Введение

Вирусные гепатиты являются 7-й по значимости причиной смертности во всем мире, и примерно 47% этих смертей связаны с вирусом гепатита B (ВГВ) [1]. По оценкам ВОЗ, в 2015 г. 257 млн человек жили с хроническим гепатитом B (определяемым по выявлению в периферической крови поверхностного антигена вируса гепатита B — HBsAg), но только 10,5% были осведомлены о своей инфекции и только 16,7% пациентов с установленным диагнозом получали лечение [2]. В Российской Федерации показана умеренная (2—7%) распространенность ВГВ. На территории РФ в период 1999—2017 гг. показано снижение заболеваемости острым вирусным гепатитом B (ОВГВ) и отмечена тенденция к росту хронического вирусного гепатита B (ХВГВ) в среднем до 9,28 на 100 тыс. населения и до 31,1 на 100 тыс. населения в Дальневосточном округе. На 31.12.15 в Северо-Западном федеральном округе число больных ХВГВ достигло 233 190 (прирост 5814 человек) [3].

В настоящее время ВГВ подразделяют на 9 генотипов (A-I), отличающихся по составу нуклеотидных последовательностей более чем на 8%, и на 48 субгенотипов (в пределах генотипов A-D, F), отличающихся на 4—7,5% [4—6], а также генотип J, филогенетически позиционирующийся между ВГВ человека и обезьян.

Изучение генетической гетерогенности ВГВ стало основной проблемой в исследованиях, направленных на понимание взаимосвязи между геновариантами вируса и широким спектром клинических и патологических состояний, связанных с инфекцией, ответом на антивирусную терапию и прогнозом заболевания [7, 8].

Многочисленные исследования показали, что разные генотипы и субгенотипы распределены неравномерно, могут преобладать в разных географических регионах, и это распределение часто является отражением международных миграций человека и отношений между людьми. Наиболее распространенным геновариантом ВГВ является генотип D с преобладанием в Юго-Восточной Европе, Средиземноморском бассейне, на Ближнем Востоке и на индийском субконтиненте [9]. ВГВ генотип D имеет самый короткий из всех вариантов ВГВ геном (3182 нт) и характеризуется делецией протяженностью 33 нт в начале региона pre-S1. По сравнению с другим широко распространенным в мире генотипом A генотип D связан с более тяжелыми клиническими исходами цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномой (ГЦК), а также с более низким ответом на лечение альфа-интерфероном; пациенты с ОВГВ, инфицированные генотипом D, имеют более высокий уровень хронизации, чем пациенты, инфицированные генотипами B и C [10]. В настоящее время генотип D представлен 10 субгенотипами (D1-D10), из которых D1-D3 выявляют во всем мире, в то время как D4-D10 имеют ограниченное распространение [11]. Субгенотипы D3 и D6 были недавно перегруппированы в один субгенотип D3 [9].

В Российской Федерации распространен ВГВ генотипов D и A с преобладанием субгенотипа D2. Однако за счет активной миграции населения — как туристической, так и в первую очередь трудовой — на территории РФ не только обнаруживают случаи завозных изолятов из стран с высокой распространенностью хронических вирусных гепатитов, но и выявляют постепенные изменения в генотипической структуре ВГВ в регионах. Так, например, в Северо-Западном федеральном округе существенно возрос уровень встречаемости субгенотипов D1 и D3, характерных для стран Средней Азии [12, 13].

Эпидемия гепатита B в мире неоднородна, это сложный, динамический, все время развивающийся процесс, связанный с постепенно меняющейся генотипической структурой вируса в различных регионах мира. Крайне важно постоянно отслеживать разнообразие и распространение ВГВ, учитывать завозные изоляты, происходящие из стран с высокой распространенностью гепатотропных вирусов и зависящие от миграционных волн.

Во время исследования генетической структуры ВГВ в группе больных с хроническими вирусными гепатитами мы выявили изолят ВГВ, при анализе Pre-S1/Pre-S2/S региона генома которого установлено, что пациент был инфицирован редким субгенотипом D4, ранее не выявлявшимся на территории РФ, что вызвало интерес к настоящему исследованию. Позже мы обнаружили еще 2 случая заражения ВГВ D4.

Цель работы — провести секвенирование полного генома и изучить молекулярно-генетическую структуру изолятов ВГВ D4, впервые выявленных на территории Российской Федерации.

Материалы и методы

В работе были использованы 3 образца плазмы крови, полученные в 2015, 2017 и 2018 г. соответственно от пациентов с характеристиками, представленными в таблице.

Таблица. Характеристика обследованных пациентов

Амплификацию и последующее секвенирование осуществляли с использованием nested-ПЦР. На первом этапе проводили асимметричную ПЦР с использованием протяженных олигонуклеотидов, а на втором этапе для повышения чувствительности проводили ПЦР с использованием продукта амплификации первой реакции и одной из пар внутренних (вложенных, гнездовых) перекрывающихся праймеров, совместно фланкирующих полный геном ВГВ (гены S, P, C, X). Секвенирующую реакцию проводили согласно инструкции к набору реагентов ABI PRISM BigDye Terminator v3.1. (Applied Biosystems, США) на прямых и обратных праймерах в трех повторах. Анализ продуктов секвенирующей реакции проводили с использованием генетического анализатора ABI Prism 3500 (Applied Biosystems, США).

Первичный анализ полученных в ходе секвенирования фрагментов осуществляли с помощью программы NCBI Blast в сравнении с нуклеотидными последовательностями, представленными в международной базе данных GenBank. Выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили в программе MEGA 7.0, используя алгоритм ClustalW [14]. Для построения филогенетических деревьев и последующего филогенетического анализа рассматривали расстояния между последовательностями методом присоединения соседей, позволяющим оптимизацию дерева в соответствии с критерием «сбалансированной минимальной эволюции» (Neighbor-joining), для оценки достоверности построенных деревьев проведен бутстреп (bootstrap) для 1000 повторов.

Серологический подтип ВГВ определяли на основе аминокислотной последовательности HBsAg.

Для выявления возможной рекомбинации изолятов выполняли анализ с использованием инструмента генотипирования NCBI [15] и программного обеспечения RDP4 [16].

Результаты и обсуждение

Для всех 3 изолятов получены нуклеотидные последовательности полных геномов ВГВ, депонированные в международную базу данных GeneBank под номерами MN365238, MN365239, MN365240.

Все 3 изолята относились к серотипу ayw2, наиболее часто встречающемуся среди ВГВ D4.

Филогенетические отношения между исследованными изолятами и референсными последовательностями представлены на рис. 1.

Рис. 1. Филогенетическое дерево исследованных изолятов ВГВ, выделенных от пациентов с ВГВ D4, проживающих на территории РФ, в сравнении с представленными в международной базе данных GenBank референсными последовательностями.

Референсные последовательности обозначены кодами GenBank с указанием генотипа/субгенотипа. Кружками обозначены образцы, исследованные в настоящей работе. Даны значения bootstrap ≥70%.

Для лучшей дифференциации полученных изолятов мы выбрали в международной базе данных GenBank 33 полных генома ВГВ субгенотипа D4 и 14 рекомбинантов D/E из разных регионов мира. При филогенетическом анализе выявленные нами изоляты образовали монофилетический кластер, связанный только с изолятом из Южной Африки (рис. 2), что предполагает однократное внедрение этого субгенотипа в регион и дальнейшее распространение в ограниченной группе.

Рис. 2. Филогенетическое дерево исследованных изолятов ВГВ, выделенных от пациентов с ВГВ D4, проживающих на территории РФ, в сравнении с представленными в международной базе данных GenBank нуклеотидными последовательностями ВГВ субгенотипа D4 и рекомбинантов D/E.

Референсные последовательности обозначены кодами GenBank с указанием субгенотипа и региона происхождения изолята. Ромбами обозначены образцы, исследованные в настоящей работе. Даны значения bootstrap ≥70%.

Существенным ограничением такого анализа является недостаточная представленность в базе GenBank полноразмерных геномов ВГВ субгенотипа D4. В связи с этим мы сочли возможным провести филогенетический анализ изолятов по S-региону (рис. 3).

Рис. 3. Филогенетическое дерево исследованных изолятов ВГВ, выделенных от пациентов с ВГВ D4, проживающих на территории РФ, в сравнении с представленными в международной базе данных GenBank нуклеотидными последовательностями ВГВ субгенотипа D4 и рекомбинантов D/E на базе S-региона.

Референсные последовательности обозначены кодами GenBank с указанием субгенотипа и региона происхождения изолята. Ромбами обозначены образцы, исследованные в настоящей работе. Даны значения bootstrap ≥50%.

В связи с тем что изоляты данной работы при анализе по S-региону кластеризовались с рекомбинантными изолятами, был проведен анализ на рекомбинацию. При анализе нуклеотидных последовательностей полных геномов ВГВ на рекомбинации с использованием инструмента генотипирования NCBI все 3 изолята были определены как рекомбинантные D/E. Однако при анализе с использованием RDP4 рекомбинации не были выявлены, что в связи с более строгими ограничениями данной программы к оценке рекомбинационных событий представляется более верным. По всей видимости, это связано с тем, что сходный фрагмент генома с ВГВ генотипа E наблюдается практически у всех полных нуклеотидных последовательностей ВГВ генотипа D, и в этом регионе генома ВГВ генотипов D и E группируются совместно. Таким образом, мы не можем отнести наши изоляты к рекомбинантам.

Ни один из пациентов, от которых были получены изоляты ВГВ, не подвергался противовирусной терапии ВГВ. Однако один из пациентов принимал антиретровирусную терапию в связи с инфекцией ВИЧ, причем терапия была вирусологически неэффективна в связи с низкой приверженностью пациента. Некоторые составляющие элементы антиретровирусной терапии, применяемой у ВИЧ-инфицированных пациентов, могут стать причиной повышенной устойчивости к лекарственным препаратам не только ВИЧ, но и ВГВ, что особенно актуально при наличии скрытого HBsAg-негативного ВГВ, не идентифицируемого стандартными методами. При анализе нуклеотидных последовательностей участка гена Pol генома ВГВ, ответственного за развитие лекарственной устойчивости вируса, только у ВИЧ-инфицированного пациента с HBsAg-негативным скрытым ВГВ мы выявили мутации, определяющие развитие фармакорезистентности к терапии нуклеот(з)идных аналогов — замещение аминокислот L80V и M204I. Мутации M204V и M204I являются наиболее частыми мутациями резистентности к ламивудину. Одной этой мутации достаточно, чтобы привести к фармакорезистентности, но часто она связана с компенсаторными мутациями, в том числе выявленной нами rtL80V/I, восстанавливающей функции вирусной полимеразы почти до уровней дикого типа. В присутствии мутаций, связанных с резистентностью к ламивудину, развивается устойчивость к группе D-циклопентанте, то есть к энтекавиру. Таким образом, изолят MN365240 устойчив к ламивудину, телбивудину и частично устойчив к энтекавиру.

В анализируемом регионе гена Pol всех 3 изолятов показана высокая частота естественных полиморфных вариантов. Отметим, что максимальное количество мутаций как участка обратной транскриптазы (9 мутаций), так и гена S (4 мутации) также выявили у ВИЧ-инфицированного пациента с HBsAg-негативным ВГВ. На участке обратной транскриптазы у всех трех изолятов представлены мутации Y135S, Q149K, R153W, F221Y, у пациентов с ОВГВ и скрытым ВГВ представлена также мутация A97T. На участке гена S во всех изолятах выявлены мутации T127P, L213T, а при ОВГВ и скрытом ВГВ — дополнительно мутация L88Q.

Область Precore/Core кодирует HBeAg, а мутации, влияющие на экспрессию HBeAg, являются клинически значимыми. При анализе региона Precore/Core у всех трех изолятов обнаружили мутации Precore A1846T, C1858T и мутации Core E40D, N74T, N87S, I97F, D153., R154. Такие мутации, как выявленная нами I97F/L, ингибируют образование нуклеокапсида ядра, а также способствуют прогрессированию заболевания, уклоняясь от врожденного иммунитета хозяина. Выявленная у всех изолятов A1846T в Precore области ассоциирована с развитием ГЦК, а также ранее была описана как высоко распространенная в пределах субгенотипа D4 [17].

В Х-регионе у всех 3 изолятов выявлены мутации V5L и P38S, связанные с тяжестью заболевания печени, ГЦК и циррозом. Так, мутация V5L впервые была описана в работе H. Kim и соавт., где показана ассоциация данной мутации с ГЦК у пациентов с ВГВ генотипа С [18].

Особый интерес в анамнезе пациентов представляет их общее происхождение из Республики Дагестан, а также проживание или регулярные визиты в указанный регион.

Данные о распространенности ВГВ в Северо-Кавказском регионе в целом и в Дагестане в частности крайне ограничено представлены в научной литературе. Так, показано, что в Республике Дагестан в 2004—2008 гг. из всех вирусных гепатитов доля ОВГВ у лиц 18—29 лет была наибольшей, пик обращаемости мужчин в медицинские учреждения по поводу ОВГВ приходился на 26 лет, при этом хронический ВГВ в 33% случаев регистрировался в возрасте 18—29 лет, т.е. трудоспособном детородном возрасте [19], что не противоречит информации о наших пациентах, возраст которых на момент выявления ВГВ 23—33 года, причем больному ОВГВ 28 лет. Наиболее неблагополучной группой по обращаемости с ХВГВ является мужское городское население, показатель обращаемости в 4 раза больше, чем у сельского населения. Наиболее высокая заболеваемость отмечена в Махачкале, удельный вес — 40% от общего количества случаев (в 2014 г. — 42%) [20]. Еще одним фактором риска большей обращаемости населения по поводу вирусных гепатитов служит приморское расположение городов, а обследованные нами пациенты проживали/посещали именно приморские города — Махачкалу, Каспийск, Дербент.

На диспансерном учете по поводу ХВГВ в Республике Дагестан на 1.01.16 состояло 1858 больных, в том числе 86 детей [20]. Необходимо отметить, что сравнительно низкая выявляемость ВГВ в Республике Дагестан может быть связана как с методами диагностики (только HBsAg), так и с низкой информированностью, а значит и обращаемостью, населения в медицинские учреждения.

Интересно отметить, что среди выявленных в 2016 г. 15 больных ОВГВ все пациенты были взрослыми, причем все вакцинированы против ВГВ по возрасту, полный курс иммунизации получили 5 больных [20].

ВГВ субгенотипа D4 распространен в Папуа Новой Гвинее, в этнической микронезийской общине Соломоновых островов, Сомали, на Карибских островах Гаити и Мартинике, среди аборигенов Австралии, в Бразилии. Известно о встречаемости ВГВ D4 у коренного населения Арктики в Канаде [17], а также о его высокой распространенности (59%) в Галисии (Испания) [21]. В литературе представлены случаи выявления завозных изолятов ВГВ D4 в Бельгии, Англии, Беларуси [22—24]. Однако возникновение ВГВ D4 в иных географических ареалах исключительно за счет случайных завозов было опровергнуто в 2014 г., когда в Индии в штате Трипура у 19% больных ХВГВ обнаружили кластер уникальных изолятов D4, отличающихся от африканских и австралийских вариантов и циркулирующих, по всей видимости, на ограниченной территории [25].

Кластеризация выявленных нами изолятов в одной ветви филогенетического дерева, а также обнаружение ряда полиморфных вариантов и клинически значимых мутаций в нуклеотидных последовательностях разных генов всех 3 изолятов предполагают независимое однократное внедрение субгенотипа D4 из Африки в РФ.

Известно, что главную роль в кластеризации играет не столько географическая общность, сколько пути передачи инфекции, особенно когда речь идет о распространении редкого геноварианта вируса после однократного внедрения. Общий для пациентов регион проживания/происхождения подтверждает это, однако все 3 пациента отрицают свою принадлежность к таким группам риска, как потребители инъекционных наркотических веществ и мужчины, практикующие секс с мужчинами, отрицают рискованное сексуальное поведение, пользование услугами работниц сексуальной индустрии.

Таким образом, несмотря на очевидность завоза и последующего распространения ВГВ субгенотипа D4, путь инфицирования остается неизвестным, как и встречаемость этого геноварианта в регионе.

Поскольку молекулярно-генетические данные о ВГВ в Республике Дагестан практически не представлены, из методов диагностики ВГВ используется преимущественно ИФА, а характерная для ВГВ D4 низкая вирусная нагрузка по сравнению с субгенотипами D1—D3 [25] ограничивает возможность использования коммерческих наборов для выявления вируса методом ПЦР, представляется очевидной необходимость дальнейшего внимательного исследования генотипической структуры ВГВ в Республике Дагестан.

Интересно, что при анализе научной литературы мы обнаружили в зарубежных журналах упоминание о встречаемости в России ВГВ редкого субгенотипа D4 [26] со ссылкой на работу T. Tallo и соавт. [27]. По всей видимости, имела место ошибка, так как в указанном исследовании авторы описывали характерные для РФ субгенотипы D1, D2, D3, а при филогенетическом анализе и при сравнении аминокислотных остатков продуктов четырех ОРС ВГВ субгенотипов D1—D5 использовали полногеномные последовательности ВГВ из базы данных GeneBank, в том числе ВГВ D4 — AB033559, AB048702, AB048703.

Таким образом, мы сообщаем о первых случаях выявления ВГВ D4 в Российской Федерации.

Заключение

Впервые в Российской Федерации были выявлены изоляты ВГВ субгенотипа D4. Происхождение всех 3 пациентов с вышеуказанными изолятами из одного географического региона, филогенетическая близость нуклеотидных последовательностей полных геномов вирусов и ряд одинаковых мутаций и полиморфных вариантов в разных генах во всех 3 изолятах свидетельствуют о независимом однократном завозе вируса с последующим распространением. Пути распространения, а также частота встречаемости ВГВ D4 в Республике Дагестан остаются неизвестными и нуждаются в дальнейшем исследовании.

Финансирование. Работа не имела спонсорской поддержки.

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.