роста и накопления биомассы — при температурах 25, 37 и 42 °C выявил различия между исходным штаммом E. coli K-12 MG1655 и полученным ГММ продуцентом ЯК (рис. 1). Установлено, что при данных температурах продолжительность lag-периода у штамма ГММ увеличена по сравнению с исходным штаммом в 2 и более раз. Количество биомассы при 25 °C у обоих штаммов практически одинаково, что подтверждается и одинаковым числом КОЕ — 2×108 кл/мл на 24 ч культивирования. При 37 °C биомасса штамма ГММ примерно на 30% больше, чем у штамма K-12. При 42 °C количество биомассы штамма ГММ вдвое меньше по сравнению с K-12, хотя ОП для обоих штаммов на 24 ч практически одинакова. Однако количество живых клеток у ГММ меньше на 3 порядка по сравнению с K-12 MG1655 и составляет 2×105 кл/мл. Таким образом, ГММ более чувствителен к повышенной температуре, что выражается в снижении жизнеспособности клеток и, как следствие, уменьшении набора биомассы по сравнению с E. coli K-12 MG1655.
Рис. 1. Кривые роста штаммов ГММ и E. coli K-12 MG1655 и накопление биомассы при различных температурах.
Устойчивость ГММ и E. coli K-12 MG1655 к УФ-излучению
Показано, что в течение первого часа УФ-облучения число КОЕ у обоих штаммов уменьшается практически одинаково, затем динамика снижения КОЕ штамма ГММ возрастает и к 4 часу экспозиции число КОЕ у штамма ГММ меньше на 2 порядка по сравнению с K-12 MG1655, что указывает на повышенную чувствительность ГММ к действию УФ-излучения (табл. 3). Таким образом, гибель клеток E. coli K-12 MG1655 и ГММ составляла 6 и 8 порядков соответственно, что свидетельствует о высокой чувствительности ГММ к действию УФ-излучения.
Таблица 3. Жизнеспособность бактерий при действии УФ-излучения
| Время облучения (мин) | Количество жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) | |
| E. coli K-12 | ГММ | |
| 0 | 1×109 | 1×109 |
| 60 | 6×108 | 8×108 |
| 120 | 1×107 | 3×106 |
| 180 | 2×105 | 5×103 |
| 240 | 8×103 | 1×101 |
Выживаемость ГММ и E. coli K-12 в ВВ, ФР, сточных водах. Выживаемость штаммов в стерильных ВВ и ФР практически одинакова, оба штамма схожи между собой по уровню выживаемости, единичные клетки сохраняют жизнеспособность до 4 мес (рис. 2). Принципиально иные результаты были получены при внесении штаммов в образцы сточной воды. Уровень ОБО сточной воды был определен на среде LBA и селективной среде MacConkey, на которой подавляется рост большинства видов грамположительных бактерий. Грамотрицательные бактерии, ферментирующие лактозу, к которым относится большинство представителей семейства Enterobacteriaceae (E. coli), образуют колонии красного цвета. Лактозоотрицательные штаммы образуют прозрачные бесцветные колонии. Число КОЕ облигатной микрофлоры в сточной воде составляет 1×106—1×107 кл/мл, состав ее разнообразен, однако колиформы, имеющие красную окраску колоний, на среде MacConkey присутствуют в единичном количестве. Штаммы ГММ и K-12 MG1655 были инокулированы в образцы сточной воды до конечного титра 1×106 кл/мл. Показано, что через 24 ч КОЕ обоих штаммов в сточной воде снижается на 4 порядка, рост колоний подавляется облигатной микрофлорой, а через 4 сут колонии ГММ и K-12 MG1655 не выявляются. Таким образом, исследуемые штаммы характеризуются крайне низкой выживаемостью в сточной воде и не составляют конкуренцию облигатной микрофлоре.
Рис. 2. Динамика выживаемости штаммов ГММ и E. coli K-12 MG1655 в водопроводной воде и физиологическом растворе, стерильных.
Выживаемость ГММ и E. coli K-12 MG1655 в почве. Определена ОБО почвы на средах LB и MacConkey для выявления грамотрицательных энтеробактерий при температуре 28 и 37 °C. Показано, что в почве присутствует большое разнообразие бактериальных форм, однако энтеробактерии содержатся в незначительном количестве: ~2×101 кл/мл КОЕ на среде MacConkey при рассеве исходного водного экстракта почвы (28 °C). При этом рост энтеробактерий при 37 °C на среде MacConkey отсутствует, что, возможно, свидетельствует о температурном оптимуме 28 °C. Поэтому для селективной идентификации внесенных штаммов дальнейшие высевы из почвы, инокулированной штаммами E. coli K-12 MG1655 и ГММ, проводили на среду MacConkey, при 37 °C. Установлено, что после 5 сут инкубации образцов почвы рост штаммов начинает подавляться облигатной микрофлорой, а число КОЕ снижается и составляет ~102 клеток на 1 г почвы. Через 10 сут инкубации количество колоний K-12 и ГММ снижается до 5—10 клеток на 1 г почвы. Через 15 сут инкубации практически полностью отсутствовал рост ГММ, присутствовали единичные колонии штамма K-12. На чашках развивается облигатная микрофлора почвы, не имеющая отношения к энтеробактериям. Таким образом, сравнительный анализ выживаемости штаммов E. coli K-12 MG1655 и ГММ в почве и в сточных водах показал быстрое подавление роста и гибель клеток в течение 15 сут в отличие от результатов, полученных в стерильных ВВ и ФР. Это указывает на высокий уровень безопасности штамма ГММ при промышленном использовании.
Идентификация штамма E. coli K-12 SGM2.0Pyc-int проведена методом оценки нуклеотидной последовательности ДНК с помощью ПЦР-анализа с использованием пар локус-специфических праймеров в областях, отличающих рекомбинантный штамм от родительского штамма, т.е. в точке интеграции гена pycA из штамма B. subtilis 168. В табл. 2 приведены нуклеотидные последовательности двух синтезированных пар локус-специфических праймеров VG1-VG2 и VG3-VG4. Общий размер локуса гена pycA составляет 4300 п.н., размер фрагмента VG1-VG2 — 280 п.н., размер фрагмента VG3-VG4 — 571 п.н. С помощью этих праймеров были проанализированы ДНК штаммов, не содержащих гетерологичных последовательностей гена pycA, и полученный в настоящей работе ГММ (см. табл. 1). Клонированные последовательности были выявлены только в образцах ДНК ГММ штамма, в остальных штаммах ПЦР-анализ не выявил неспецифичных фрагментов среди продуктов амплификации. Таким образом, синтезированные праймеры и условия амплификации обладают достаточной специфичностью при использовании различных штаммов E. coli и могут быть использованы для идентификации ДНК штамма E. coli K-12 SGM2.0Pyc-int.
Чувствительность метода ПЦР-анализа для выявления клеток ГММ определяли в модельном эксперименте, используя суспензии клеток ГММ в концентрациях 1, 102, 104 и 106 кл/мл. Присутствие ДНК штамма ГММ определено только в образцах с концентрацией клеток 104 и 106 кл/мл при использовании праймеров VG1-VG2 и 106 кл/мл при VG3-VG4 (рис. 3).
Рис. 3. Электрофореграмма результатов ПЦР-идентификации штамма ГММ при различной концентрации клеток в водной суспензии (модельный опыт) с использованием праймеров VG1-VG4.
Концентрации клеток ГММ в образцах суспензий, кл/мл: 1 — 100; 2 — 102; 3 — 104; 4 — 106; VG1-VG2 и VG3-VG4 — пары локус-специфических праймеров; М — маркер молекулярной массы GeneRuler DNA Ladder Mix (Thermo), п.н.
Идентификация ГММ штамма в смешанных образцах, содержащих различные соотношения объемов клеточных суспензий E. coli K-12 MG1655 и ГММ, представлена в табл. 4. Показано, что обе пары локус-специфических праймеров обладают достаточной специфичностью, но различной чувствительностью (рис. 4). ДНК штамма ГММ выявляется при соотношении объемов суспензий K-12 (1 мл):ГММ (0,001 мл) и K-12 (1 мл):ГММ (0,5 мл), при использовании VG1-VG2 и VG3-VG4 соответственно. Таким образом, применение VG1-VG2 повышает чувствительность метода и позволяет надежно выявлять клетки ГММ при концентрации ~1×105 кл/мл, что указывает на возможность применения стратегии ПЦР амплификации с использованием пар локус-специфических праймеров для идентификации ГММ среди большого количества других энтеробактерий.
Таблица 4. Идентификация ГММ при различных объемах клеточных суспензий штаммов ГММ и E. coli K-12. Исходное число КОЕ для обоих штаммов 1×108 кл/мл
| E. coli K-12, мл | ГММ, мл | ПЦР VG1-VG2 | ПЦР VG3-VG4 |
| 1 | 1 | + | + |
| 0,5 | + | + | |
| 0,25 | + | — | |
| 0,1 | + | — | |
| 0,05 | + | — | |
| 0,01 | +/— | — | |
| 0,005 | +/— | — | |
| 0,001 | +/— | — | |
| 0 | — | — |
Рис. 4. Электрофореграмма результатов ПЦР-идентификации штамма ГММ при различных соотношениях объемов суспензий клеток ГММ и штамма E. coli K-12.
1—9 — номера проб (табл. 4); VG1-VG2 и VG3-VG4 — пары локус-специфических праймеров; М — маркер молекулярной массы GeneRuler DNA Ladder Mix (Thermo), п.н.
Метод ПЦР-анализа использован для идентификации ГММ в почве. Как видно из результатов (рис. 5), обе пары локус-специфических праймеров обладают достаточной специфичностью: амплификация в пробе, не содержащей геномную ДНК ГММ штамма и неспецифическая амплификация в пробах, содержащих хромосому ГММ штамма, отсутствует. Уверенно ПЦР-анализом оценивается контаминация почвы ГММ штаммом при содержании 104 клеток в 1 г почвы.
Рис. 5. Электрофореграмма результатов ПЦР-идентификации штамма ГММ в пробах почвы, контаминированных суспензиями клеток в различных концентрациях.
1—4 — номера образцов почвы; концентрации клеток ГММ образцах почвы, кл/мл: 1, 4 — 102; 2 — 104; 3 —105; VG1-VG2 и VG3-VG4 — пары локус-специфических праймеров; M — маркер GeneRuler Mix (Thermo), п.н.
Таким образом, для проведения экологической оценки почвенных или водных систем с предполагаемой массированной контаминацией ГММ штаммами вполне пригоден экспресс-метод ПЦР-анализа. При незначительных объемах контаминации допустимо использовать микробиологические методы с применением диагностических сред для выявления колиформ с последующим применением метода ПЦР-анализа для идентификации ГММ. Стратегически ПЦР-анализ можно применять для идентификации других продуцентов, полученных методами генетического рекомбиниринга и содержащих в своем геноме уникальные последовательности ДНК.
Заключение
Штамм E. coli K-12 SGM2.0Pyc-int продуцент ЯК, полученный с использованием методов прецизионной хромосомальной рекомбинационной инженерии, и содержащий в составе хромосомы гетерологичный ген пируваткарбоксилазы — pycA — из штамма Bacillus subtilis, не несущий плазмид и генов устойчивости к антибиотикам, по своим характеристикам соответствует требованиям российского и международного законодательств, применяемых для ГММ продуцентов БАВ. Сравнительный анализ характеристик исходного E. coli K-12 MG1655 и ГММ под влиянием ряда факторов внешней среды показал, что выживаемость ГММ микроорганизма в окружающей среде снижена, штамм не составляет конкуренции облигатной микрофлоре, что удовлетворяет международным требованиям безопасности в промышленной биотехнологии. Показана возможность идентификации ГММ среди других энтеробактерий методом ПЦР-анализа с использованием пар локус-специфических праймеров в областях, отличающих рекомбинантный штамм от исходного прототипа. Проведенное комплексное исследование штамма E. coli K-12 SGM2.0Pyc-int продуцента ЯК позволяет констатировать правомочность методологии, использованной при создании ГММ.
Финансирование. Работа проведена при финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (проект №18-29-14005).
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.