Введение

Внутриклеточный паразитизм является одним из основных способов, позволяющих бактериям успешно избегать гуморального иммунного ответа, а также воздействия антибиотиков и других лекарственных средств. Среди внутриклеточных паразитов немало возбудителей хронических заболеваний, включая туберкулез, лепру и хламидиоз, но многие внутриклеточные паразиты вызывают острые инфекционные заболевания, такие как лихорадка Скалистых гор и другие риккетсиозы, сальмонеллез, легионеллез, листериоз и т.д. (см. обзоры [1—6]). Даже возбудители, размножающиеся во внеклеточном пространстве, — энтеропатогенные иерсинии, стафилококки, стрептококки, — в определенные моменты способны укрыться внутри клеток [7—9]. Значимость внутриклеточного паразитизма в инфекционной патологии человека вызывает пристальный интерес к механизмам, с помощью которых осуществляется процесс взаимодействия возбудителей и клеток-хозяев.

Всех внутриклеточных бактериальных паразитов, как облигатных, так и факультативных, можно разделить на две группы: бактерии, размножающиеся внутри модифицированной фагосомы (часто называемой репликативной эндосомой), и бактерии, разрушающие фагосому и размножающиеся в цитоплазме клетки-хозяина. Размножение в цитоплазме характерно для патогенных бактерий, относящихся к родам Listeria, Rickettsia, Shigella и Burkholderia [10—13]. Несмотря на то, что перечисленные бактерии, которых мы далее в целях простоты изложения будем называть цитоплазматическими паразитами, филогенетически не родственны друг другу, они выработали очень схожие механизмы, обеспечивающие им успех как внутриклеточных паразитов. Попав в клетку в результате фагоцитоза пассивного, при захвате бактерии макрофагом, или активного, при инфицировании непрофессиональных фагоцитов, такие бактерии разрушают фагосомальную мембрану благодаря активности соответствующих ферментов и выходят в цитоплазму. Попавшие в цитоплазму бактерии формируют вокруг себя облако из актиновых микрофиламентов, т.е. из элементов цитоскелета клетки-хозяина. Впоследствии облако меняет свою структуру, перестраиваясь в длинный шлейф, получивший в англоязычной литературе название «хвост кометы» («comet tail»). Бактериальное деление играет важную роль в том, что «хвост кометы» формируется на одном (старом) полюсе. Наращивание актинового щлейфа, происходящее благодаря полимеризации актиновых микрофиламентов белком, закрепленным на поверхности бактерии, является движущей силой, опосредующей перемещение бактерии внутри клетки, а при достижении цитоплазматической мембраны, позволяющей осуществить перемещение в соседнюю клетку. Важно, что при перемещении из клетки в клетку бактерия не покидает внутриклеточного пространства, а индуцированное движущейся бактерией выпячивание, формирующееся в цитоплазматической мембране исходной клетки-хозяина, захватывается соседней клеткой через механизм, напоминающий фагоцитоз. В новой клетке двойная фагосома, сформированная мембранами старой и новой клеток, разрушается, и процесс внутриклеточного размножения/перемещения повторяется (рис. 1; для обзора см. [14—16]).

Рис. 1. Цикл внутриклеточного размножения патогенных бактерий родов Listeria, Shigella и Rickettsia.

После попадания в клетку путем фагоцитоза бактерия разрушает фагосому и выходит в цитоплазму. В результате активности поверхностных белков-факторов патогенности (ActA, IcsA и RickA/Sca2 для Listeria, Shigella и Rickettsia, соответственно) вокруг бактерии формируется облако актиновых микрофиламентов. После бактериального деления облако перестраивается в виде «хвоста кометы». Постоянный синтез F-актина на одном полюсе толкает бактерию вперед, обеспечивая внутриклеточное перемещение. При достижении бактерией цитоплазматической мембраны в мембране формируется выпячивание. Если рядом находится соседняя клетка, то она захватывает выпячивание, в результате бактерия оказывается в соседней клетке, в фагосоме, окруженная двумя мембранами: от старой и новой клетки-хозяина. Разрушение двойной фагосомы начинает новый цикл внутрицитоплазматического размножения.

Описывая процесс внутриклеточного и межклеточного перемещения, мы использовали нейтральные слова бактерия и белок, поскольку данный механизм используют все цитоплазматические паразиты, хотя белки (факторы патогенности), контролирующие полимеризацию актина и процесс формирования выпячивания, у них разные, и даже не гомологичные. Далее мы детально опишем молекулярные механизмы, опосредующие процессы внутри- и межклеточного перемещения. Начнем с короткого изложения строения и функционирования актиновых микрофиламентов — элементов цитоскелета, используемых цитоплазматическими паразитами для перемещения.

Актиновые микрофиламенты — элементы цитоскелета клетки-хозяина, которые могут попадать под контроль возбудителя

Из трех основных структур цитоскелета клетки-хозяина — актиновых микрофиламентов, микротрубочек и промежуточных филаментов — именно актиновые микрофиламенты используются цитоплазматическими паразитами для перемещения внутри и между клетками. Актин является наиболее распространенным белком в большинстве эукариотических клеток. Это очень консервативный белок, который участвует в большем количестве межбелковых взаимодействий [17]. Формирование актиновых микрофиламентов связано со способностью актина легко осуществлять переходы между мономерным (G-актин) и полимеризованным (F-актин) состояниями [18]. Этот процесс контролируется АТФазной активностью мономера актина и большим количеством актин-связывающих белков [19]. Молекула F-актина (актиновый микрофиламент) представляет собой двунитевую спираль [20]. Характерной чертой нитей F-актина является их асимметрия: на одном конце, обозначаемом как «+»-конец (или barbed end), к F-актину присоединяются молекулы G-актина, связанные с молекулой АТФ (рис. 2). На противоположном «–»-конце (pointed end) гидролизовавшие АТФ до АДФ молекулы G-актина освобождаются. Процесс роста актиновых микрофиламентов очень быстрый, скорость полимеризации мономеров G-актина достигает 3000 мономеров/с, что означает достижение микрофиламентом длины в 10 мкм менее чем за 2 с [21, 22]. Характерной чертой актиновых микрофиламентов является их механическая жесткость: актиновые микрофиламенты ведут себя как жесткие палочки [19]. Быстро растущий пучок жестких палочек толкает находящиеся перед ним предметы: так происходит при формировании фагосомальной чаши цитоплазматической мембраной, когда синтез F-актина идет непосредственно у ее поверхности [23]. Аналогично полимеризация актиновых микрофиламентов на поверхности бактериальной клетки «проталкивает» бактерию, обусловливая ее внутриклеточное перемещение.

Рис. 2. Схема формирования актиновых микрофиламентов в клетках человека и млекопитающих.

а — удлинение молекулы F-актина (актинового микрофиламента) происходит на «+»-конце молекулы за счет присоединения мономера G-актина. На «–»-конце происходит гидролиз и освобождение мономеров G-актина. Начало синтеза нового микрофиламента связано с активностью Arp2/3 комплекса, активированного белком N-WASP, связанным с малой ГТФазой Cdc42. Arp2/3комплес/N-WASP/Cdc42 связываются с F-актином, начиная синтез нового микрофиламента. N-WASP и Cdc42 затем освобождаются, в то время как Arp2/3 комплекс остается в основании микрофиламента; б — белок формин связывает две молекулы G-актина и катализирует образование димера. Процесс продолжается, при этом формин перемещается вдоль актинового микрофиламента.

In vitro процессы наращивания и распада нити F-актина могут происходить без участия дополнительных факторов и зависят от концентрации G-актина [24]. In vivo в цитоплазме эукариотической клетки концентрации G-актина достаточны для продолжения самопроизвольного синтеза F-актина. Для начала синтеза F-актина необходимы так называемые факторы нуклеации, основным из которых является олигомер из 7 белков, получивший название Arp2/3-комплекс. Для работы Arp2/3- комплексу требуется связывание с белком из семейства WASP/WAVE (Wiskott—Aldrich syndrome protein (WASP)/WASP-family verprolin-homologous protein (WAVE) [25].) [26]. Помимо Arp2/3-комплекса, к факторам нуклеации относятся белки формины, связывающие и димеризующие пару молекул G-актина, и белки семейства тандемных факторов нуклеации актина (Cobl и Spire) [27, 28]. Синтез F-актина начинается в точке, где расположены Arp2/3-комплекс, связанный с белком WASP/WAVE семейства, либо альтернативные факторы нуклеации, и продолжается в практически автоматическом режиме до тех пор, пока растущий «+»-конец не кэпируется специфическим белком (см. рис. 2). Комплекс Arp2/3 стимулирует формирование ветвящихся сетей микрофиламентов, в то время как формины стимулируют рост длинных линейных микрофиламентов.

Белки цитоплазматических бактерий, обеспечивающие полимеризацию актиновых микрофиламентов

Основной стратегией цитоплазматических паразитов, с помощью которой им удалось освоить перемещения с помощью актиновых микрофиламентов, стало использование Arp2/3-комплекса. Поверхностный белок S. flexneri IcsA (известный также как VirG) связывает белок N-WASP, активирующий Arp2/3-комплекс [29]. Напротив, поверхностные белки L. monocytogenes и R. conorii, ActA и RickA, соответственно, сами активируют Arp2/3-комплекс, мимикрируя активность белков семейства WASP/WAVE [30, 31]. Активация Arp2/3-комплекса приводит к началу формирования сети актиновых микрофиламентов на поверхности бактерии. В последние годы был открыт ряд дублирующих механизмов, активность которых можно увидеть при инактивации основного механизма полимеризации актина. Так, риккетсии, помимо белка RickA, активатора Arp2/3-комплекса, экспрессируют белок Sca2, который мимикрирует активность другого фактора нуклеации — формина [32]. Буркхолдерии перемещаются в цитоплазме с помощью белка BimA. Интересно, что белок BimA непатогенных буркхолдерий, например, B. thailandensis, по своей активности сходен с белками листерий и риккетсий и активирует Arp2/3-комплекс, мимикрируя активность белков семейства WASP/WAVE [33]. Напротив, белок BimA B. pseudomallei и B. mallei непосредственно вовлечен в полимеризацию актина [34]. Каким образом механизм формирования актинового хвоста влияет на патогенность буркхолдерий, до настоящего времени неизвестно.

Актин-полимеризующие факторы патогенности разных родов бактерий не имеют между собой родства и развивались независимо, никоим образом не являясь результатом горизонтального переноса. Фактор полимеризации актина IcsA S. flexneri связывается с ГТФ-связывающим доменом N-WASP, с которым в нормальных условиях взаимодействует малая ГТФаза Cdc42, активирующая N-WASP, позволяя взаимодействовать с Arp2/3-комплексом [35]. Специфичность взаимодействия между IcsA и N-WASP определяет спектр клеток, в которых наблюдается актин-зависимая подвижность S. flexneri: это прежде всего эпителиальные клетки, в то время как в макрофагах, в которых экспрессируется альтернативный белок того же семейства, WASP, подвижность шигелл не наблюдается [35].

Карбоксильный домен фактора патогенности L. monocytogenes белка ActA несет сайт связывания комплекса Arp2/3 и два актин-связывающих WH2 (WASP Homology 2) домена, имеющих частичную гомологию с эукариотическими белками семейства WASP/WAVE [36]. Белок RickA R. conorii и других высоковирулентных риккетсий также имеет гомологию с белками семейства WASP/WAVE, однако взаимное расположение Arp2/3- и актин-связывающих участков, также как дополнительные домены отличаются от того, что описано для ActA, что говорит о независимом приобретении листериями и риккетсиями мотивов белка млекопитающих [37, 38].

Полярная локализация актинового «хвоста кометы»

Полярная локализация точки роста актиновых микрофиламентов существенна для внутрицитоплазматического перемещения. Первоначальное облако актиновых микрофиламентов, окутывающее бактерию после выхода в цитоплазму из разрушенной фагосомы, после бактериального деления перестраивается в виде хвоста кометы, длина которого может составлять несколько десятков длин бактерии. Жесткий пучок микрофиламентов, растущий на одном полюсе, «проталкивает» бактерию вперед, обеспечивая внутриклеточное перемещение. Одни и те же поверхностные белки обеспечивают синтез F-актина на поверхности бактерий на начальной стадии актинового «облака» и на стадии внутрицитоплазматического перемещения. Вопрос, что именно определяет полярную локализацию факторов полимеризации актина, имеет длительную историю. Первоначальное наблюдение, что для перестройки актинового облака S. flexneri в «хвост кометы» необходимо деление бактерии, в итоге привело к открытию сложного механизма направления белка IcsA к бактериальным полюсам путем взаимодействия с белком PhoN2 и широко распространенным порообразующим белком OmpA [39—41]. Эффект латеральной диффузии, приводящей к постепенному смещению IcsA с полюса, гасится благодаря активности специфической протеазы IcsP, равномерно расщепляющей IcsA [40]. Однополярное распределение ActA на поверхности клетки L. monocytogenes также обусловлено бактериальным делением [42]. Специфическое отщепление мембранного якоря может влиять на поддержание полярного распределения ActA [43]. Однако детали перераспределения ActA на поверхности внутрицитоплазматических листерий, до настоящего времени не изучены.

Перемещение патогенных бактерий из клетки в клетку

Что же происходит, когда бактерия достигает цитоплазматической мембраны? В условиях изолированных клеток in vitro, а также в таких клетках, как макрофаги или фибробласты, которые не образуют плотных барьеров, актинзависимая подвижность цитоплазматических бактерий, достигших цитоплазматической мембраны, приводит к формированию выступающих во внеклеточное пространство характерных выпячиваний цитоплазматической мембраны, содержащих бактерию (см. рис. 1). Параметры выпячиваний зависят от вида бактерий: L. monocytogenes и S. flexneri формируют длинные выпячивания (20—30 мкм), в то время как выпячивания, формируемые риккетсиями, не превышают 2—3 мкм [44, 45]. Буркхолдерии не формируют мембранных выпячиваний для перемещения из клетку в клетку, а используют механизм клеточного слияния [46].

Изменения формы поверхности клетки являются рутинной частью ее жизни и опосредуют такие процессы, как перемещение, пино- и фагоцитоз, клеточное деление. Формирование ламеллоподий и филоподий при клеточном перемещении, или фагосомальной чаши при фагоцитозе связано с перестройками актиновых микрофиламентов, физически связанных с мембраной через мембранные белки [19, 47]. Кортикальный примембранный цитоскелет представляет собой жесткую сеть актиновых микрофиламентов, активный рост которой в сторону чрезвычайно гибкой мембраны приводит к изменению формы последней.

Аналогичные изменения в форме мембраны происходят при формировании выпячиваний, индуцируемых цитоплазматическими бактериями при перемещении из клетку в клетку. В одиночно расположенных клетках сила, обеспечиваемая основанной на полимеризации актина подвижностью цитоплазматических бактерий, может быть единственным фактором, контролирующим образование выпячиваний. Экспрессия в E. coli связывающего N-WASP/Arp2/3 комплекс белка шигелл IcsA приводит к внутриклеточной подвижности и формированию выпячиваний при введении рекомбинантных бактерий в цитоплазму [48].

Однако in vivo инфицированные клетки обычно являются фрагментом ткани. Энтероциты, выстилающие просвет кишечника, гепатоциты печени и эндотелий сосудов, которые часто являются мишенью цитоплазматических паразитов, состоят из поляризованных клеток, соединенных межклеточными контактами. По мере созревания контактов в областях контактов формируется плотная сеть элементов цитоскелета. Преодоление такой сети и ремоделирование латеральной мембраны, укрепленной местами межклеточных контактов, требует от бактерий дополнительных усилий.

Межклеточные контакты эпителиальных и некоторых других типов клеток включают плотные контакты, регулирующие межклеточный транспорт, и предотвращают диффузию мембранных белков; адгезивные контакты, обеспечивающие механическую прочность ткани благодаря сети актиновых микрофиламентов, которые связывают актиновый цитоскелет примыкающих друг к другу клеток; десмосомы, выполняющие структурную функцию благодаря участию промежуточных филаментов [49, 50]. Для перемещения цитоплазматических паразитов особенно важны адгезивные контакты. Адгезивные контакты формируются трансмембранными белками, включая белки кадгерины, которые непосредственно взаимодействуют с сетью актиновых микрофиламентов в кортикальной области и с кадгеринами соседней клетки, а также большой белок Tuba, который контролирует перестройки актиновых микрофиламентов [51]. Адгезивные контакты и десмосомы отвечают за упругость межклеточных контактов, лежащую в основе упругости ткани.

Силы, поддерживающие межклеточные контакты в упругом состоянии, являются первым препятствием для бактерии, поскольку физически мешают формированию в мембране выпячиваний. Цитоплазматические бактерии выработали ряд механизмов, позволяющих «расслабить» латеральную мембрану в области адгезивных контактов. Мишенью листерий является мембранно-ассоциированный белок Tuba. Tuba — это крупный 177 кДа белок, связывающий одновременно N-WASP, регуляторную ГТФазу Cdc42 и белок динамин, участвующий в процессах эндо- и экзоцитоза [52]. Секретируемый листериями белок InlC связывается с Tuba в области связывания N-WASP, фактически вытесняя последний [53, 54]. Нарушение функций Tuba приводит к ингибированию нормальных процессов синтеза кортикального F-актина, уменьшению упругости латеральной мембраны и позволяет листерии сформировать в мембране выпячивание.

Риккетсии также воздействуют на состояние кортикального актинового цитоскелета с помощью секретируемого фактора патогенности. Белок R. parkeri Sca4 (surface cell antigen 4) нарушает взаимодействие актиновых микрофиламентов с кадгеринами, что приводит к устранению физического натяжения, определяющего упругость латеральной мембраны [55]. Sca4 разрушает взаимодействие между тремя белками: E-кадгерином, α-катенином и винкулином, из которых последний непосредственно связан с F-актином. В результате E-кадгерин, осуществляющий межбелковые межклеточные взаимодействия, оказывается фактически изолирован от сети актиновых микрофиламентов, что приводит к расслаблению межклеточного контакта.

Меньше известно о механизмах преодоления упругости латеральной мембраны шигеллами. Было показано, что до 80% перемещений шигеллы осуществляют в местах трехсторонних контактов, т.е. там, где контактируют 3, а не 2 клетки [56]. Такие контакты характеризуются более высокой активностью экзоцитоза и особенностями белкового состава контактов, но встречаются относительно редко, что может влиять на эффективность распространения шигелл [57].

После начала формирования выпячивание распространяется в соседнюю клетку. Длинные выпячивания, формируемые листериями и шигеллами, требуют дополнительных механических усилий, которые позволили ли бы перераспределить поверхность мембраны. Шигеллы используют с этой целью стандартный молекулярный мотор клеток млекопитающих — миозин X, который связывается с мембраной и движется вдоль актиновых микрофиламентов бактериального «хвоста кометы», двигая мембрану [45]. Для листерий роль молекулярных моторов не была описана, и, возможно, она не столь существенна, учитывая, что для синтеза F-актина листериям требуется на один элемент меньше, чем шигеллам, — листериозный белок ActA сам выполняет функцию белков WASP/WAVE, в то время как IcsA его связывает (см. выше). С другой стороны, в ходе формирования длинных выпячиваний листериям может не хватать мономеров G-актина, что приводит к постоянным перестройкам «актинового хвоста». Стабилизацию «хвоста кометы» при межклеточном перемещении L. monocytogenes выполняет белок эзрин, относящийся к так называемому ERM- (ezrin, radixin, moesin) семейству белков, связывающих микрофиламенты с трансмембранными белками, в частности, с CD44 [58]. Вторая пара белков млекопитающих, поддерживающая структуру содержащих листерий выпячиваний, — это мембранный белок CD147 и контролирующая его активность пролил-цис/транс изомераза CypA [59]. Перечисленные белки, по-видимому, стабилизируют структуру актинового шлейфа внутри выпячивания, не допуская его распада при перестройках. В целом картина формирования выпячиваний до конца не ясна и требует дальнейших исследований для каждого из перечисленных возбудителей. Однако очевидно, что механизмы, используемые бактериями для формирования выпячиваний, эволюционировали независимо, хотя фенотипический эффект выглядит сходным.

Почему цитоплазматические возбудители не используют собственные флагеллы для перемещения внутри клетки?

Конвергентная эволюция механизмов, используемых для внутриклеточного и межклеточного перемещения цитоплазматическими бактериями, свидетельствует о том, что им жизненно важно использовать именно элементы цитоскелета клетки-хозяина, хотя некоторые из перечисленных возбудителей вполне обходятся собственными силами для перемещения в окружающей среде. Например, характерным признаком L. monocytogenes является подвижность при 22 °C, которая сменяется неподвижностью при выращивании культуры при 37 °C и выше, т.е. температуре тела млекопитающих [60]. Подавление экспрессии генов, отвечающих за синтез флагелл, контролируется системой «молекулярных термометров»на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях [61]. Подавляющее большинство штаммов представителей рода Shigella неподвижны, хотя содержат криптические гены, кодирующие флагеллин, гомологичные функциональным генам близкого родственника шигелл Escherichia coli [62]. Возбудитель сапа, B. mallei, неподвижен, в то время как возбудитель мелиоидоза, B. pseudomallei, подвижен, и флагеллы способствуют инвазии B. pseudomallei в непрофессиональные фагоциты in vitro [63]. Флагеллы листерий также увеличивают эффективность инвазии клеток в культуре, хотя, по-видимому, in vivo такой процесс маловероятен в силу указанных выше причин [64].

Предполагается, что иммунодоминантность структурного компоненты флагелл, белка флагеллина, является одной из причин, почему связанная с флагеллами подвижность подавляется при попадании в организм и, в частности, в цитоплазму [65, 66]. Альтернативная гипотеза состоит в том, что внутриклеточное перемещение с помощью флагелл может быть затруднено вследствие физических причин, в частности, повышенной вязкости цитоплазмы. Цитоплазма включает множество жестких и полужестких структур, включая те же актиновые микрофиламенты, поэтому, когда говорят о вязкости цитоплазмы, имеют в виду ее «жидкую» часть. Измерения, проведенные с помощью флюоресцирующих красителей и различных микрофлюометрических подходов, показали, что вязкость «жидкой» части цитоплазмы выше, хотя и незначительно, вязкости чистой воды: вязкость цитоплазмы составляет приблизительно 1,1—1,5 сантистокса при вязкости воды, равной 1,0 сантистоксу [67, 68]. Недавно нами было показано, что даже незначительное увеличение вязкости среды до 1,05—1,3 сантистокса приводит к потере способности листерий к активному самостоятельному передвижению при помощи флагелл [69]. Таким образом, изменение физических параметров вязкости жидкости может быть одной из причин необходимости использования элементов цитоскелета для внутрицитоплазматического перемещения. Еще одной причиной, становящейся очевидной из приведенного выше анализа механизмов перемещения бактерий из клетки в клетку, является необходимость координировать состояние латеральной мембраны и сети актиновых микрофиламентов в прилегающей к ней области, а также поддерживать стабильность мембранных выпячиваний для обеспечения диссеминации внутри тканей. Выполнить указанные действия невозможно без наличия бактериальных факторов, способных контролировать синтез и перестройки актиновых микрофиламентов.

В целом, на примере цитоплазматических возбудителей мы видим, как конвергентная эволюция приводит к оптимальному для возбудителей решению путем независимого развития сходных механизмов контроля отдельных элементов клетки-хозяина. Механизмы перемещения из клетки в клетку, не покидая внутриклеточного пространства, обеспечивают цитоплазматических возбудителей очевидными преимуществами по сравнению с другими внутриклеточными паразитами, которым угрожают как Т-киллеры и прочие элементы иммунной системы, убивающие инфицированные клетки, так и потенциальная возможность самой клетки-хозяина погибнуть в результате апоптоза. Перемещение в соседнюю клетку обеспечивает ускользание возбудителя от указанных механизмов защиты. Предотвращение этого процесса может стать важной стратегией борьбы с цитоплазматическими паразитами, а факторы патогенности, управляющие процессами внутри- и межклеточного перемещения, — новой мишенью для разработки антибактериальных препаратов.

Соблюдение этических норм.

Эта статья не содержит каких-либо исследований с участием животных или людей, выполненных кем-либо из авторов.

Вклад авторов.

САЕ — идея обзора и написание окончательного варианта, ТЮБ, ТВМ, ОВК — написание черновика, все авторы — сбор литературы, все авторы поддержали окончательный вариант.

Финансирование. Работа выполнена при поддержке Федерального научно-исследовательского центра вирусологии и микробиологии по государственному заданию. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием животных в качестве объектов.

Конфликт интересов. Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.