Введение

Холера относится к особо опасным инфекциям, широко распространенным во многих странах Азии, Африки и Латинской Америки, на территории которых сформировались эндемичные очаги. Локальные вспышки и единичные случаи холеры в Российской Федерации (РФ) связаны с завозом из этих стран токсигенных штаммов возбудителя с последующим накоплением его в воде поверхностных водоемов при благоприятных климатических и экологических условиях [1, 2]. Возбудителем семи известных пандемий холеры является Vibrio cholerae двух биоваров — классического и Эль Тор. Их геномы в каждом случае представлены двумя кольцевыми хромосомами — большой и малой [3]. В геномах, помимо коровых генов, расположены различные мобильные элементы, в состав которых входят гены вирулентности, эпидемичности и адаптации к меняющимся условиям окружающей среды, а также гены устойчивости к антибиотикам. Выраженные различия между холерными вибрионами классического и Эль Тор биоваров, прежде всего, связаны с особенностями структуры и функции генов tcpA-F и ctxAB, кодирующих основные факторы вирулентности — токсин-корегулируемые пили, или TCP (от toxin-coregulated pilus), и холерный токсин, или CT (от cholera toxin) [4, 5]. За счет TCP холерные вибрионы прикрепляются к микроворсинкам тонкого кишечника и колонизируют его. CT, продуцируемый размножившимися вибрионами, вызывает развитие основного клинического симптома — профузную диарею. Гены tcpA-F и ctxAB локализованы в геноме двух мобильных элементов — острове патогенности 1, или VPI-1 (от Vibrio pathogenicity island), и профаге CTXφ (от cholera toxin) соответственно [6, 7].

V. cholerae классического биовара был возбудителем первых шести пандемий азиатской холеры (1817—1923 гг.), тогда как за текущую, 7-ю пандемию, начавшуюся в 1961 г., были ответственны типичные токсигенные штаммы V. cholerae биовара Эль Тор. За прошедшие с тех пор почти 60 лет геномы этих штаммов претерпели различные изменения, наиболее значимые из которых затронули гены патогенности [8, 9]. В 1991 г. были выделены генетически измененные штаммы (или геноварианты) возбудителя, имеющие существенные генетические отличия от типичных штаммов [10, 11]. Так, в геноме профага CTXφ геновариантов был обнаружен кодирующий B-субъединицу CT аллель гена ctxB холерных вибрионов классического биовара, а именно ctxB1. Этот аллель отличается от аллеля ctxB3 типичных штаммов наличием двух однонуклеотидных замен — тимина на цитозин (T/C) в позициях 115 и 203. У современных штаммов возбудителя биосинтез ключевых факторов патогенности TCP и CT кодируют гены, имеющие дополнительные изменения в нуклеотидной последовательности по сравнению с таковой геновариантов, появившихся в начальный период их формирования (1991—2000 гг.). Различия связаны с присутствием в опероне ctxAB другого аллеля гена ctxB — ctxB7, для которого характерно наличие дополнительной третьей замены C на A в позиции 58 [8—10]. Кроме того, изменения затронули ген tcpA, кодирующий основную субъединицу пилей TCP, в котором появилась однонуклеотидная несинонимичная замена A на G в позиции 266. Этот аллель гена tcpA обозначен как tcpA^cirs [4, 12, 13].

Координированную регуляцию активности генов ctxAB и tcpA-F осуществляет через регуляторный каскад глобальная контролирующая система, основными компонентами которой являются регуляторные гены toxR, toxS, aphA из коровой области хромосомы, а также гены tcpP, tcpH и toxT, входящие в состав ОП VPI-1 [14, 15]. Центральная роль в активации транскрипции структурных генов вирулентности принадлежит цитоплазматическому белку ToxT, являющемуся транскрипционным регулятором. В свою очередь транскрипция гена toxT активируется трансмембранным белком ToxR, кодируемым геном toxR, а также дополнительными регуляторными белками ToxS, TcpP и TcpH [14]. Таким образом, функционирование контролирующей системы оределяется несколькими регуляторными генами, последовательно активирующими друг друга (рис. 1, а).

Рис. 1. Схема функционирования генной сети вирулентности V. cholerae O1 биовара Эль Тор по [15] с модификациями.

а — регуляторная сеть, контролирующая экспрессию генов вирулентности; ОМ — внешняя мембрана бактериальной клетки, IM — внутренняя мембрана бактериальной клетки, стрелками обозначены взаимодействия между генами, + и — обозначают позитивную и негативную регуляцию соответственно; б — регуляция экспрессии генов ompU и ompT, кодирующих белки внешней мембраны OmpU и OmpT, белком ToxR.

Благодаря функциональной значимости генов ctxA и tcpA, абсолютно необходимых для развития инфекционного процесса, их принято использовать в качестве генетических маркеров эпидемически опасных штаммов, выделяемых, как правило, от больных холерой или из окружающей человека среды во время эпидемии [3]. В этих случаях профилактические и противоэпидемические мероприятия проводят в полном объеме. При мониторинге окружающей среды в РФ в ряде случаев из водоемов были выделены холерные вибрионы биовара Эль Тор ctxA⁺tcpA⁺, однако случаи заболевания холерой отсутствовали. Причина такой авирулентности изолятов, сохраняющих полноценные гены вирулентности, оставалась неисследованной, хотя этот вопрос требовал решения для полного понимания механизмов популяционной изменчивости возбудителя.

В этой работе представлены результаты сравнительного анализа структурных и регуляторных генов вирулентности различных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор ctxA⁺tcpA⁺, выделенных из воды и от больных. Изучено влияние выявленной мутации в регуляторном гене toxR у авирулентных штаммов на уровень транскрипции основных генов вирулентности.

Материал и методы

Бактериальные штаммы, условия культивирования. Использованные в работе бактериальные штаммы представлены в табл. 1. Штаммы хранились в Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб» в лиофилизированном состоянии. Бактерии культивировали в бульоне и агаре Luria—Bertani (LB) при 37 °C.

Таблица 1. Штаммы Vibrio cholerae О1 биовара Эль Тор, использованные в работе

Штамм	Место и год выделения	Источник выделения	Номера последовательностей в NCBI GenBank
М888	РФ, Астрахань, 1970	Человек	LRBH00000000*
М818	РФ, Саратов, 1970	Человек	LAHM00000000*
N16961	Бангладеш, 1975	Человек	AE003852/AE003853**
223	Украина, Нижние Серогозы, 1991	Речная вода	NDXS00000000*
М1275	РФ, Дагестан, 1993	Человек	LRAF00000000*
28	РФ, Кривой Рог, 1994	Человек	NDXN00000000*
20-а/11	Украина, Николаевская обл., 1995	Человек	PYAR00000000*
4661	Бангладеш, 2001	Неизвестен	CWPG00000000**
CIRS101	Бангладеш, Дакка, 2002	Человек	ACVW01000000**
CP1038	Зимбабве, 2003	Человек	ALDC00000000**
Р18899	РФ, Мурманск, 2006	Человек	LAKM00000000*
Л3226	РФ, Москва, 2010	Человек	JDVX00000000*
2010El-1716	Гаити, 2010	Человек	AELH01000000**
147	Украина, Ялта, 2010	Речная вода	NDXQ00000000*
89	Украина, Ялта, 2010	Речная вода	NDXR00000000*
39	Украина, Мариуполь, 2011	Сточные воды	MWRC00000000*
153	Украина, Мариуполь, 2011	Человек	MWRE00000000*
301	РФ, Таганрог, 2011	Морская вода	AJFN00000000*
76	Украина, Мариуполь, 2011	Человек	MPVL00000000*
3265/80	РФ, Москва, 2014	Человек	JRQL00000000*
Р19613(81)	РФ, Ростов-на-Дону, 2014	Речная вода	JRQM00000000*

Примечание. * — нуклеотидные последовательности геномов, секвенированные авторами; ** — нуклеотидные последовательности геномов, взятые из NCBI GenBank.

Определение белкового профиля. Электрофорез проводили по методу U. Laemmli и соавт. [16] на приборе Mighty Small II в присутствии додецилсульфата натрия в пластинах размером 8×7 см. В работе использовали 12,5% гель. Концентрирующий гель — 4%. Две петли исследуемой культуры ресуспендировали в 100 мкл дистиллированной воды, добавляли 100 мкл «буфера образца», содержащего 0,125 М трис-HCl, pH 6,8; 4% SDS; 20% глицерин; 2% 2-меркаптоэтанол; 0,03 мМ бромфеноловый синий, затем кипятили на водяной бане в течение 5—7 мин. Электрофорез проводили до вхождения образца в разделяющий гель при нагрузке тока 20 мА и далее при 40 мА. Электродный буфер (pH 8,3) содержал 0,192 М глицина; 0,025 мм трис; 0,1% SDS. Фиксацию белков осуществляли в течение 1 ч или ночи в 50% растворе ТХУ, окрашивание свежеприготовленным 0,1% раствором Кумасси R-250 в 50% ТХУ — в течение 1 ч при 37 °C. Избыток красителя из геля вымывали 7% уксусной кислотой.

Определение продукции холерного токсина проводили иммуноферментным методом GM_1-ELISA [17]. Разведения очищенного CT (Sigma chemicals,США) известной концентрации использовали для построения стандартной кривой и оценки СТ в образцах. Для постановки ELISA применяли кроличьи антитоксические антитела и антикроличий IgG, конъюгированный с пероксидазой хрена (Gibco-BRL). Эксперименты ставили в 3-кратной повторности. Для статистической обработки данных применяли программу Microsoft Excel 2010.

Определение вирулентности штаммов проводили по методу N. Dutta и M. Habbu [18]. Исследования выполняли на 12 крольчатах 7—8-дневного возраста массой 130—160 г, которых под эфирным наркозом внутрикишечно заражали 4-часовой агаровой культурой холерных вибрионов в концентрации 10⁷ КОЕ в 0,2 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Наблюдения за ними вели в течение 48 ч. Всех павших или усыпленных хлороформом животных вскрывали для оценки развития специфического инфекционного процесса. Его критериями были количество павших животных, наличие и степень выраженности холерогенного синдрома.

Выделение и очистку геномной ДНК бактерий проводили с использованием коммерческого набора Axy Prep Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit в соответствии с протоколом производителя. Клетки предварительно обрабатывали мертиолятом натрия до конечной концентрации 1:10 000 (0,01%) и прогревали при 56 °C в течение 30 мин.

Полногеномное секвенирование и SNP-анализ. Библиотеки для секвенирования готовили из 0,5—1,0 мкг геномной ДНК в соответствии с рекомендациями производителя и секвенировали на генетическом анализаторе Ion PGM (Ion Torrent). Полученные единичные чтения корректировали с использованием программного обеспечения Ion Torrent Suite Software v.5.4 и собирали de novo в контиги с помощью программы Newbler GS Assembler v 2.6. Для поочередного картирования единичных чтений полногеномной последовательности 16 секвенированных штаммов на референсную последовательность штамма V. cholerae О1 биовара Эль Тор N16961 использовали программный пакет DNASTAR Lasergene v. 11.2 (DNASTAR, Inc., США). Полногеномный SNP-анализ осуществляли при помощи программы Wombac 2.0 (https://github.com/tseemann/wombac), в результате работы которой получили SNP-матрицу путем сравнения полногеномных последовательностей каждого из 20 секвенированных нами (16) или взятых из GenBank (4) штаммов с последовательностью референсного штамма N16961 (см. табл. 1). Дендрограмму по алгоритму Maximum Parsimony на основании SNP-матрицы строили в программе BioNumerics 7.6 (hhtp://www.applied-maths.com/bionumerics).

Выделение РНК и обратная транскрипция. Культуры V. cholerae для последующего выделения тотальной РНК растили в LB-бульоне (при 37 °C с аэрацией) в течение 5 ч. РНК выделяли с помощью набора реактивов SV total RNA isolation system (Promega, США). Концентрацию и степень очистки полученных препаратов РНК определяли на спектрофотометре Biowave DNA (Biochrom Ltd, Англия). Синтез кДНК на матрице РНК осуществляли с помощью набора реагентов «Реверта» («ИнтерЛабСервис», Россия). Определение экспрессии генов проводили с использованием прибора Rotor-Gene Q 5plex (Qiagen Inc, GMBH, Германия) с праймерами и TaqMan зондами («Синтол», Россия), указанными в табл. 2. В качестве положительного стандарта использовали разведения плазмидной ДНК (от 10⁷ до 10³) с клонированным участком исследуемого гена. Нормирование полученных данных проводили относительно конститутивно экспрессирующегося гена recA методом 2^–ΔΔСТ [19]. Для оценки уровня экспрессии гена ПЦР одновременно проводили в двух повторах на трех независимо полученных образцах кДНК. Для статистической обработки данных применяли программу Microsoft Excel 2010.

Таблица 2. Последовательности олигонуклеотидных праймеров и зондов, использованных в работе

Название праймера	Нуклеотидная последовательность (5’-3’)	Ссылка
recA-RT1 recA-RT2 recA-зонд	ACGGGTAACCTCAAGCAATC TATCCAAACGAACAGAAGCG (FAM)-CCACTGGCGGTAACGCACTGA-(BHQ1)	Рассчитаны авторами
toxR-RT1 toxR-RT2 toxR-зонд	CGGAACCGTTTTGACGTATT CTCGCAATGATTTGCATGAC (FAM)-TTAACCCAAGCCATTTCGAC-(BHQ1)	[20]
toxT-RT1 toxT-RT2 toxT-зонд	TGATGATCTTGATGCTATGG GACTGATATGCAATCTGTT (FAM)-GCGTAATTGGCGTTGGGCAGAT-(BHQ1)	Рассчитаны авторами
tcpA-RT1 tcpA-RT2 tcpA-зонд ctxA-RT1 ctxA-RT2 ctxA-зонд	CGCTGAGACCACACCCATA GAAGAAGTTTGTAAAAGAAGAACACG (FAM)-AGAAAACCGGTCAAGAGGGT-(BHQ1) TGCCAAGAGGACAGAGTGAG ATCCATCATCGTGCCTAACA (FAM)-TCCCGTCTGAGTTCCTCTTGCATG-(BHQ1)	[20] Рассчитаны авторами
ctxB-RT1 ctxB-RT2 ctxB-зонд	GTAGAAGTACCAGGTAGTCAACA CGACTTTAGCTTCAGTAAGATATGC (ROX)-AGCGATTGAAAGGATGAAGGATACCCTG-(BHQ2)	» »

Результаты и обсуждение

Оценка вирулентности штаммов V. cholerae биовара Эль Тор ctxA⁺tcpA⁺, выделенных из воды. Для выяснения причин авирулентности ряда штаммов V. cholerae О1 биовара Эль Тор, выделенных из воды в межэпидемический период, в исследование было взято два таких штамма — 89 и 147, имеющих генотип вирулентных эпидемически опасных штаммов ctxA⁺tcpA⁺, но не вызывавших заболевания (см. табл. 1). На первом этапе работы для определения их вирулентности было проведено внутрикишечное заражение шести 7—8-дневных крольчат клетками этих штаммов (в дозе 10⁷ вибрионов). Оказалось, что у инфицированных крольчат не было развития холерной инфекции. У животных либо отсутствовали видимые изменения в толстом и тонком кишечнике (штамм 89), либо кишечник был растянут мутной непрозрачной жидкостью (штамм 147). Такая картина характерна только для энтеропатогенного эффекта и могла быть связана с действием дополнительных факторов патогенности, в частности гемолизина и/или растворимой гемагглютинин/протеазы, продуцируемых, как правило, всеми штаммами холерного вибриона. Напротив, у всех 6 крольчат, инфицированных для сравнения клетками двух клинических вирулентных штаммов Р18899 и 76 с тем же генотипом ctxA⁺tcpA⁺, наблюдалась резко выраженная холерогенная реакция (перерастяжение толстого кишечника прозрачной жидкостью и растяжение тонкого кишечника полупрозрачным содержимым), вызванная действием CT, что указывало на развитие типичной экспериментальной холерной инфекции. Таким образом, воспроизведение экспериментальной инфекции на модельных животных, зараженных клетками штаммов 89 и 147 в достаточно высокой дозе, ни в одном случае не приводило к развитию типичной холерной инфекции. Полученные данные позволили отнести эти изоляты к авирулентным, несмотря на присутствие в их геноме генетических маркеров вирулентных штаммов ctxA и tcpA. Возможная причина такого явления — нарушение продукции у них критических факторов вирулентности (холерного токсина и/или TCP) вследствие мутаций в их структурных и/или регуляторных генах.

Сравнительный анализ структуры генома профага CTXφ и острова патогенности VPI-1 V. cholerae О1 биовара Эль Тор с разной вирулентностью. Ранее нами при экспериментальном моделировании были выявлены структурные изменения генома вирулентных штаммов после их пребывания в водной среде, которые выражались в потере профага CTXφ с генами, кодирующими CT [21]. Такие штаммы утрачивали вирулентность. Для поиска возможных генетических изменений у штаммов 89 и 147 мы провели анализ нуклеотидных последовательностей участков их геномов, обязательных для проявления вирулентности, — профага CTXφ, несущего структурные гены CT (оперон ctxAB), а также острова патогенности VPI-1 со структурными генами tcpA-F, кодирующими TCP, и тремя основными регуляторными генами toxT, tcpP и tcpH, контролирующими через регуляторный каскад экспрессию ctxAB и tcpA-F. Оказалось, что исследуемые штаммы содержали в хромосоме интактные геномы профага CTXφ со всем набором генов основных (CT) и дополнительных (Ace, Zot) токсинов, а также ОП VPI-1 и не отличались по этим свойствам от референсного вирулентного штамма N16961 (рис. 2, а—в). При сравнении нуклеотидных последовательностей геномов этих авирулентных штаммов с таковыми других вирулентных изолятов V. cholerae О1 биовара Эль Тор 28, Р18899 и 76, изолированных от больных холерой в 1994, 2006 и 2011 гг. соответственно, было установлено, что штаммы 89 и 147 относятся к геновариантам возбудителя, возникшим в начальный период их формирования. Геном их профага CTXφ содержал в опероне ctxAB аллель ctxB1 холерных вибрионов классического биовара, что характерно для вирулентных генетически измененных штаммов 28 и Р18899, возникших в начале 90-х годов прошлого столетия (см. рис. 2, б—д). В то же время нуклеотидная последовательность их гена tcpA, кодирующего основную субъединицу ТСР, была идентична таковой типичных штаммов холерных вибрионов Эль Тор (см. рис. 2, а—в). Вместе с тем по этим свойствам авирулентные штаммы 89 и 147 отличались от вирулентного изолята 76, содержащего другие аллельные варианты генов ctxB и tcpA, а именно ctxB7 и tcpA^CIRS, появившиеся у возбудителя на более поздних этапах эволюции (см. рис. 2, б, в, е). Анализ нуклеотидной последовательности регуляторных генов toxT, tcpP и tcpH из ОП VPI-1, контролирующих активность ключевых структурных генов вирулентности ctxAB и tcpA-F, показал идентичность их структуры у авирулентных и вирулентных штаммов. Таким образом, предположение о том, что неспособность изучаемых штаммов вызывать развитие холерной инфекции могла быть следствием изменений структуры мобильных элементов, несущих ключевые гены вирулентности, присущих как типичным штаммам, так и геновариантам возбудителя, не подтвердилось.

Рис. 2. Схема структуры генома профага СТХφ, острова патогенности VPI-I и глобального регуляторного гена toxR авирулентных и вирулентных штаммов V. cholerae O1 биовара Эль Тор с генотипом ctxA⁺tcpA⁺.

ctxAB и tcpA-F — структурные ключевые гены вирулентности, кодирующие CT и TCP соответственно; ctxB1, ctxB3, ctxB7 — аллели гена ctxB, кодирующего B-субъединицу CT; tcpA^ET и tcpA^CIRS — аллели гена tcpA, кодирующего основную субъединицу TCP; toxR — глобальный регуляторный ген интактный (белый цвет) или мутантный (черный).

Обнаружение мутации в глобальном регуляторном гене toxR. Поскольку, помимо генов toxT, tcpP и tcpH, одним из основных компонентов генной сети вирулентности, координированно регулирующей экспрессию генов СТ и TCP, является глобальный регуляторный ген toxR, расположенный в коровой части генома, можно было ожидать, что одной из причин авирулентности штаммов 89 и 147 могло быть изменение в его структуре. Это предположение основано на том, что трансмембранный сенсорный ДНК-связывающийся белок ToxR (мол. масса 32,5 кД) на уровне транскрипции осуществляет позитивный контроль экспрессии одного из основных регуляторных генов вирулентности toxT, продукт которого — транскрипционный активатор ToxT непосредственно обеспечивает биосинтез двух критических факторов вирулентности TCP и CT (см. рис. 1, а). Действительно, в результате анализа нуклеотидной последовательности гена toxR у обоих штаммов обнаружили делецию одного нуклеотида — тимина (T) в позиции 357, что привело к замене смыслового кодона TTG, кодирующего лейцин, на стоп-кодон TGA (рис. 3, а). Такая мутация обусловила утрату 176 аминокислот (aa) из цитоплазматического (64 аа), трансмембранного (16 aa) и периплазматического (96 aa) доменов (рис. 3, б), присутствующих в интактном белке ToxR вирулентного референсного штамма V. cholerae О1 биовара Эль Тор N16961, содержащего 294 aa (цитоплазматический домен 182 aa, трансмембранный домен 16 aa, периплазматический домен 96 aa) [22]. В то же время нуклеотидная последовательность гена toxR вирулентных клинических штаммов Р18899 и 76 была идентична таковой референсного штамма возбудителя холеры N16961 (см. рис. 3, а).

Рис. 3. Структура регуляторного гена toxR авирулентных и вирулентных штаммов V. cholerae O1 биовара Эль Тор ctxA⁺tcpA⁺.

а — нуклеотидная последовательность гена toxR авирулентных (89 и 147) и вирулентных (Р18899, 76 и N16961) штаммов; у авирулентных штаммов серым цветом обозначена делеция одного нуклеотида в гене toxR, приводящая к образованию стоп-кодона TGA; б — аминокислотная последовательность белка ToxR — продукта интактного (референсный штамм N16961) и мутантного (штаммы 89 и 147) гена toxR.

Образование дефектного белка ToxR, являющееся следствием обнаруженной мутации в нуклеотидной последовательности гена toxR, могло привести к потере его функции. Для проверки этого предположения мы провели сравнительный анализ продукции белков внешней мембраны OmpU и OmpT в мутантных по гену toxR авирулентных штаммах и вирулентных изолятов с интактным геном toxR. Если у авирулентных штаммов, несущих мутацию в гене toxR, действительно изменяется активность кодируемого им белка, то эти штаммы должны отличаться от вирулентных продукцией белка OmpU (38,0 kD), для экспрессии которого требуется интактный белок ToxR, а также белка OmpT (42,0 кД), экспрессия которого негативно регулируется непосредственно ToxR [23, 24] (см. рис. 1, б). В результате было показано, что мутация в гене toxR действительно привела к тому, что в отличие от клинического вирулентного штамма 76 с интактным геном toxR, взятого в качестве контроля, авирулентные штаммы 89 и 147 утратили белок OmpU, но у них появился другой белок — OmpT (рис. 4, дорожки 3—5). Таким образом, обнаруженные изменения продукции двух белков внешней мембраны, гены которых, ompT и ompU, находятся под непосредственным контролем гена toxR, явно связаны с потерей функции белка ToxR у авирулентных штаммов в результате нарушения последовательности гена toxR.

Рис. 4. Электрофореграмма белков внешней мембраны OmpU и OmpT авирулентных и вирулентных штаммов V. cholerae O1 биовара Эль Тор ctxA⁺tcpA⁺.

M — маркер молекулярной массы, 1, 3 — вирулентные штаммы Дакка 35 Tox⁺ и 76 соответственно, 2, 4, 5 — авирулентные штаммы Дакка 35 Tox^–, 89 и 147 соответственно.

Влияние мутации в глобальном регуляторном гене toxR на уровень транскрипции ключевых структурных и регуляторных генов вирулентности. Потеря функции белка ToxR вследствие однонуклеотидной делеции в гене toxR, обусловившей образование стоп-кодона, могла изменить активность другого центрального регуляторного гена toxT, непосредственным транскрипционным активатором которого является белок ToxR. Методом ОТ ПЦР в реальном времени мы сравнили уровень транскрипции генов toxR и toxT у мутантных по гену toxR штаммов 147 и 89 с таковыми вирулентного штамма 76, взятого в качестве контрольного. В результате было выявлено статистически значимое снижение уровня транскрипции этих генов у мутантных штаммов 147 и 89. Активность их гена toxR снизилась в 1,5—2,0 раза (рис. 5, а). Наиболее выраженным было понижение уровня транскрипции гена toxT — в 5,3 раза у штамма 147 и в 5,6 раза у штамма 89 (см. рис. 5, д). Поскольку белковый продукт гена toxT является прямым позитивным регулятором структурных генов ctxAB и tcpA-F, кодирующих CT и TCP, резкое снижение его транскрипции могло привести к существенному изменению экспрессии генов этих ключевых факторов вирулентности. Для подтверждения этого предположения был определен уровень транскриции генов ctxA, ctxB и tcpA у изученных штаммов. Оказалось, что их транскрипционная активность была значительно снижена в сравнении с таковой вирулентного штамма 76. Наиболее существенно снизился уровень транскрипции генов холерного токсина — гена ctxA в 33,0—50,0 раза и гена ctxB в 33,0—100,0 раза (см. рис. 5, б, в). Что касается гена tcpA, кодирующего основную субъединицу TCP, то его активность была также снижена — в 7,5 раза у штамма 147 и в 10,0 раза у штамма 89 по сравнению с контрольным штаммом 76 (см. рис. 5, г). Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что транскрипция изученных регуляторных и структурных генов вирулентности действительно была заметно снижена у исследуемых штаммов V. cholerae 147 и 89, содержащих однонуклеотидную делецию в регуляторном гене toxR, которая привела к сдвигу рамки считывания и утрате функции глобального регулятора ToxR.

Рис. 5. Относительный уровень транскрипции ключевых структурных (ctxA, ctxB, tcpA) и регуляторных (toxR, toxT) генов, входящих в состав генной сети вирулентности, авирулентных штаммов V. cholerae O1 биовара Эль Тор 147 и 89 ctxA⁺tcpA⁺ d в сравнении с вирулентным штаммом 76 ctxA⁺ tcpA⁺.

По оси абсцисс — гены, входящие в сеть вирулентности V. cholerae 01 биовара Эль Тор. По оси ординат — уровень транскриптов генов в относительных единицах.

Следовало также ожидать, что следствием этого события будет резкое понижение или отсутствие у авирулентных штаммов продукции CT, определяющего развитие специфического холерогенного синдрома у экспериментальных животных. Действительно, по данным иммуноферментного метода GM₁ ELISA, продукция токсина у штаммов 89 и 147 составляла 0,01 и 0,02 мкг/мл соответственно, тогда как взятые для сравнения вирулентные клинические штаммы 28, 76 и 153 продуцировали 0,43—0,63 мкг/мл этого белка. Полученные данные позволили заключить, что утрата функции регуляторного белка ToxR из-за мутации в гене toxR, обусловившая каскадное снижение мРНК-структурных и регуляторных генов вирулентности штаммов 147 и 89, привела к резкому снижению продукции CT, что и явилось причиной их авирулентности.

Филогенетическая связь авирулентных и вирулентных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор. Обнаружение авирулентных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, содержащих в геноме все известные генетические маркеры эпидемически опасных штаммов, ставит вопрос об их происхождении. Для выяснения филогенетических связей штаммов 147 и 89 с вирулентными штаммами были использованы нуклеотидные последовательности их полных геномов, а также 19 вирулентных штаммов, секвенированных нами (14 штаммов) или взятых из базы данных NCBI GenBank (5). Выбранные вирулентные штаммы относились к типичным, вызвавшим начало 7-й пандемии холеры, или к разным геновариантам, возникшим на различных этапах эволюции генома возбудителя. Филогенетический анализ и построение дендрограммы проводили на основе выявления коровых SNPs в полногеномных нуклеотидных последовательностях этих штаммов. При сравнении с референсным типичным штаммом возбудителя холеры Эль Тор V. cholerae N16961 в геноме взятых штаммов было найдено 392 SNPs, на основе которых проведено построение дендрограммы Maksimum Parsinomy (рис. 6). Согласно представленным данным, штаммы образовали три группы, отражающие этапы эволюционных преобразований генома патогена (см. рис. 6). В первую группу вместе с референсным N16961 вошли типичные штаммы, отличающиеся от него лишь на 48—64 SNPs, что подтверждает их клональное происхождение. Геноварианты возбудителя образовали две отдельные группы — вторую и третью. Вторая группа состояла из вирулентных штаммов генетически измененного возбудителя с аллелем ctxB1, возникших в ранний период их формирования (1991—1995 гг.) и отличалась от типичного референсного штамма из первой группы на 102—121 SNPs. Третья группа была представлена новыми вариантами возбудителя, сформированными в более поздний период (2001—2014 гг.) и несущими, согласно ранее полученным данным, дополнительные мутации в генах вирулентности и пандемичности — новые аллели ключевых и дополнительных генов патогенности ctxB (ctxB7), tcpA (tcpA^CIRS), rtxA (rtxA4) и протяженную делецию в VSP-II (см. рис. 6). Эта группа имела более значимые отличия от референсного штамма, составляющие 117—160 SNPs. Что касается изучаемых штаммов 147 и 89, содержащих в структурных генах холерного токсина аллель ctxB1, то, несмотря на отличия в вирулентности и выделение в более поздний период (2010 г.), эти штаммы оказались филогенетически близкими с геновариантами второй группы, различаясь между собой на три SNPs, что указывает на их клональное происхождение. Тем не менее геномы этих штаммов имели 21—44 SNPs, отличающих их от геномов других штаммов, входящих в состав этой группы, и 14 SNPs, специфичных только для них. Распределенные по геному в разных позициях, эти уникальные SNPs были связаны с изменением аминокислотной последовательности белков, выполняющих в клетке разные функции (транспорт различных веществ, биосинтез полисахаридов, устойчивость к антибиотикам) (табл. 3). Пока неясно, как влияют эти замены на функциональность указанных белков. Тем не менее, вполне возможно, что эти мутации могут быть значимы для функционирования генов вирулентности. Таким образом, установленные филогенетические связи позволяют полагать, что изученные авирулентные штаммы, сформированные, видимо, на эндемичной по холере территории, являются производными вирулентных геновариантов возбудителя, появившихся в начальный период их формирования. Возникновение мутации в глобальном регуляторном гене toxR, обусловившей авирулентность геновариантов, является, возможно, следствием их адаптации к стрессовым воздействиям водной среды.

Рис. 6. Филогенетическое дерево вирулентных и авирулентных штаммов V. cholerae O1 биовара Эль Тор ctxA⁺tcpA⁺, построенное методом maximum parsimony tree по данным анализа коровых SNPs в полногеномных последовательностях 21 штамма.

Овалами выделены группы типичных штаммов (1), геновариантов, возникших в ранний период (2), и геновариантов, выделенных в более поздний период эволюции возбудителя (3). В скобках указано количество SNP, отличающее каждую группу от референсного штамма V. cholerae N16961.

Таблица 3. Уникальные несинонимичные однонуклеотидные замены (SNPs) в локусах авирулентных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор 147 и 89 ctxA⁺tcpA⁺

Локус	Мутация	Позиция от начала генома*	Позиция в гене	Функция кодируемого белка и результат мутации
VC0164	G→A	154496	3034	Белок VexB, обеспечивающий устойчивость к антибиотикам. Замена пролина на серин
VC0344	C→G	366140	821	Белок N-ацетилмурамоил-L-аланин амидаза, обеспечивающий переход колоний в ругозные формы. Замена аланина на глицин
VC0420	T→C	450121	3434	Гипотетический протеин. Замена лейцина на пролин
VC0784	C→T	841149	841	Белок натрий/аланин симпортер, ответственный за транспорт натрия/аланина через клеточную мембрану. Замена глицина на серин
VC1061	A→C	1129007	961	Белок цистеин синтаза/цистатионин бета синтаза, катализирующая переход гомоцистеина в цистатионин. Замена тирозина на аспарагиновую кислоту
VC1258	C→A	1332037	1831	A-субъединица ДНК гиразы. Замена аргинина на серин
Межгенное пространство	A→T	2004484	—	—
VC2256	G→T	2412656	158	Белок ундекапренил дифосфат синтаза, участвующий в биосинтезе полисахаридов. Замена треонина на аспарагин
VC2394	C→A	2560518	2584	Субъединица белка SecA, участвующего в транспорте белков через мембрану клетки. Замена аланина на серин
Межгенное пространство	C→T	2787915	—	—
Межгенное пространство	C→T	2821368	—	—
VCA0025	G→A	31052 (хромосома II)	569	Транспортный белок семейства NadC. Замена серина на аспарагин

Примечание. * — указана позиция по геному референсного штамма V. cholerae N16961 (номера доступа GenBank NC_002505 и NC_002506).

Заключение

Возросший интерес к исследованиям вариабельности структуры и функции генома возбудителя холеры, несущего в хромосоме ключевые гены патогенности в составе профага CTXφ и острова патогенности VPI-1, в значительной мере обусловлен выделением из водной среды различных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор с пониженной или утраченной вирулентностью. Механизм их формирования до сих пор оставался малоизученным. Одним из механизмов возникновения таких вариантов является утрата полного генома профага CTXφ с генами холерного токсина [21]. Проведенные исследования позволили получить новую информацию о структурно-функциональных особенностях генома изученных штаммов, изолированных из воды. При анализе секвенированных нами полных геномов выделенных из воды авирулентных и клинических вирулентных штаммов, относящихся по генотипу ctxA⁺tcpA⁺ к эпидемически опасным штаммам, не было выявлено различий между ними в структуре профага CTXφ и острова патогенности VPI-1. В то же время у авирулентных штаммов впервые было обнаружено изменение нуклеотидной последовательности глобального регуляторного гена toxR, расположенного в коровой части генома — делеция одного нуклеотида (T в позиции 357), что привело к образованию стоп-кодона TGA. Следствие такой мутации — образование дефектного трансмембранного ДНК-связывающего белка ToxR, осуществляющего позитивный контроль экспрессии основного регуляторного гена вирулентности toxT. Показано, что утрата функции белка ToxR вследствие выявленной мутации в гене toxR обусловила существенное снижение мРНК регуляторных и структурных генов вирулентности у изученных штаммов, выделенных из воды, что в свою очередь привело к их неспособности продуцировать CT, необходимого для развития инфекционного процесса при холере. SNP-анализ полногеномных нуклеотидных последовательностей двух авирулентных штаммов ctxA⁺tcpA⁺ и 19 вирулентных, изолированных на разных этапах 7-й пандемии холеры, указал, что мутантные штаммы вошли в состав группы, включающей в себя вирулентные геноварианты, появившиеся в начальный период их образования (1991—1995 гг.). Эти данные позволили полагать, что изученные авирулентные штаммы являются производными этих геновариантов возбудителя, появившимися в результате мутации в глобальном регуляторном гене toxR.

Таким образом, выявлен новый механизм изменения вирулентности штаммов V. cholerae биовара Эль Тор с генотипом ctxA⁺tcpA⁺, выделенных из воды. Использование полученных данных об изменении структуры и функции глобального регуляторного белка ToxR за счет ранее не описанной мутации в гене toxR может обеспечить более объективную оценку уровня вирулентности различных изолятов V. cholerae биовара Эль Тор с генотипом ctxA⁺tcpA⁺, определяющего структуру и тяжесть инфекционного процесса. Дальнейшее выявление различных мутаций в глобальном регуляторном гене toxR и выяснение их возможных связей с уровнем вирулентности у различных штаммов возбудителя холеры составляет предмет нашей будущей работы.

Благодарности. Авторы благодарны к.б.н., с.н.с. РосНИПЧИ «Микроб» Ливановой Л.Ф. за помощь в проведении экспериментов с животными.

Финансирование. Работа не имела спонсорской поддержки.

Соблюдение этических норм. При работе с животными были соблюдены все применимые международные, национальные и институциональные принципы ухода и использования животных.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.