Вирус бешенства способен вызвать у человека и животных остропротекающую болезнь, характеризующуюся поражением центральной нервной системы с развитием полиэнцефаломиелита и летального исхода. В Российской Федерации, по данным Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, ежегодно за антирабической помощью обращаются около полумиллиона человек, больше половины из них получают специфическое антирабическое лечение. В большинстве случаев заражение человека происходит при укусе больного животного либо ослюнении больным животным. Для предупреждения развития инфекции при укусах опасной локализации пациенту назначают антирабический иммуноглобулин (АИГ) в комбинации с антирабической вакциной [1]. Единственным производителем АИГ на территории Российской Федерации является ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора.

При производстве гетерологичного АИГ в качестве материала для иммунизации продуцентов антирабической сыворотки используют фиксированный вирус бешенства производственного штамма «Москва 3253», репродукцию которого осуществляют на кроликах при внутримозговых пассажах [1, 2]. С целью усовершенствования технологии производства гетерологичного АИГ для репродукции указанного штамма вируса бешенства и получения материала для иммунизации продуцентов предложено использование клеточной культуры Vero [3, 4]. Выбор субстрата для репродукции вируса — клеточной линии Vero — обусловлен ее безопасностью, отсутствием онкогенных свойств, а также преимуществами перевиваемых клеточных линий: высокой потенцией роста клеток, стандартностью биологических свойств, возможностью крупномасштабного культивирования в ферментерах большого объема [5]. Для адаптации производственного штамма вируса бешенства штамма «Москва 3253» к репродукции в культуре клеток Vero нами проведено более 180 пассажей. В результате вирус приобрел способность накапливаться в культуральной жидкости в достаточном количестве, чтобы ее использовать для иммунизации продуцентов антирабической сыворотки и получения специфически активного препарата, предназначенного для создания пассивного иммунитета [3]. Выделенный из сыворотки лошадей, иммунизированных культуральным рабическим антигеном, специфический иммуноглобулин был изучен по основным биологическим и физико-химическим параметрам. Результаты проведенных исследований доказывают возможность использования культурального рабического антигена в производстве АИГ, так как последний по своим свойствам и уровню специфической активности удовлетворяет требованиям нормативной документации [3]. Однако вопрос использования штамма «Moscow 3253», адаптированного к репродукции на клеточной культуре Vero, при производстве АИГ требует выполнения ряда исследований, в том числе по изучению трансформации его генома. В данной работе мы впервые представляем данные о полном геноме вируса бешенства «Moscow 3253», адаптированного к клеточной линии Vero, и проводим его сравнительный анализ с геномом исходного производственного штамма вируса бешенства «Москва 3253». Результаты анализа показывают, что в процессе адаптации к клеточной линии Vero геном вируса бешенства «Moscow 3253» приобрел более 1 тыс. единичных мутаций, несколько сотен из которых характерны для многих других геномов вируса бешенства, также адаптированных к данной культуре клеток и образующих на филогенетическом дереве компактный кластер. Проведенный нами анализ состава линейных эпитопов антигенных сайтов связывания белка G в геноме вируса бешенства «Moscow 3253» после его адаптации к клеткам Vero показал появление у данного белка мутаций в аминокислотной последовательности антигенных сайтов I (L231P) и II (G40E).

Цель исследования — биоинформационный анализ генома вируса бешенства «Moscow 3253», адаптированного к клеточной линии Vero.

Материал и методы

Культивирование и выделение РНК

Производственный штамм вируса бешенства «Москва 3253» (номер депозита 61/91, пассаж 3) получен из ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», а затем адаптирован к репродукции на клеточной линии Vero (далее — Moscow 3253 (Vero), прошедшего 186 пассажей) в ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб». Культивирование вируса осуществляли на среде 199 с добавлением 5% сыворотки крупного рогатого скота (КРС). Вирус вносили в клеточную суспензию в инфицирующей дозе 0,1—1,0 ИД₅₀/клетку (ИД₅₀ — доза, при введении которой инфицируется 50% экспериментальных особей). Культивирование вируса осуществляли в течение 4—5 сут в СО₂-инкубаторе (Sanyo, Япония) при 37 °C. Культуральную вируссодержащую жидкость собирали в пробирки, центрифугировали с целью осаждения клеточного дебриса и инактивировали при 56 °C в течение 30 мин.

Подготовка пробы и секвенирование

Реакцию обратной транскрипции для получения кДНК проводили с использованием набора реагентов «RevertAid First strand cDNA Synthesis Kit» (Fermentas, Латвия). Для специфического обогащения полученных фрагментов кДНК нуклеотидной последовательностью исследуемого вируса были использованы 16 пар праймеров [6]. Реакцию амплификации проводили в термоциклере БИС (М111-05, ООО «БИС-Новосибирск») по программе: 96 °C — 3 мин (1 цикл); 96 °C — 1 мин, 50 °C — 1 мин, 72 °C — 1,5 мин (40 циклов); 72 °C — 3 мин (1 цикл); 10 °C — температура хранения.

Полногеномное секвенирование проводили на платформе «Ion PGM» (Ion Torrent, США) с использованием стандартных протоколов пробоподготовки и программного обеспечения. Библиотеку фрагментов геномной ДНК для секвенирования получали при помощи Ion Xpress™ Plus Fragment Library Kit (Thermo Fisher Scientific, США). Эмульсионную ПЦР проводили, используя набор реактивов Ion PGM™ Hi-Q™ View OT2 Kit (Thermo Fisher Scientific, США). Для проведения секвенирования использовали Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit и микрочип Ion 318™ Chip v2 BC. Первичная обработка данных проведена на программном обеспечении Ion Torrent Suite 5.2 (Thermo Fisher Scientific, США). Для уточнения данных все 16 перекрывающихся областей генома были секвенированы дополнительно (за исключением локуса 4 [6], он определен частично) с использованием генетического анализатора АВ 3500xl (Thermo Fisher Scientific, США). Пробоподготовку осуществляли по протоколу с набором BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific, США), для очистки продуктов реакции использовали BigDye XTerminator Purification Kit (Thermo Fisher Scientific, США). Секвенирование фрагментов проводили с использованием полимера РОР7 (POP-7™ Polymer for 3500/3500xL Genetic Analyzers), анодного (Anode buffer container) и катодного буфера (Cathode buffer container), а также капилляров длиной 50 см (Capillary array 24-cap 50 cm). Сбор данных осуществляли с помощью программного обеспечения Data Collection Software 3.1 (Thermo Fisher Scientific, США).

Обработка данных и биоинформационный анализ

Выравнивание и сборку секвенированных на платформе «Ion PGM» последовательностей в полный геном осуществляли с помощью программы DNASTAR Lasergene 11.2 (DNASTAR, Inc., США) и MEGA 7 (https://www.megasoftware.net). В качестве референс-генома в биоинформационном анализе использовали нуклеотидную последовательность производственного штамма вируса бешенства «Москва 3253» (KM198893). Анализ данных полученных на генетическом анализаторе АВ 3500xl проводили с использованием программного обеспечения Sequencing Analysis 6.0 (Thermo Fisher Scientific, США и MEGA 7.

Сравнительный анализ состава линейных эпитопов антигенных сайтов связывания белка G в геноме вируса бешенства «Moscow 3253 (Vero)» проводили в программе MEGA 7.

Для проведения сравнительного филогенетического анализа нуклеотидной последовательности генома штамма «Moscow 3253 (Vero)» было отобрано 479 геномов вируса бешенства, представленных в базе данных NCBI GenBank (рис. 1).

Рис. 1. Положение генома штамма «Moscow 3253 (Vero)» и «Москва 3253» на филогенетическом дереве, состоящем из 480 геномов вируса бешенства (Rabiesvirus).

Штамм «Moscow 3253 (Vero)» входит в состав кластера 1, состоящего из 139 близких по подобию геномов вакцинных штаммов вируса бешенства. Штамм «Москва 3253» входит в состав кластера 3. Для всех кластеров состав входящих в них геномов представлен в приложении (для кластеров 2—7 пронумерованы их отдельные ветви, состав каждой из которых дан в приложении).

Отбор геномов вируса бешенства для анализа проводили по следующим критериям: наличие не менее 90% от величины полного генома, составляющего около 11 930 нуклеотидов; идентичность выбранных последовательностей составляла не менее 90% относительно генома вируса бешенства «Москва 3253» (KM198893). Для выравнивания последовательностей геномов и построения дендрограммы (алгоритм maximum parsimony) применяли пакет программ BioNumerics 7.6 (Applied Maths, Бельгия).

Результаты и обсуждение

Секвенирование и сравнительный анализ

Секвенированная нуклеотидная последовательность генома вируса бешенства «Moscow 3253 (Vero)» депонирована в NCBI GenBank под номером MF630920. Общий размер полученного генома составил 11 893 нуклеотида (около 39 последних нуклеотидов не были определены). При анализе полученных данных установлено, что на всей протяженности исследуемого генома вируса бешенства «Moscow 3253 (Vero)» в сравнении с его исходным вариантом имеется 1069 единичных мутаций. Количество несинонимичных единичных нуклеотидных замен составило 207, синонимичных — 686, 176 единичных мутаций располагаются в межгенных областях и некодирующих участках генома, а также есть вставка единичного нуклеотида (+ «A», после 3192 н) в полиадениновом фрагменте между генами, кодирующими матричный протеин (M) и гликопротеин (G).

Согласно данным литературы [7], геном вируса бешенства представлен несегментированной одноцепочечной негативно-спиральной РНК, в которой расположены гены (3’-N-P-M-G-L-5’), кодирующие 5 структурных белков. Обратная транскриптаза (L), нуклеопротеин (N) и фосфопротеин (P) вместе с РНК образуют активный РНК-комплекс, который контролирует как транскрипцию, так и репликацию; гликопротеин и матричный протеин (G и M) входят в состав полипептидной оболочки. [8].

В табл. 1 представлены различия в кодирующих частях генов штаммов «Москва 3253» и «Moscow 3253 (Vero)».

Таблица 1. Различия в кодирующих частях генов вирусов бешенства «Москва 3253» и «Moscow 3253 (Vero)»

Название гена	Размер кодирующей части гена, нуклеотидов/аминокислот	Общее число единичных нуклеотидных замен (несиноним./синоним.)	Процентная доля замененных аминокислот
N	1353/451	101 (14/87)	3,1
G	1575/525	143 (47/96)	8,95
P	894/298	94 (32/62)	10,74
M	639/213	51 (21/30)	9,86
L	6384/2128	504 (93/411)	4,37

Весь геном вируса бешенства «Moscow 3253 (Vero)» в ходе адаптации к культуре клеток приобрел множество единичных нуклеотидных замен. Аминокислотная последовательность белка нуклеопротеина N оказалась самым консервативным регионом из всех представленных белков вируса бешенства. Максимальным изменениям подверглись гены P, M и G. Белок фосфопротеина P играет ключевую роль в транскрипции и репликации вирусного генома и способен ингибировать выработку внутриклеточного интерферона [9—11]. Белок гликопротеина G отвечает за взаимодействие с клеточными сайтами связывания (рецепторами) [12], а белок матричного протеина M взаимодействует с цитоплазматическим доменом белка G и рибонуклеопротеином при сборке вириона вируса бешенства [13].

Антигенные сайты связывания белка G

Проведенный нами анализ состава линейных эпитопов антигенных сайтов связывания белка G в геноме вируса бешенства «Moscow 3253 (Vero)» показал появление у данного белка мутаций в аминокислотной последовательности антигенных сайтов I (L231P) и II (G40E), относительно структуры белка G исходного штамма «Москва 3253» (табл. 2).

Таблица 2. Сравнение аминокислотных последовательностей антигенных сайтов связывания белка G в геномах вирусов бешенства «Moscow 3253 (Vero)» и «Москва 3253»

Штамм	Антигенный сайт I* (226—231), L231P	Антигенный сайт II (34—42, 198—200), G40E	Антигенный сайт III (330—338, 342—343)
Moscow 3253 (Vero) (MF630920)	KLCGVP	GCTNLSEFS, KRA	KSVRTWNEI, KG
Moscow 3253 (KM1988931)	KLCGVL	GCTNLSGFS, KRA	KSVRTWNEI, KG

Примечание. * — аминокислотные последовательности антигенных сайтов белка G указаны согласно данным в статье J. Evans и соавт. [14].

По данным проведенных ранее исследований, физико-химические и биологические свойства АИГ, полученного по технологии с использованием штамма вируса бешенства «Moscow 3253 (Vero)», удовлетворяют требованиям нормативной документации на АИГ из сыворотки крови лошади [3]. В этой связи мы предполагаем, что выявленные мутации в аминокислотной последовательности антигенных сайтов I и II белка G в геноме вируса бешенства «Moscow 3253 (Vero)» не оказывают существенного влияния на иммунный ответ и накопление специфических антител в крови лошадей.

Филогенетический анализ

Филогенетический анализ показал, что геном вируса бешенства «Moscow 3253 (Vero)» после адаптации к клеточной линии Vero отличался на 9% относительно генома исходного производственного штамма «Москва 3253», что привело к сильному удалению штамма «Moscow 3253 (Vero)» от штамма «Москва 3253» на филогенетическом дереве (см. рис. 1, кластер 1 и кластер 3, соответственно).

Перечень геномов вирусов бешенства (Accession Number и название штаммов), образующих каждый из кластеров и их отдельные ветви на рис. 1, представлен в приложении (supplements) к статье (приложение будет прикреплено к PDF статьи в электронном варианте).

Геном вируса бешенства «Moscow 3253 (Vero)» имеет максимальную гомологию (99,3%) с геномами следующих штаммов вируса бешенства, представленных в NCBI GenBank: sadERAtueb_1_var01, sadERAtueb_4_var01, ERAVC, ERA и ERA (LN713630, LN713633, FJ913470, EF206707 и AB781935), которые отличаются от него на 80—84 единичные нуклеотидные замены — SNP (Single nucleotide polymorphism). Следует отметить, что вся ветвь филогенетического дерева, на которой расположен геном вируса бешенства «Moscow 3253 (Vero)» и еще 138 близких друг другу геномов этого вируса, представлена штаммами, полученными также путем их адаптации к культуре клеток линии Vero или ВНК (см. рис. 1, кластер 1; рис. 2). Все геноварианты вируса бешенства в кластере 1 (см. рис. 1) генетически близки друг другу. Различия в геноме среди штаммов указанного кластера не превышают 2%, при этом все принадлежащие этому кластеру геномы имеют не менее 400 общих единичных нуклеотидных замен, характерных только для штаммов данного кластера, отличающих их от всей остальной выборки штаммов вируса бешенства. Данное обстоятельство дает основание полагать, что наличие большого количества идентичных единичных мутаций у геномов вируса бешенства из рассматриваемого кластера (см. рис. 2 и рис. 1, кластер 1) является результатом адаптации репродукции вируса к подобной среде (линии культуры клеток).

Рис. 2. Отдельное представление кластера 1 из филогенетического дерева на рис. 1.

Показано положение штамма «Moscow 3253 (Vero)» относительно других штаммов вируса бешенства, адаптированных к культуре клеток линии Vero и ВНК, которые составляют весь кластер 1. В границах обрисовки под цифрой 1 располагаются наиболее филогенетически близкие к геному штамма «Moscow 3253 (Vero)» геномы штаммов — sadERAtueb_1_var01, sadERAtueb_4_var01, ERAVC, ERA, ERA. В границах обрисовки под цифрой 2 располагается группа из 5 вариантов штаммов sadWistar... и единичные штаммы SAD13670_var_1, SAD13670_var_2. В границах обрисовки под цифрой 3 располагаются группы штаммов с общим началом в названиях: SAD Bernoriginal var..., sadB19p1..., sadBatch744..., sadBatch793..., sadBatch806..., sadBernO..., sadLysvulpen0609..., sag2BatchF04..., sadP588..., sadB19Behr..., а так же штаммы: SAD Bern (Lysvulpen), SAD Bern (Sanafox), SAD B19-4th, SRV9, SAD P5/88 (Rabifox), SAD VA1 (original), SAG_2.

Геном исходного производственного штамма «Москва 3253» оказался филогенетически близок только одному геному вируса бешенства из данной выборки — штамму RV-97, который является производным от штамма «Москва 3253» (см. рис. 1, кластер 3) [15].

Заключение

Полногеномное секвенирование нуклеотидной последовательности штамма вируса бешенства «Moscow 3253 (Vero)», адаптированного к клеточной линии Vero, позволило установить филогенетическую близость его генома к разнообразным вакцинным вариантам генома вируса бешенства, представленным в базе данных NBCI GenBank, которые также адаптированы к клеточной культуре Vero или ВНК.

Полученные нами данные показывают сильное влияние клеточной культуры Vero как среды репродукции вируса бешенства «Moscow 3253 (Vero)» на приобретение его геномом множества характерных единичных мутаций. Тем не менее физико-химические и биологические свойства АИГ, полученного по технологии с использованием штамма вируса бешенства «Moscow 3253 (Vero)», удовлетворяют требованиям нормативной документации на АИГ из сыворотки крови лошади, что было показано нами в проведенных ранее исследованиях [3]. Эти данные показывают перспективу использования вируса бешенства, адаптированного к клеточной линии Vero, для получения вакцины против бешенства.

Финансирование. Работа не имела спонсорского участия.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.