Особенности ДНК-геликазы, кодируемой геном uvrD Deinococcus radiodurans R1, выявленные в клетках Escherichia coli K-12

Читать метаданные

Введение. Репаративная геликаза uvrD Deinococcus radiodurans выполняет неожиданную критическую функцию в репарации двунитевых разрывов ДНК по механизму отжига нитей, зависящему от протяженного синтеза (ESDSA), в то время как в Escherichia coli рассматривается как необязательный участник RecF-пути рекомбинационной репарации. Материал и методы. Фрагмент геномной ДНК радиоустойчивой бактерии Deinococcus radiodurans с геном uvrD, кодирующим ДНК-геликазу II, вовлеченную в эксцизионную репарацию нуклеотидов, коррекцию ошибочно-спаренных оснований, рекомбинационную репарацию и репликацию, был клонирован в клетках модельного объекта — Escherichia coli K-12. Результаты. Плазмида pCR 2.1-uvrD+ восстанавливает радиорезистентность к ультрафиолетовому свету мутантных клеток Escherichia coli uvrD–, helD– и rep–, дефектных по репаративной геликазе II, геликазе IV и репликативной геликазе Rep, соответственно, практически до уровня дикого типа AB1157 (uvrD+) и, в меньшей степени, штамма с мутацией в гене recQ, кодирующем ключевую геликазу рекомбинационной репарации RecQ. Защитный эффект также заметен при облучении штаммов с плазмидой γ-лучами. Заключение. Установлены широкие функциональные возможности геликазы UvrD Deinococcus radiodurans.

Ключевые слова:

ДНК-геликаза II

Deinococcus radiodurans

uvrD

rep

recQ

helD

функциональная комплементация

радиационная устойчивость

Авторы:

Гулевич Е.П.

ФГБУ «Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт», Гатчина, Ленинградская обл., Россия

Кузнецова Л.В.

Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова Минздравсоцразвития России, Институт перинатологии и педиатрии, НКО репродукции и здоровья женщины, Санкт-Петербург

Киль Ю.В.

Вербенко В.Н.

Список литературы:

Friedberg EC, Walker GC, Siede W. DNA repair and mutagenesis. Washington, D.C.: ASM Press; 1995.
Kuzminov A. Recombinational repair of DNA damage in Escherichia coli and bacteriophage lambda. Microbiol Mol Biol Rev. 1999;63(4):751-813.
Bentchikou E, Servant P, ve Coste G, Sommer S. A major role of the RecFOR pathway in DNA double-strand-break repair through ESDSA in Deinococcus radiodurans. PLoS Genetics. 2010;6(1):1-12:e1000774.
Slade D, Lindner AB, Paul G, Radman M. Recombination and replication in DNA repair of heavily irradiated Deinococcus radiodurans. Cell. 2009;136(6):1044-1055.
Zahradka K, Slade D, Bailone A, Sommer S, Averbeck D, Petranovic M, et al. Reassembly of shattered chromosomes in Deinococcus radiodurans. Nature. 2006;443(7111):569-573.
Matson SW, Bean DW, George JW. DNA helicases: enzymes with essential role in all aspects of DNA metabolism. BioEssays. 1994;16(1):13-22.
Lestini R, Michel B. UvrD and UvrD252 Counteract RecQ, RecJ, and RecFOR in a rep mutant of Escherichia coli. J Bacteriol. 2008;190(17):5995-6001.
Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир; 1984.
Hiramatsu Y, Kato R, Kawaguchi S, Kuramitsu S. Cloning and characterization of the uvrD gene from an extremely thermophilic bacterium, Thermus thermophilus HB8. Gene. 1997;199(1-2):77-82.
Modrich P. Mechanisms in E. coli and human mismatch repair. Angew Chem Int Ed Engl. 2016;55(30):8490-8501. https://doi.org/10.1002/anie.201601412
Newton KN, Courcelle CT, Courcelle J. UvrD participation in nucleotide excision repair is required for the recovery of DNA synthesis following UV-induced damage in Escherichia coli. J Nucleic Acids. 2012;271453. https://doi.org/10.1155/2012/271453
Mendonca VM, Kaiser-Rogers K, Matson SW. Double helicase II (uvrD)-helicase IV (helD) deletion mutants are defective in the recombination pathways of Escherichia coli. J Bacteriol. 1993;175(15):4641-4651.
Stelter M, Acajjaoui S, McSweeney S, Timmins J. Structural and mechanistic insight into DNA unwinding by Deinococcus radiodurans UvrD. PLoS One. 2013;8(10):1-17:e77364.
Singleton MR, Dillingham MS, Wigley DB. Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases. Annu Rev Biochem. 2007;76:23-50.
Yang W. Lessons learned from UvrD helicase: mechanism for directional movement. Annu Rev Biophys. 2010;39:367-385.
Mills M, Harami GM, Seol Y, Gyimesi M, Martina M, Zoltan J, Kovacs ZJ, Kovacs M, Neuman KC. RecQ helicase triggers a binding mode change in the SSB-DNA complex to efficiently initiate DNA unwinding. Nucleic Acids Research. 2017;45(20):11878-11890. https://doi.org/10.1093/nar/gkx939
Trun N. Mutations in the E. coli Rep helicase increase the amount of DNA per cell. FEMS Microbiol. Lett. 2003;226(1):187-193.
Smirnov GB, Filkova EV, Skavronskaya AG, Saenko AS, Sinzinis BI. Loss and restoration of viability of E. coli due to combinations of mutations affecting DNA polymerase I and repair activities. Mol Gen Genet. 1973;121(2):139-150.
Pavankumar TL, Exell JC, Kowalczykowski SC. Direct fluorescent imaging of translocation and unwinding by individual DNA helicases. Methods Enzymol. 2016;581:1-32. https://doi.org/10.1016/bs.mie.2016.09.010
Harmon FG, Brockman JP, Kowalczykowski SC. RecQ helicase stimulates both DNA catenation and changes in DNA topology by topoisomerase III. J Biol Chem. 2003;278(43):42668-42678.
Bruand C, Ehrlich SD. UvrD-dependent replication of rolling-circle plasmids in Escherichia coli. Mol Microbiol. 2000;35(1):204-110.
Kogoma T. Recombination by replication. Cell. 1996;85(5):625-627.

Закрыть метаданные

Ген uvrD кодирует геликазу II, которая играет важную роль в эксцизионной репарации нуклеотидов (ЭРН), коррекции ошибочно-спаренных оснований и репликации ДНК у прокариот [1]. Известно также о ее участии в репарации брешей в ДНК по механизму RecFOR-зависимой рекомбинационной репарации [2]. Вместе с тем ее вклад в рекомбинационную репарацию ДНК может быть недооценен из-за наличия в Escherichia coli активного RecBCD-зависимого пути рекомбинационной репарации. У крайне радиоустойчивой бактерии Deinococcus radiodurans функционирует единственный RecFOR-путь рекомбинационной репарации [3], и на этом фоне вклад геликазы II как в репарацию однонитевых брешей, так и наиболее опасных повреждений, двуцепочечных разрывов (ДР) ДНК является определяющим.

Бактерия D. radiodurans хорошо известна из-за высокой устойчивости к экстремальным воздействиям высушивания и радиации, вызывающим различные типы повреждений ДНК, включая ДР. Так как и одиночный нерепарированный ДР ДНК обычно летален, ДР рассматриваются как наиболее тяжелые формы повреждения генома. Экстремальная радиорезистентность дейнококка связана с его способностью реконструировать геном из сотен хромосомных фрагментов. Реконструкция генома идет через двухстадийный процесс: 1-я стадия — зависящий от протяженного синтеза отжиг нити (ESDSA), который собирает фрагменты генома в длинные линейные интермедиаты; 2-я стадия — рекомбинация, генерирующая кольцевые хромосомы [4, 5]. D. radiodurans располагает гомологами ключевых компонентов RecF-пути рекомбинации [3] — основного пути рекомбинационной репарации в этом организме, как это имеет место и в других бактериях, не имеющих гомологов RecBCD-пути рекомбинации.

В модельной бактерии E. coli RecF-путь включает 5’-3’-однонитевую ДНК-экзонуклеазу RecJ, геликазу RecQ (ecRecQ) и белки RecF, RecO и RecR, которые действуют вместе, чтобы обеспечить загрузку белка RecA на однонитевую ДНК [2]. Геликазы UvrD (ecUvrD) и HelD (ecHelD) рассматриваются как возможные, но необязательные участники этого пути рекомбинации [6], хотя признается роль геликазы UvrD в восстановлении репликативных вилок при повреждении геликазы Rep (ecRep) [7]. Однако в D. radiodurans репаративная геликаза UvrD (drUvrD) выполняет неожиданную критическую функцию в репарации ДР ДНК по механизму ESDSA [3]. Предполагается, что UvrD, замещая RecQ, действует в паре с RecJ и генерирует однонитевые хвосты, на которых комплекс RecFOR будет стимулировать загрузку RecA [3]. Остается интригующим вопрос, за счет чего в итоге достигается высокая радиоустойчивость D. radiodurans. Перспективным направлением исследования механизмов радиорезистентности выглядит перенос гена uvrD из D. radiodurans на генетический фон E. coli для сопоставления свойств этой репаративной геликазы у разных по радиоустойчивости видов.

Целью этой работы стало клонирование репаративной геликазы uvrD бактерии D. radiodurans в клетках E. coli и изучение ее способности комплементировать мутации в различных геликазах и восстанавливать радиоустойчивость данного микроорганизма.

Методика исследования

Штаммы бактерий. Характеристики использованных штаммов представлены в табл. 1.

Таблица 1. Характеристика использованных штаммов бактерий

Плазмиды. В работе использована плазмида pCR 2.1-TOPO (Amp^r Kan^r/Neo^r 5 kb) («Invitrogen», 1997). Плазмида несет детерминанты Ap^r устойчивости к ампицилину и Km^r устойчивости к канамицину.

Олигонуклеотиды. Для клонирования uvrD D. radiodurans использовались праймеры: uvrDdr-F 5’-AAGAAGCGTCCGACCAAGTG и uvrDdr-R 5’-TCGTCATCCGGAGCTGAGTC, а для клонирования uvrD E. coli — uvrDec-F 5’-CATCTCTGACCTCGCTGATA, uvrDec-R 5’-AACGTTACACCGACTCCAGC («Синтол», Москва).

Среды. Для УФ- и γ-облучения клеток использовали среду М9, содержащую 0,05 М MgSO₄, Na₂HPO₄ (6 г), КН₂РО₄(3 г), NaCl (0,5 г), NH₄Cl (1 г) на 1 л воды (рН 7,2). Для выращивания клеток применяли АП-бульон — аминопептид («Самсон»), разбавленный в 2 раза 0,15 М NaCl. Титрование клеток производили на АП-агаре (АП-бульоне, содержащем 1,6% агара). Ампицилин добавляли в среды в концентрации 50 мкг/мл, а канамицин — в концентрации 40 мкг/мл.

Выделение плазмидной ДНК. ДНК выделяли стандартным методом щелочного лизиса [8].

Трансформация клеток E. coli. Трансформацию клеток E. coli по признаку устойчивости к ампицилину или канамицину выделенными рекомбинантными плазмидами pCR 2.1-UvrD проводили кальциевым методом по стандартной методике [8] с последующим высевом проб на АП-агар с ампицилином или канамицином соответственно.

Изучение зависимости выживаемости клеток от дозы УФ-света и γ-радиации. Клетки E. coli, выращенные в АП-бульоне до середины экспоненциальной фазы роста (оптическая плотность при 630 нм равна 0,2—0,4), осаждали центрифугированием (10000 об/мин, 10 мин) и ресуспендировали в исходном объеме среды М9. Облучение производили при комнатной температуре в стеклянных чашках Петри на приборе для УФ-облучения «Хромотоскоп» при мощности излучения ~450 мДж/м²/с в диапазоне 200—280 нм, отбирая аликвоты культуры объемом 0,1 мл. γ-облучение проводили на установке «Исследователь», содержащей ⁶⁰Co, с мощностью дозы 200 Гр/мин. Облученные клетки после соответствующего разбавления средой М9 рассевали на АП-агар и подсчитывали число колоний через 24 ч. УФ-облучение, разведение культур и рассев производили в условиях освещения красным светом, чтобы избежать фотореактивации. С каждым из использованных штаммов проведено по 3—6 независимых экспериментов.

Математическая обработка результатов опытов. Обработка данных о зависимости S от дозы излучения (D) и построение кривых выживаемости lgS=f(D) проведена по методу наименьших квадратов с использованием программы Origin 2016. Кривые lgS=f(D) линейно аппроксимировались как lgS=A+BD. На графиках представлены средние значения и среднеквадратичная ошибка. В табл. 2 представлены значения параметров А и В, которые характеризуют экстраполяционное число и наклон кривой. Для сравнения радиочувствительности определяли фактор изменения дозы (ФИД) как отношение параметров B для пар: штамм без плазмиды/штамм с плазмидой.

Таблица 2. Сравнение чувствительности штаммов E. coli, несущих плазмиду с клонированным геном uvrD D. radiodurans, к УФ-свету и ионизирующей радиации

Примечание. * — кривая была L-образной.

Результаты и обсуждение

Полноразмерная копия гена uvrD D. radiodurans с предполагаемым промотором была клонирована на плазмиде pCR 2.1-TOPO. Размножение плазмиды производили в штамме recA, дефектном по рекомбинации. В связи с тем что в 5’-районе не было обнаружено консенсунсного для E. coli промотора, мы проверили несколько клонов, чтобы отобрать вариант с нужной для экспрессии ориентацией. Ориентация подтверждалась рестрикционным анализом и секвенированием. Два таких клона с разной ориентацией вставки были обозначены как pCR 2.1-uvrD⁺ и pCR 2.1-uvrD^–. Штамм E. coli uvrD, дефектный по активности ДНК-геликазы II, был трансформирован обеими плазмидами. Кривые выживаемости соответствующих трансформантов представлены на рис. 1, а параметры кривых — в табл. 2. Плазмида pCR 2.1-uvrD⁺ в значительной мере восстанавливала радиоустойчивость реципиента uvrD, особенно в области больших доз (см. рис. 1, кривая 2). При этом радиоустойчивость возрастала приблизительно в 4,3 раза при оценке по параметру ФИД. В тоже время плазмида pCR 2.1-uvrD^– не оказывала заметного влияния на радиочувствительность трансформированных клеток (см. рис. 1, кривая 12). Доза гена, по-видимому, не имеет значения, так как плазмида pCR 2.1-uvrD⁺ не влияла на чувствительность к УФ-свету клеток дикого типа (см. рис. 1, кривая 10). Плазмида с клонированным геном uvrD E. coli была обозначена как pCR 2.1-uvrD_Ec⁺. Она ожидаемо полностью компенсировала дефект в гене uvrD (см. рис. 1, кривая 11). Таким образом, несмотря на то, что геликаза UvrD D. radiodurans происходит из неродственного вида, она способна компенсировать дефект гомологичного фермента E. coli.

Рис. 1. Летальное действие УФ-света на штаммы E. coli.

1 — uvrD (); 2 — uvrD/pCR 2.1-uvrD⁺ (▲); 3 — recQ (○);, 4 — recQ/pCR 2.1-uvrD⁺ (); 5 — helD (); 6 — helD/pCR 2.1-uvrD⁺ (■ ); 7 — rep (); 8 — rep/pCR 2.1-uvrD⁺ (♦); 9 — AB1157 (); 10 — AB1157/pCR 2.1-uvrD⁺ (); 11 — uvrD/pCR 2.1-uvrD_Ec⁺ (▼); 12 — uvrD/pCR 2.1-uvrD^– ().

По оси абсцисс — доза облучения (Дж/м²), по оси ординат — выживаемость (lgS).

Для выяснения способности геликазы drUvrD компенсировать дефекты в других геликазах, участвующих в рекомбинации, репарации и репликации у E. coli, мы трансформировали штаммы E. coli, дефектные по этим ферментам, плазмидой pCR 2.1-uvrD⁺. С ними были проведены опыты по определению УФ-чувствительности. Оказалось, что плазмида pCR 2.1-uvrD⁺ может компенсировать дефект не только в геликазе II, но в разной степени и в других геликазах: HelD, Rep и RecQ, повышая выживаемость в 1,3 2,2 и 1,9 раза соответственно (см. рис. 1 и табл. 2). Плазмида pCR 2.1-uvrD_Ec⁺ не влияла на радиоустойчивость мутантов helD, rep и recQ (данные не представлены).

Наибольший эффект наблюдался в трансформанте rep/pCR 2.1-uvrD⁺, который стал статистически близок по значениям устойчивости к дикому типу (см. рис. 1, кривая 8).

Опыты для определения радиочувствительности были проведены и с использованием γ-лучей (рис. 2 и табл. 2). Защитный эффект плазмиды pCR 2.1-uvrD⁺ был менее выражен и отсутствовал в случае мутанта rep, который исходно оказался достаточно радиоустойчивым к γ-лучам. Наблюдаемые различия могут быть связаны с разным спектром повреждений ДНК после УФ- и γ-облучения.

Рис. 2. Летальное действие γ-излучения на штаммы E. coli.

1 — uvrD (); 2 — uvrD/pCR 2.1-uvrD⁺ (▲ ); 3 — recQ (○ ); 4 — recQ/pCR 2.1-uvrD⁺ (); 5 —helD (); 6 — helD/pCR 2.1-uvrD⁺ (■); 7 — rep (); 8 — rep/pCR 2.1-uvrD⁺ (♦ ); 9 — AB1157 (); 10 — AB1157/pCR 2.1-uvrD⁺ (); 11 — uvrD/pCR 2.1-uvrD_Ec⁺ (▼ ).

По оси абcцисс — доза облучения (кГр); по оси ординат — выживаемость (lgS).

Для объяснения регистрируемого эффекта от присутствия в клетках E. coli белка drUvrD было проведено выравнивание первичной последовательности геликазы II D. radiodurans c 4 геликазами E. coli с использованием программы BLASTP Национального центра биотехнологической информации (США). Идентичность составила 35% для пары drUvrD/ecUvrD, 38% — для drUvrD/ecRep и 27% — для drUvrD/ecHelD. Однако характерные мотивы геликазы II [9], представленные 7 элементами, оказались весьма консервативными. Они практически совпадают у геликаз drUvrD, ecUvrD, ecRep и ecHelD. Особый случай представляет геликаза ecRecQ, у которой из всей последовательности только один небольшой участок на C-конце, присущий всем геликазам, совпадает с drUvrD.

Таким образом, при клонировании и изучении свойств геликазы UvrD D. radiodurans в мутантных клетках E. coli установлена ее способность компенсировать дефекты в целом ряде геликаз, участвующих в различных процессах: репарации, репликации и рекомбинации.

Роль геликазы UvrD широко охарактеризована в ЭРН и коррекции ошибочно-спаренных оснований в E. coli [10, 11]. Ранее было установлено, что инактивация геликазы II заметно уменьшает радиорезистентность деинококка и сильно задерживает кинетику репарации ДР [3]. Маловероятно, что чувствительность к γ-излучению клеток D. radiodurans uvrD связана с дефектом пути ЭРН, потому что мутантные бактерии, дефектные по гену uvrA, сохраняют выживаемость на уровне дикого типа после облучения ионизирующей радиацией [3]. Предполагается, что UvrD вовлечена в ESDSA, однако в E. coli главной на RecF-пути рекомбинационной репарации считается геликаза RecQ в комплексе с экзонуклеазой RecJ [2]. Геликазы HelD и UvrD рассматриваются как альтернатива RecQ [12].

Первостепенная роль ДНК-геликазы II связана с ее способностью связывать и расплетать специфические структуры, соответствующие интермедиатам репарационных и других процессов. С этой точки зрения имеет значение субстратная специфичность UvrD.

Биохимические исследования показали, что UvrD D. radiodurans — активная ДНК-стимулируемая АТФаза, которая также располагает АТФ-зависимой транслоказной и геликазной активностями [13]. Исследования in vitro продемонстрировали, что белок drUvrD транслоцируется вдоль онДНК в направлении 3′—5′ как и ecUvrD [14], и, несмотря на то что принадлежит к семейству геликаз с 3’—5’-полярностью, может расплетать дуплексную ДНК в обоих 3′—5′ и 5′—3′ направлениях [15]. Интересно то, что транслоказная и биполярная геликазная активность drUvrD модулируется связывающим онДНК белком SSB (что характерно для RecQ E. coli [16]). drUvrD также демонстрирует слабую геликазную активность в отношении ДНК с тупыми концами.

Эти свойства геликазы UvrD D. radiodurans объясняют ее способность компенсировать не только дефект в гене uvrD E. coli, но и в генах rep и recQ. Rep — геликаза с предпочтением к лидирующей нити ДНК. Она играет важную роль в репликации ДНК [17]. Rep и UvrD — две связанные геликазы E. coli, и инактивация одновременно обоих летальна [7]. Вклад геликазы UvrD в обеспечение жизнеспособности клеток подчеркивает то обстоятельство, что сочетание мутаций в гене uvrD и гене polA, кодирующем ДНК-полимеразу I, также летально [18]. Геликаза UvrD способна вытеснять олигонуклеотиды из синтетической репликативной вилки ДНК in vitro и необходима для выживаемости в отсутствие геликазы Rep, ассоциированной с процессингом репликативных вилок. Можно предполагать, что геликаза UvrD может обеспечивать регрессию репликативных вилок и облегчать рестарт репликативной вилки после остановки. Весьма примечателен радиозащитный эффект экспрессии UvrD D. radiodurans на фоне мутации recQ E. coli. In vitro геликаза RecQ связывает и расплетает множество различных субстратов ДНК [19]. ДНК с однонитевым хвостом, ДНК с брешью, двуцепочечная ДНК с тупыми концами и ковалентно-замкнутая двуцепочечная ДНК — все они расплетаются RecQ. Это указывает на то, что данная геликаза может функционировать на множестве интермедиатов, вовлеченных в метаболизм ДНК. RecQ — одна из немногочисленных геликаз, которой не требуется однонитевой участок для входа в двуцепочечную ДНК [20].

Таким образом, субстратная специфичность геликазы UvrD D. radiodurans в значительной степени совпадает с предпочтениями геликазы RecQ E. coli. Существенные различия в аминокислотных последовательностях drUvrD и ecRecQне препятствуют функциональной комплементации и объясняются принадлежностью RecQ к другому семейству геликаз SF2 [21]. Вклад геликазы UvrD D. radiodurans в восстановление радиоустойчивости мутантов rep, recQ и helD E. coli может быть связан с активацией репликации по модели рекомбинационной репарации ДР, сопряженной с рестартом синтеза ДНК [22].

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.