Особенности ДНК-геликазы, кодируемой геном uvrD Deinococcus radiodurans R1, выявленные в клетках Escherichia coli K-12

Ген uvrD кодирует геликазу II, которая играет важную роль в эксцизионной репарации нуклеотидов (ЭРН), коррекции ошибочно-спаренных оснований и репликации ДНК у прокариот [1]. Известно также о ее участии в репарации брешей в ДНК по механизму RecFOR-зависимой рекомбинационной репарации [2]. Вместе с тем ее вклад в рекомбинационную репарацию ДНК может быть недооценен из-за наличия в Escherichia coli активного RecBCD-зависимого пути рекомбинационной репарации. У крайне радиоустойчивой бактерии Deinococcus radiodurans функционирует единственный RecFOR-путь рекомбинационной репарации [3], и на этом фоне вклад геликазы II как в репарацию однонитевых брешей, так и наиболее опасных повреждений, двуцепочечных разрывов (ДР) ДНК является определяющим.

Бактерия D. radiodurans хорошо известна из-за высокой устойчивости к экстремальным воздействиям высушивания и радиации, вызывающим различные типы повреждений ДНК, включая ДР. Так как и одиночный нерепарированный ДР ДНК обычно летален, ДР рассматриваются как наиболее тяжелые формы повреждения генома. Экстремальная радиорезистентность дейнококка связана с его способностью реконструировать геном из сотен хромосомных фрагментов. Реконструкция генома идет через двухстадийный процесс: 1-я стадия — зависящий от протяженного синтеза отжиг нити (ESDSA), который собирает фрагменты генома в длинные линейные интермедиаты; 2-я стадия — рекомбинация, генерирующая кольцевые хромосомы [4, 5]. D. radiodurans располагает гомологами ключевых компонентов RecF-пути рекомбинации [3] — основного пути рекомбинационной репарации в этом организме, как это имеет место и в других бактериях, не имеющих гомологов RecBCD-пути рекомбинации.

В модельной бактерии E. coli RecF-путь включает 5’-3’-однонитевую ДНК-экзонуклеазу RecJ, геликазу RecQ (ecRecQ) и белки RecF, RecO и RecR, которые действуют вместе, чтобы обеспечить загрузку белка RecA на однонитевую ДНК [2]. Геликазы UvrD (ecUvrD) и HelD (ecHelD) рассматриваются как возможные, но необязательные участники этого пути рекомбинации [6], хотя признается роль геликазы UvrD в восстановлении репликативных вилок при повреждении геликазы Rep (ecRep) [7]. Однако в D. radiodurans репаративная геликаза UvrD (drUvrD) выполняет неожиданную критическую функцию в репарации ДР ДНК по механизму ESDSA [3]. Предполагается, что UvrD, замещая RecQ, действует в паре с RecJ и генерирует однонитевые хвосты, на которых комплекс RecFOR будет стимулировать загрузку RecA [3]. Остается интригующим вопрос, за счет чего в итоге достигается высокая радиоустойчивость D. radiodurans. Перспективным направлением исследования механизмов радиорезистентности выглядит перенос гена uvrD из D. radiodurans на генетический фон E. coli для сопоставления свойств этой репаративной геликазы у разных по радиоустойчивости видов.

Целью этой работы стало клонирование репаративной геликазы uvrD бактерии D. radiodurans в клетках E. coli и изучение ее способности комплементировать мутации в различных геликазах и восстанавливать радиоустойчивость данного микроорганизма.

Штаммы бактерий. Характеристики использованных штаммов представлены в табл. 1.

Плазмиды. В работе использована плазмида pCR 2.1-TOPO (Amp^r Kan^r/Neo^r 5 kb) («Invitrogen», 1997). Плазмида несет детерминанты Ap^r устойчивости к ампицилину и Km^r устойчивости к канамицину.

Олигонуклеотиды. Для клонирования uvrD D. radiodurans использовались праймеры: uvrDdr-F 5’-AAGAAGCGTCCGACCAAGTG и uvrDdr-R 5’-TCGTCATCCGGAGCTGAGTC, а для клонирования uvrD E. coli — uvrDec-F 5’-CATCTCTGACCTCGCTGATA, uvrDec-R 5’-AACGTTACACCGACTCCAGC («Синтол», Москва).

Среды. Для УФ- и γ-облучения клеток использовали среду М9, содержащую 0,05 М MgSO₄, Na₂HPO₄ (6 г), КН₂РО₄ (3 г), NaCl (0,5 г), NH₄Cl (1 г) на 1 л воды (рН 7,2). Для выращивания клеток применяли АП-бульон — аминопептид («Самсон»), разбавленный в 2 раза 0,15 М NaCl. Титрование клеток производили на АП-агаре (АП-бульоне, содержащем 1,6% агара). Ампицилин добавляли в среды в концентрации 50 мкг/мл, а канамицин — в концентрации 40 мкг/мл.

Выделение плазмидной ДНК. ДНК выделяли стандартным методом щелочного лизиса [8].

Трансформация клеток E. coli. Трансформацию клеток E. coli по признаку устойчивости к ампицилину или канамицину выделенными рекомбинантными плазмидами pCR 2.1-UvrD проводили кальциевым методом по стандартной методике [8] с последующим высевом проб на АП-агар с ампицилином или канамицином соответственно.

Изучение зависимости выживаемости клеток от дозы УФ-света и γ-радиации. Клетки E. coli, выращенные в АП-бульоне до середины экспоненциальной фазы роста (оптическая плотность при 630 нм равна 0,2—0,4), осаждали центрифугированием (10000 об/мин, 10 мин) и ресуспендировали в исходном объеме среды М9. Облучение производили при комнатной температуре в стеклянных чашках Петри на приборе для УФ-облучения «Хромотоскоп» при мощности излучения ~450 мДж/м²/с в диапазоне 200—280 нм, отбирая аликвоты культуры объемом 0,1 мл. γ-облучение проводили на установке «Исследователь», содержащей ⁶⁰Co, с мощностью дозы 200 Гр/мин. Облученные клетки после соответствующего разбавления средой М9 рассевали на АП-агар и подсчитывали число колоний через 24 ч. УФ-облучение, разведение культур и рассев производили в условиях освещения красным светом, чтобы избежать фотореактивации. С каждым из использованных штаммов проведено по 3—6 независимых экспериментов.

Математическая обработка результатов опытов. Обработка данных о зависимости S от дозы излучения (D) и построение кривых выживаемости lgS=f(D) проведена по методу наименьших квадратов с использованием программы Origin 2016. Кривые lgS=f(D) линейно аппроксимировались как lgS=A+BD. На графиках представлены средние значения и среднеквадратичная ошибка. В табл. 2 представлены значения параметров А и В, которые характеризуют экстраполяционное число и наклон кривой. Для сравнения радиочувствительности определяли фактор изменения дозы (ФИД) как отношение параметров B для пар: штамм без плазмиды/штамм с плазмидой.

Примечание. * — кривая была L-образной.

Полноразмерная копия гена uvrD D. radiodurans с предполагаемым промотором была клонирована на плазмиде pCR 2.1-TOPO. Размножение плазмиды производили в штамме recA, дефектном по рекомбинации. В связи с тем что в 5’-районе не было обнаружено консенсунсного для E. coli промотора, мы проверили несколько клонов, чтобы отобрать вариант с нужной для экспрессии ориентацией. Ориентация подтверждалась рестрикционным анализом и секвенированием. Два таких клона с разной ориентацией вставки были обозначены как pCR 2.1-uvrD⁺ и pCR 2.1-uvrD^–. Штамм E. coli uvrD, дефектный по активности ДНК-геликазы II, был трансформирован обеими плазмидами. Кривые выживаемости соответствующих трансформантов представлены на рис. 1, а параметры кривых — в табл. 2. Плазмида pCR 2.1-uvrD⁺ в значительной мере восстанавливала радиоустойчивость реципиента uvrD, особенно в области больших доз (см. рис. 1, кривая 2). При этом радиоустойчивость возрастала приблизительно в 4,3 раза при оценке по параметру ФИД. В тоже время плазмида pCR 2.1-uvrD^– не оказывала заметного влияния на радиочувствительность трансформированных клеток (см. рис. 1, кривая 12). Доза гена, по-видимому, не имеет значения, так как плазмида pCR 2.1-uvrD⁺ не влияла на чувствительность к УФ-свету клеток дикого типа (см. рис. 1, кривая 10). Плазмида с клонированным геном uvrD E. coli была обозначена как pCR 2.1-uvrD_Ec⁺. Она ожидаемо полностью компенсировала дефект в гене uvrD(см. рис. 1, кривая 11). Таким образом, несмотря на то, что геликаза UvrD D. radiodurans происходит из неродственного вида, она способна компенсировать дефект гомологичного фермента E. coli.

1 — uvrD (); 2 — uvrD/pCR 2.1-uvrD⁺ (▲); 3 — recQ (○);, 4 — recQ/pCR 2.1-uvrD⁺ (); 5 — helD (); 6 — helD/pCR 2.1-uvrD⁺ (■ ); 7 — rep (); 8 — rep/pCR 2.1-uvrD⁺ (♦); 9 — AB1157 (); 10 — AB1157/pCR 2.1-uvrD⁺ (); 11 — uvrD/pCR 2.1-uvrD_Ec⁺ (▼); 12 — uvrD/pCR 2.1-uvrD^– ().

По оси абсцисс — доза облучения (Дж/м²), по оси ординат — выживаемость (lgS).

Для выяснения способности геликазы drUvrD компенсировать дефекты в других геликазах, участвующих в рекомбинации, репарации и репликации у E. coli, мы трансформировали штаммы E. coli, дефектные по этим ферментам, плазмидой pCR 2.1-uvrD⁺. С ними были проведены опыты по определению УФ-чувствительности. Оказалось, что плазмида pCR 2.1-uvrD⁺ может компенсировать дефект не только в геликазе II, но в разной степени и в других геликазах: HelD, Rep и RecQ, повышая выживаемость в 1,3 2,2 и 1,9 раза соответственно (см. рис. 1 и табл. 2). Плазмида pCR 2.1-uvrD_Ec⁺ не влияла на радиоустойчивость мутантов helD, rep и recQ (данные не представлены).

Наибольший эффект наблюдался в трансформанте rep/pCR 2.1-uvrD⁺, который стал статистически близок по значениям устойчивости к дикому типу (см. рис. 1, кривая 8).

Опыты для определения радиочувствительности были проведены и с использованием γ-лучей (рис. 2 и табл. 2). Защитный эффект плазмиды pCR 2.1-uvrD⁺ был менее выражен и отсутствовал в случае мутанта rep, который исходно оказался достаточно радиоустойчивым к γ-лучам. Наблюдаемые различия могут быть связаны с разным спектром повреждений ДНК после УФ- и γ-облучения.

1 — uvrD (); 2 — uvrD/pCR 2.1-uvrD⁺ (▲ ); 3 — recQ (○ ); 4 — recQ/pCR 2.1-uvrD⁺ (); 5 —helD (); 6 — helD/pCR 2.1-uvrD⁺ (■); 7 — rep (); 8 — rep/pCR 2.1-uvrD⁺ (♦ ); 9 — AB1157 (); 10 — AB1157/pCR 2.1-uvrD⁺ (); 11 — uvrD/pCR 2.1-uvrD_Ec⁺ (▼ ).

По оси абcцисс — доза облучения (кГр); по оси ординат — выживаемость (lgS).

Для объяснения регистрируемого эффекта от присутствия в клетках E. coli белка drUvrD было проведено выравнивание первичной последовательности геликазы II D. radiodurans c 4 геликазами E. coli с использованием программы BLASTP Национального центра биотехнологической информации (США). Идентичность составила 35% для пары drUvrD/ecUvrD, 38% — для drUvrD/ecRep и 27% — для drUvrD/ecHelD. Однако характерные мотивы геликазы II [9], представленные 7 элементами, оказались весьма консервативными. Они практически совпадают у геликаз drUvrD, ecUvrD, ecRep и ecHelD. Особый случай представляет геликаза ecRecQ, у которой из всей последовательности только один небольшой участок на C-конце, присущий всем геликазам, совпадает с drUvrD.

Таким образом, при клонировании и изучении свойств геликазы UvrD D. radiodurans в мутантных клетках E. coli установлена ее способность компенсировать дефекты в целом ряде геликаз, участвующих в различных процессах: репарации, репликации и рекомбинации.

Роль геликазы UvrD широко охарактеризована в ЭРН и коррекции ошибочно-спаренных оснований в E. coli [10, 11]. Ранее было установлено, что инактивация геликазы II заметно уменьшает радиорезистентность деинококка и сильно задерживает кинетику репарации ДР [3]. Маловероятно, что чувствительность к γ-излучению клеток D. radiodurans uvrD связана с дефектом пути ЭРН, потому что мутантные бактерии, дефектные по гену uvrA, сохраняют выживаемость на уровне дикого типа после облучения ионизирующей радиацией [3]. Предполагается, что UvrD вовлечена в ESDSA, однако в E. coli главной на RecF-пути рекомбинационной репарации считается геликаза RecQ в комплексе с экзонуклеазой RecJ [2]. Геликазы HelD и UvrD рассматриваются как альтернатива RecQ [12].

Первостепенная роль ДНК-геликазы II связана с ее способностью связывать и расплетать специфические структуры, соответствующие интермедиатам репарационных и других процессов. С этой точки зрения имеет значение субстратная специфичность UvrD.

Биохимические исследования показали, что UvrD D. radiodurans — активная ДНК-стимулируемая АТФаза, которая также располагает АТФ-зависимой транслоказной и геликазной активностями [13]. Исследования in vitro продемонстрировали, что белок drUvrD транслоцируется вдоль онДНК в направлении 3′—5′ как и ecUvrD [14], и, несмотря на то что принадлежит к семейству геликаз с 3’—5’-полярностью, может расплетать дуплексную ДНК в обоих 3′—5′ и 5′—3′ направлениях [15]. Интересно то, что транслоказная и биполярная геликазная активность drUvrD модулируется связывающим онДНК белком SSB (что характерно для RecQ E. coli [16]). drUvrD также демонстрирует слабую геликазную активность в отношении ДНК с тупыми концами.

Эти свойства геликазы UvrD D. radiodurans объясняют ее способность компенсировать не только дефект в гене uvrD E. coli, но и в генах rep и recQ. Rep — геликаза с предпочтением к лидирующей нити ДНК. Она играет важную роль в репликации ДНК [17]. Rep и UvrD — две связанные геликазы E. coli, и инактивация одновременно обоих летальна [7]. Вклад геликазы UvrD в обеспечение жизнеспособности клеток подчеркивает то обстоятельство, что сочетание мутаций в гене uvrD и гене polA, кодирующем ДНК-полимеразу I, также летально [18]. Геликаза UvrD способна вытеснять олигонуклеотиды из синтетической репликативной вилки ДНК in vitro и необходима для выживаемости в отсутствие геликазы Rep, ассоциированной с процессингом репликативных вилок. Можно предполагать, что геликаза UvrD может обеспечивать регрессию репликативных вилок и облегчать рестарт репликативной вилки после остановки. Весьма примечателен радиозащитный эффект экспрессии UvrD D. radiodurans на фоне мутации recQ E. coli. In vitro геликаза RecQ связывает и расплетает множество различных субстратов ДНК [19]. ДНК с однонитевым хвостом, ДНК с брешью, двуцепочечная ДНК с тупыми концами и ковалентно-замкнутая двуцепочечная ДНК — все они расплетаются RecQ. Это указывает на то, что данная геликаза может функционировать на множестве интермедиатов, вовлеченных в метаболизм ДНК. RecQ — одна из немногочисленных геликаз, которой не требуется однонитевой участок для входа в двуцепочечную ДНК [20].

Таким образом, субстратная специфичность геликазы UvrD D. radiodurans в значительной степени совпадает с предпочтениями геликазы RecQ E. coli. Существенные различия в аминокислотных последовательностях drUvrD и ecRecQне препятствуют функциональной комплементации и объясняются принадлежностью RecQ к другому семейству геликаз SF2 [21]. Вклад геликазы UvrD D. radiodurans в восстановление радиоустойчивости мутантов rep, recQ и helD E. coli может быть связан с активацией репликации по модели рекомбинационной репарации ДР, сопряженной с рестартом синтеза ДНК [22].

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.