Введение

Инфекции, вызванные Acinetobacter baumannii, представляют одну из серьезных проблем медицины, обусловленную способностью этих бактерий быстро приобретать устойчивость к антимикробным препаратам. Увеличение частоты выделения A. baumannii с фенотипом множественной резистентности (multidrug resistance, MDR) и фенотипом экстремальной резистентности (extreme drug resistance, XDR) отмечено во всем мире. Карбапенемы долгое время были препаратами выбора для лечения инфекций, вызванных MDR A. baumannii. Однако за последнее десятилетие во многих странах мира в этиологии инфекций увеличилась доля карбапенем-резистентных A. baumannii. Согласно данным (2012—2016 гг.) Европейской сети по контролю над устойчивостью к антимикробным препаратам (EARS-Net), уровень резистентности к карбапенемам у Acinetobacter spp. в Греции, Хорватии и Румынии достигал 80% и более, а в Португалии, Венгрии, Испании, Польше и Болгарии — от 50 до 80% [1]. По данным российского исследования МАРАФОН, доля карбапенем-нечувствительных A. baumannii за 7 лет увеличилась на 36—66% [2].

A. baumannii относятся к значимым возбудителям инфекций и у гематологических больных. В России доля A. baumannii, выделенных из крови больных опухолями системы крови, в разные периоды исследований составляла 3—4% [3—5]. В работах, проведенных в Китае и Турции, было показано, что частота выделения A. baumannii из крови больных в гематологии была 2,9 и 6% соответственно [6, 7]. Среди A. baumannii, выделенных из крови этой когорты больных, доля карбапенем-нечувствительных составляла 66—74% [5, 8]. Бактерии A. baumannii обладают несколькими механизмами устойчивости к карбапенемам. Наиболее распространенным из известных механизмов резистентности к карбапенемам является продукция приобретенных карбапенем-гидролизующих β-лактамаз класса D (OXA-карбапенемазы) и класса B (металло-β-лактамазы, MBL). Среди приобретенных OXA-карбапенемаз выделяют три группы наиболее распространенных ферментов: OXA-23-подобные, OXA-24/40-подобные и OXA-58-подобные. Плазмидная локализация генов этих групп ферментов способствует быстрому распространению устойчивости к карбапенемам среди A. baumannii [9].

Наряду с горизонтальной передачей генов резистентности немаловажную роль играет и распространение успешных клонов A. baumannii. Молекулярно-эпидемиологические исследования, проведенные в разных странах, показали клональность нечувствительных к карбапенемам A. baumannii. В 80—90-х годах XX века увеличилось количество сообщений о вспышках инфекций, вызванных A. baumannii. Одновременно с этим было отмечено, что изоляты, выделенные во время вспышек, часто обладали устойчивостью ко многим противомикробным препаратам. L. Dijkshoorn и соавт. [10] провели анализ A. baumannii, выделенных в стационарах разных стран Европы, с помощью нового для того времени метода молекулярно-генетического типирования — определения полиморфизма длин амплифицированных фрагментов (amplified fragment length polymorphism, AFLP). На основании данных, полученных исследователями, большинство изолятов A. baumannii было отнесено к двум клональным группам (линиям) — I и II [10]. Позднее H. van Dessel и соавт. [11] также было проведено AFLP-типирование изолятов A. baumannii, выделенных в стационарах разных европейских стран. Большинство исследуемых изолятов A. baumannii, выделенных во время вспышек инфекций, принадлежали к ранее определенным группам (клонам) I и II, а часть изолятов относилась к новому клону III. Эти клоны были названы Европейскими клонами I—III [11]. На основании поступающих данных о выделении A. baumannii, относящихся к Европейским клонам I—III, не только в странах Европы, но и в других частях мира, L. Diancourt и соавт. [12] было предложено переименовать Европейские клоны в международные клоны I—III (International Clone, IC I—III) [12]. Для изолятов A. baumannii, входящих в IC I—III, характерными были как выделение их во время госпитальных вспышек инфекций, так и более высокий процент устойчивости ко многим антимикробным препаратам. По данным литературы, MDR A. baumannii принадлежат к ограниченному количеству клональных линий, как правило, к IC I—III [12, 13]. Поскольку AFLP-типирование A. baumannii является достаточно трудоемким и длительным процессом, J. Turton и соавт. [14] было предложено для генотипирования A. baumannii использовать две мультиплексные ПЦР, благодаря которым можно определить принадлежность A. baumannii к IC I—III [14]. На сегодня, кроме IC I—III, выделяют несколько других клональных линий, представители которых были выделены от госпитальных больных [13—15]. Вполне очевидно, что отслеживание эволюции и клонального состава популяции A. baumannii может использоваться в реализации стратегии контроля над распространением этих микроорганизмов в стационаре.

Цель исследования — изучение клонального состава A. baumannii, выделенных из крови больных опухолями системы крови.

Материал и методы

Источники бактериальных изолятов

Материалом исследования были изоляты A. baumannii (n=96), выделенные из крови больных, находившихся на стационарном лечении в гематологических отделениях 7 лечебных учреждений 6 городов России с 2003 по 2017 г. В исследование включали первый изолят, выделенный из крови больного. Все изоляты были доставлены в лабораторию ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, где были проведены окончательная идентификация микроорганизмов, определение чувствительности к антимикробным препаратам и детекция генов резистентности к карбапенемным антибиотикам.

Видовая идентификация и хранение

Идентификацию изолятов до вида проводили методом матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS) на анализаторе Microflex LT (Bruker Daltonics, Германия). Для идентификации полученных изолятов до вида брали изолированные колонии бактерий. Ионизацию бактериальных белков осуществляли с помощью специального реагента — матрицы (α-циано-4-гидроксикоричная кислота и раствор, содержащий 50% ацетонитрила и 2,5% трифторуксусной кислоты). Идентификацию проводили в автоматическом режиме с использованием программы MALDI Biotyper Real Time Classification, версия 3.1 (Bruker Daltonics, Германия). В качестве критерия надежной видовой идентификации использовали рекомендуемые значения коэффициента совпадения (Score) от 2,0 и выше. Видовую идентификацию изолятов A. baumannii дополнительно подтверждали с помощью детекции генов видоспецифических β-лактамаз группы OXA-51 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени с использованием коммерческого набора АмплиСенс MDR Ab-OXA-FL (ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия), предназначенного для исследовательских целей. Изоляты хранили при температуре –70°C в триптиказо-соевом бульоне с добавлением 20% глицерина.

Определение чувствительности к антибактериальным препаратам

Чувствительность к антимикробным препаратам исследовали методом последовательных микроразведений в бульоне в соответствии с рекомендациями CLSI, 2018 [16]. Категории чувствительности A. baumannii к имипенему и меропенему определяли на основании пограничных значений минимальных подавляющих концентраций (МПК), установленных CLSI (чувствительные ≤2 мкг/мл, умеренно-резистентные 4 мкг/мл, резистентные ≥8 мкг/мл). Термин «нечувствительные» изоляты объединял умеренно-резистентные и резистентные к антибиотикам микроорганизмы. Статистическую обработку и анализ результатов определения чувствительности проводили с помощью программы WHONET 5.6. Для внутреннего контроля качества определения чувствительности использовали референтные штаммы Escherichia coli ATCC 25922 и Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

Выявление генов карбапенемаз

Выделение ДНК проводили с помощью коммерческого набора ГК-Экспресс (ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия).

Наличие у A.baumannii наиболее распространенных генов карбапенемаз класса D (групп OXA-23, OXA-24/40 и OXA-58) и класса B (групп IMP, VIM и NDM) определяли методом ПЦР в режиме реального времени с использованием коммерческих наборов АмплиСенс MDR Ab-OXA-FL и АмплиСенс MDR MBL-FL (ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия), предназначенных для исследовательских целей. Амплификацию проводили в термоциклере CFX96 Touch (BioRad, США).

Генотипирование с помощью ПЦР

Принадлежность изолятов A. baumannii к международным клональным линиям определяли с помощью двух мультиплексных ПЦР, разработанных для селективной амплификации аллелей генов ompA, csuE и bla_{OXA-51-подобные}, с использованием специфических праймеров, представленных J. Turton и соавт. [14]. В зависимости от полученной комбинации амплифицированных генов изоляты были отнесены к одной из 14 групп (клональных линий), согласно обобщенной классификации, представленной N. Karah и соавт. [13]. В соответствии с этой классификацией к группе 1 (G1) принадлежал IC II, к группе 2 (G2) — IC I, а к группе 3 (G3) — IC III, к группам G4-G12 — другие клональные линии.

Результаты и обсуждение

Исследовано 96 изолятов A. baumannii, выделенных из крови больных опухолями системы крови, из них 77 (80,2%) были нечувствительными к меропенему или имипенему (резистентными были 76 изолятов, умеренно-резистентными — 1). Нечувствительными к меропенему были 75 (78,1%) из 96 изолятов, к имипенему — 72 (75%) из 96.

Гены приобретенных карбапенемаз были обнаружены у 61 (79,2%) из 77 карбапенем-нечувствительных изолятов A. baumannii. Все детектируемые гены приобретенных карбапенемаз кодировали OXA-карбапенемазы и принадлежали к трем группам, из них лидирующими были гены bla_{OXA-24/40-подобные} (45,9%, n=28/61) и гены bla_{OXA-23-подобные} (45,9%, n=28/61), затем следовали bla_{OXA-58-подобные} (10%, n=4/61), у одного изолята были обнаружены одновременно гены bla_{OXA-24/40-подобные} и bla_{OXA-23-подобные}. Гены металло-β-лактамаз не были выявлены.

В табл. 1 представлены результаты генотипирования A. baumannii с помощью двух мультиплексных ПЦР. Исследуемые 96 изолятов были отнесены к 8 клональным группам. У 3 (3,1%) изолятов A. baumannii не была определена принадлежность к исследуемым группам.

Таблица 1. Генотипирование A. baumannii, выделенных из крови, с помощью двух мультиплексных ПЦР

Группа	Изоляты A. baumannii, n (%)		Всего, n=96, абс. (%)
	чувствительные к карбапенемам, n=19, абс. (%)	нечувствительные* к карбапенемам, n=77, абс. (%)
G1 (IC II)	4 (21,1)	54 (70,1)	58 (60,4)
G2 (IC I)	1 (5,3)	1 (1,3)	2 (2,1)
G4	0	5 (6,5)	5 (5,2)
G5	1 (5,3)	0	1 (1,0)
G7	1 (5,3)	1 (1,3)	2 (2,1)
G8	0	7 (9,1)	7 (7,3)
G9	6 (31,6)	3 (3,9)	9 (9,4)
G12	3 (15,8)	6 (7,8)	9 (9,4)
Не определена	3 (15,8)	0	3 (3,1)

Примечание. * — умеренно-резистентные и резистентные.

Большинство (60,4%; n=58) изолятов вошли в группу G1 (IC II) и были представлены как карбапенем-нечувствительными (70,1%), так и карбапенем-чувствительными (21,1%) изолятами. В группы G4 и G8 вошли только карбапенем-нечувствительные A. baumannii, в то время как в группу G5 — только чувствительные изоляты. Все остальные изоляты A. baumannii, у которых не была установлена принадлежность к исследуемым группам, были карбапенем-чувствительными.

Карбапенем-нечувствительные изоляты A. baumannii с продукцией приобретенных OXA-карбапенемаз относились к 7 группам, среди которых доминировали (62,3%) представители G1 (IC II) (табл. 2). К группе G1 (IC II) принадлежали более ¹/₂ (64,3%) изолятов с продукцией OXA-24/40-подобных ферментов и 67,9% изолятов с продукцией OXA-23-подобных ферментов. Изоляты A. baumannii, продуцирующие ферменты группы OXA-58, не принадлежали к международному клону G1 (IC II) (см. табл. 2).

Таблица 2. Генотипирование карбапенем-нечувствительных A. baumannii, содержащих гены приобретенных OXA-карбапенемаз (n=61), с помощью двух мультиплексных ПЦР

Группа	A. baumannii, содержащие гены приобретенных OXA-карбапенемаз, n (%)
	blaOXA-24/40-подобные (n=28)	blaOXA-23-подобные (n=28)	blaOXA-58-подобные (n=4)	blaOXA-24/40-подобные + blaOXA-23-подобные (n=10)	Всего (n=61)
G1 (IC II)	18 (64,3)	19 (67,9)	0	1	38 (62,3)
G2 (IC I)	0	1 (3,6)	0	0	1 (1,6)
G4	2 (7,1)	0	3 (75)	0	5 (8,2)
G7	1 (3,6)	0	0	0	1 (1,6)
G8	7 (25)	0	0	0	7 (11,5)
G9	0	3 (10,7)	0	0	3 (4,9)
G12	0	5 (17,9)	1 (25)	0	6 (9,8)

На рис. 1 отражена динамика детекции A. baumannii, содержащих разные гены приобретенных OXA-карбапенемаз, в течение двух временных периодов исследования. В 2003—2010 гг. основными генами OXA-карбапенемаз были bla_{OXA-24/40-подобные} (50%), а в 2011—2017 гг. — bla_{OXA-23-подобные} (53,7%). Изоляты A. baumannii, содержащие гены bla_{OXA-58-подобные}, были выделены только в ранний период исследования (2003—2010 гг.), а изолят, обладающий сочетанием генов bla_{OXA-23-подобные} и bla_{OXA-24/40-подобные}, — в более поздний период (2011—2017 гг.).

Рис. 1. Распределение генов приобретенных OXA-карбапенемаз у A. baumannii, выделенных в разные временные периоды исследования.

Интерес вызывал тот факт, что клональный состав A. baumannii, несущих гены OXA-карбапенемаз, менялся в течение периода исследования. Так, в первый временной период (2003—2010 гг.) не было выявлено ни одного изолята A. baumannii с продукцией OXA-23-подобных карбапенемаз, относящихся к G1 (IC II), в то время как во второй период (2011—2017 гг.) подавляющее большинство изолятов (86,4%), содержащих гены bla_{OXA-23-подобные}, принадлежало именно к G1 (IC II), а представители G12, доминирующего клона в 2003—2010 гг. (83,3%), выявлены не были (рис. 2, а). Клональный состав A. baumannii, несущих гены bla_{OXA-24/40-подобные}, практически не изменился, и большинство изолятов как в первый временной период (2003—2010 гг.), так и во второй (2011—2017 гг.) принадлежали к G1 (IC II) (соответственно 61,1 и 70%) (см. рис. 2, б).

Рис. 2. Распределение исследуемых клональных групп среди A.baumannii, содержащих гены bla_{OXA-23-подобные} (а) и bla_{OXA-24/40-подобные} (б), в разные временные периоды.

В представленном нами исследовании большинство (80,2%) изолятов A. baumannii было нечувствительным к карбапенемам. По результатам других исследований, посвященных изучению A. baumannii, выделенных из крови больных гемобластозами, доля карбапенем-нечувствительных изолятов также была высока и варьировала от 36,1% [7] до 100% [6]. Отличия в показателях устойчивости к карбапенемам были выявлены и среди изолятов A. baumannii, выделенных в многопрофильных стационарах. Так, в Испании доля нечувствительных к карбапенемам изолятов A. baumannii, выделенных из крови, составила 84,75% [17], а в Италии — 54% [18].

Устойчивость к карбапенемам A. baumannii в большинстве случаев обусловлена наличием генов приобретенных карбапенемаз. Среди карбапенем-нечувствительных A. baumannii, выделенных в данном исследовании, доля изолятов, содержащих гены OXA-карбапенемаз, составила 79,2%. Основными генами OXA-карбапенемаз были bla_{OXA-24/40-подобные} (45,9%) и bla_{OXA-23-подобные} (45,9%). В других российских исследованиях среди карбапенем-нечувствительных изолятов преобладали гены группы bla_OXA-24/40. Так, в исследовании МАРАФОН доля A. baumannii с продукцией OXA-24/40-подобных карбапенемаз составила 81,1% в 2011—2012 гг. и 62,5% в 2013—2014 гг. [2, 19]. Среди карбапенем-нечувствительных изолятов A. baumannii, выделенных от пациентов в отделениях хирургии, реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) в трех стационарах Москвы, также преобладали (80%) изоляты, содержащие гены группы bla_OXA-24/40 [20].

В настоящем исследовании были выделены A. baumannii, относящиеся к 8 клональным линиям, распространенным в мире. Большинство (60,4%) изолятов относилось к международному клону G1 (ICII), что сопоставимо с результатами, полученными E. Dahdouh и соавт. [17] при изучении A. baumannii, выделенных из крови, где доля изолятов, принадлежащих к клону G1 (ICII), составила 71,2%. Хотелось бы отметить, что в Греции до 2004 г. A. baumannii, выделенные из клинически значимых образцов, относились в основном к G2 (ICI), в то время как уже в 2005—2009 гг. подавляющее большинство (77,8%) изолятов принадлежало к G1 (ICII), и из них 79,4% A. baumannii, содержали гены bla_{OXA-23-подобные} [21]. Такой факт демонстрирует, что A. baumannii, принадлежащие к G1 (IC II) и содержащие гены bla_{OXA-23-подобные}, обладают лучшими механизмами адаптации и способностью к распространению в стационарах в сравнении с A. baumannii, принадлежащих к другим клональным линиям.

В ходе нашего исследования была отмечена тенденция в увеличении доли A. baumannii, несущих гены группы bla_OXA-23. Так, в 2003—2010 гг. только 30% карбапенем-нечувствительных изолятов содержали гены bla_{OXA-23-подобные}, в то время как в 2011—2017 гг. их доля возросла до 53,7%. Можно полагать, что увеличение частоты выделения A. baumannii, несущих гены bla_{OXA-23-подобные}, произошло за счет распространения изолятов, принадлежащих к клональной линии G1 (ICII). До 2010 гг. большинство изолятов A. baumannii с продукцией OXA-23-подобных ферментов (83,3%) принадлежало к G12 и ни один из них — к G1 (ICII). В период 2011—2017 гг. произошла кардинальная смена в клональном составе A. baumannii, выделенных из крови. Доля OXA-23-продуцирующих A. baumannii, принадлежащих к международному клону G1 (ICII), достигла 86,4%, в то время как представители ранее доминирующей группы G12 обнаружены не были. Исследователи из Италии отметили прогрессивную смену изолятов, содержащих гены bla_{OXA-58-подобные}, на OXA-23-продуцирующие изоляты A. baumannii, принадлежащие к международному клону G1 (ICII), которые в 2007 г. стали причиной многочисленных вспышек инфекций в ОРИТ большинства госпиталей в Центральной Италии [18].

Рядом исследователей было отмечено, что в большинстве стран мира A. baumannii, содержащие гены bla_{OXA-23-подобные}, принадлежали к клональным линиям G1 (ICII) и G2 (ICI) [15, 22]. Также было отмечено, что изоляты A. baumannii группы G1 (ICII) обладают лучшей способностью к адгезии и формированию биопленок в сравнении с A. baumannii, относящихся к другим клональным линиям [22], имеют более высокие показатели устойчивости к антимикробным препаратам [21]. Способность к формированию биопленок и приобретению детерминант устойчивости у A. baumannii клональной линии G1 (ICII) вполне определенно способствует распространению и персистенции A. baumannii в условиях стационара [23].

Заключение

Большинство (80,2%) изолятов A. baumannii, выделенных из крови больных опухолями системы крови, были нечувствительными к карбапенемам. Гены приобретенных OXA-карбапенемаз обнаружены у 79,2% таких изолятов. A. baumannii, выделенные из крови, принадлежали к 8 клональным линиям, распространенным в мире. Было отмечено преобладание изолятов A. baumannii, принадлежащих к международному клону G1 (ICII) (60,4%). В ходе исследования выявлено увеличение доли A. baumannii, содержащих гены bla_{OXA-23-подобные}, что могло быть следствием распространения изолятов, принадлежащих к международному клону G1 (ICII). За 8 лет исследования (с 2011 по 2017 г.) доля OXA-23-продуцирующих A. baumannii, принадлежащих к клону G1 (ICII), возросла до 86,4% при полном отсутствии в 2003—2010 гг. Полученные результаты подтверждают глобальные тенденции распространения успешной клональной линии G1 (IC II) в стационарах с вытеснением других клональных линий.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.

Результаты исследования были представлены на Международной конференции European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID) в 2019 г. в виде стендового доклада P0935.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.