Миронова Л.В.

ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, Иркутск, Россия, 664047

Пономарева А.С.

ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, Иркутск, Россия, 664047

Хунхеева Ж.Ю.

ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, Иркутск, Россия, 664047

Гладких А.С.

ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, Иркутск, Россия, 664047

Балахонов С.В.

ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, Иркутск, Россия, 664047

Генетическое разнообразие Vibrio cholerae О1 El Tor при эпидемических осложнениях в Сибирском и Дальневосточном регионах

Авторы:

Миронова Л.В., Пономарева А.С., Хунхеева Ж.Ю., Гладких А.С., Балахонов С.В.

Подробнее об авторах

Прочитано: 2243 раза


Как цитировать:

Миронова Л.В., Пономарева А.С., Хунхеева Ж.Ю., Гладких А.С., Балахонов С.В. Генетическое разнообразие Vibrio cholerae О1 El Tor при эпидемических осложнениях в Сибирском и Дальневосточном регионах. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(4):165‑172.
Mironova LV, Ponomareva AS, Khunkheeva ZhYu, Gladkikh AS, Balakhonov SV. Genetics diversity of Vibrio cholerae O1 El Tor during epide- mic complications in Siberian and the Far Eastern regions. Molecular Genetics, Microbiology and Virology. 2019;37(4):165‑172. (In Russ.)
https://doi.org/10.17116/molgen201937041165

Рекомендуем статьи по данной теме:
Нес­та­биль­ность ге­но­ма воз­бу­ди­те­ля хо­ле­ры: роль в эво­лю­ции па­то­ген­нос­ти, ле­карствен­ной ус­той­чи­вос­ти и адап­та­ции к ме­ня­ющей­ся сре­де оби­та­ния. Мо­ле­ку­ляр­ная ге­не­ти­ка, мик­ро­би­оло­гия и ви­ру­со­ло­гия. 2025;(2):3-13

Эпидемические проявления холеры в Сибири и на Дальнем Востоке России в период седьмой пандемии регистрировались в виде отдельных случаев завоза инфекции на территорию или ассоциированных с завозом острых местных вспышек в 1970-е и 1990-е годы. В частности, в 1970-е годы протекали крупные вспышки холеры в Омске, Новосибирске и Барнауле. В 1990-е годы были зарегистрированы завозы инфекции в Омске, Новосибирске, Барнауле (1994 г.), Иркутске и Ачинске (1997 г.), Уссурийске, Владивостоке, Южно-Сахалинске (1999 г.) и вспышки — во Владивостоке и Южно-Сахалинске в 1999 г. [1—3].

Ретроспективный анализ особенностей структурной организации детерминант патогенности в геномах, изолированных при эпидемических осложнениях в регионе штаммов возбудителя холеры, показал дифференциацию их на группы в зависимости от периода пандемии [4]. При этом было показано, что этиологическим агентом холеры в Сибири и на Дальнем Востоке в 1990-е годы послужили атипичные генетически измененные варианты вибриона Эль-Тор с классической аллелью гена субъединицы В холерного токсина, характеризующиеся вариабельностью дополнительных ассоциированных с патогенностью детерминант. Однако генотипирование V. cholerae по комплексу указанных детерминант позволяет идентифицировать лишь крупные кластеры штаммов, распределение на которые согласуется с периодом и направлением завоза возбудителя на территорию. Вместе с тем для понимания закономерностей развития осложнений по холере на территории, реконструкции эпидемической цепи и установления родства разных групп штаммов необходимо дальнейшее изучение генетического разнообразия популяций патогена.

Известно, что углубленная молекулярно-генетическая характеристика микробных патогенов основывается на изучении отдельных локусов генома с применением различных подходов к молекулярному типированию. Один из таких подходов — мультилокусный анализ числа вариабельных тандемных повторов (MLVA — Multiple Locus Variable-Number Tandem Repeats Analysis) в геноме микроорганизмов, достаточно широко используется в молекулярной эпидемиологии инфекционных болезней, изучении популяционной динамики возбудителей, оценке их генетического разнообразия [5, 6]. Метод характеризуется относительной простотой выполнения протокола, хорошей воспроизводимостью, высокой дискриминирующей способностью и возможностью межлабораторного сопоставления результатов. В геноме холерного вибриона, как и ряда других микроорганизмов, идентифицированы содержащие короткие повторяющиеся последовательности участки, используемые в качестве мишеней для MLVA-типирования [7, 8].

С учетом изложенного цель исследования — изучение генетического разнообразия и родства штаммов V. cholerae O1 El Tor, выделенных в завозных очагах и в период вспышек холеры в Сибири и на Дальнем Востоке, на основе мультилокусного анализа числа вариабельных тандемных повторов.

Материал и методы

Штаммы. В исследование включено 83 штамма V. cholerae О1 El Tor, изолированных от больных, вибриононосителей и из объектов окружающей среды в завозных очагах и в период вспышек холеры в Сибири и на Дальнем Востоке. Кроме того, проведен анализ 4 изолятов V. cholerae О1 классического биовара, 4 нетоксигенных изолированных от людей в период эпидемиологического благополучия V. cholerae О1 El Tor (группа сравнения), 2 контрольных штаммов классического и Эль Тор биоваров.

Экстракцию ДНК штаммов V. cholerae осуществляли c использованием коммерческого набора для выделения нуклеиновых кислот Рибо-Преп («Амплисенс», Москва). Качество выделения ДНК оценивали электрофоретически в 0,9% агарозном геле, концентрацию — спектрофотометрически на NanoVue Plus («GE Health Care», США).

MLVA-типирование. Амплификацию локусов вариабельных тандемных повторов V. choleraе (VcA, VcB, VcС, VcD, VcG) осуществляли с использованием стандартных наборов для амплификации ДНК («Синтол», Москва) и предложенных А.С. Водопьяновым и соавт. [7] последовательностей праймеров, меченных флуоресцентными красителями (в структуру праймеров к локусу VcA включена флуоресцентная метка FAM, к VcB — R6G, к VcC и VcG — TAMRA, к VcD — ROX).

Размер ампликонов устанавливали методом капиллярного электрофореза на ДНК-анализаторе ABI Prism 3130 Genetic Analyzer с использованием программного пакета GeneMapper 4.0 в сравнении с маркером молекулярной массы GeneScan™ 500 LIZ™ Size Standard. Расчет числа повторов в геноме исследуемых штаммов V. choleraе осуществляли в сравнении с таковым маркерного штамма, для которого структура локусов определена секвенированием. В качестве маркерного использовали штамм V. choleraе О1 El Tor И-1300. Аллельный профиль его определен как VcA7_VcB21_VcC9_VcD7_VcG8.

MLVA-генотип исследуемых штаммов V. choleraе определяли как совокупность аллельных вариантов каждого локуса и представляли в виде числового паттерна с последовательностью локусов — VcA_VcB_VcС_VcD_VcG.

Кластерный анализ результатов MLVA проводили по алгоритмам UPGMA (Unweighted Pair-Group Method using Arithmetic averages — попарное невзвешенное кластирование с арифметическим усреднением) и MST (minimum spanning tree — минимальное остовное дерево) для категориальных данных с использованием инструментов программного комплекса BioNumerics версии 6.0−7.5 («Applied Maths», Бельгия).

Дискриминирующую способность MLVA-типи-рования определяли на основании расчета индекса Хантера—Гастона [9].

Аллельный полиморфизм локусов оценивали посредством расчета индекса аллельного полиморфизма h по формуле:

h=1–Sx2i[n/ni–1],

где xi — частота встречаемости аллели i в локусе и n — число штаммов, имеющих аллельный вариант i.

Результаты

Исследование структуры пяти локусов вариабельных тандемных повторов показало, что в данной выборке штаммов V. cholerae О1 максимальным полиморфизмом характеризуется локус VcВ, минимальным — VcC (табл. 1).

Таблица 1. Аллельный полиморфизм локусов вариабельных тандемных повторов в исследованных штаммах V. cholerae О1

На дендрограмме, построенной по алгоритму UPGMA, определено 34 генотипа, в том числе 23 — уникальных. Индекс Хантера—Гастона составляет 0,750.

При анализе по алгоритму MST все исследованные штаммы V. cholerae О1 El Tor распределены по семи кластерам (рис. 1).

Рис. 1. Дендрограмма, построенная по алгоритму MST на основании анализа пяти локусов вариабельных тандемных повторов в геноме исследуемых штаммов V. cholerae О1 El Tor.
В I кластер вошли практически все изоляты, выделенные на вспышках и в завозных очагах в Сибири в 70-е годы прошлого столетия. По структуре детерминант патогенности эти штаммы относятся к типичным представителям биовара Эль Тор с ctxB3 аллелью гена субъединицы В холерного токсина. В данном кластере дифференцируются два близкородственных комплексных генотипа. При этом один из них, наряду с доминирующим MLVA-профилем (20_24_8_6_7), включает группу однолокусных вариантов (SLV — single locus variant), дифференцирующихся от основного профиля по структуре одного из локусов. Полиморфизм структуры в однолокусных вариантах идентифицирован на участках VcA (в двух случаях увеличение или уменьшение на один повтор) и VcB (сдвиг в сторону увеличения на два—три повтора — VcB26, VcB27) при стабильной структуре остальных локусов. Следует отметить, что к числу SLV относится спонтанный мутант (утративший гены холерного токсина) токсигенного штамма V. cholerae О1 El Tor, изолированного от хронического вибрионосителя в Омске в 1973 г. — изменение его профиля заключалось в увеличении кратности повторяющихся единиц VcB. Другой спонтанный мутант V. cholerae О1 El Tor оказался дистанцированным от I кластера штаммов в связи с отличием его аллельной формулы по двум локусам — VcA и VcС.

Существенно дистанцированные от кластера I кластеры II—VI образованы генетически измененными вариантами холерного вибриона биовара Эль-Тор с классической аллелью гена ctxB. Кластеры II—IV вв.ключают изоляты из завозных очагов в Сибири в 1994 г. При этом кластер II объединяет штаммы V. cholerae О1 El Tor, выделенные в завозных очагах в Омске и Барнауле, эпидрасследование установило их связь с завозом инфекции из Индии. Спонтанный мутант одного из этих штаммов с делецией протяженного участка первой хромосомы (в области мобильных генетических элементов, несущих детерминанты патогенности) демонстрирует изменение MLVA-профиля в сравнении с исходным вариантом по типу дупликации в локусе VcA (исходный профиль 16_9_9_7_6, измененный — 17_9_9_7_6). Пять других штаммов V. cholerae О1 El Tor, выделенных в 1994 г. в Омске, Новосибирске, Барнауле и ассоциированных с завозом из Турции, сгруппировались в два близкородственных кластера — III и IV.

Пятый кластер сформирован штаммами V. cholerae О1 El Tor, выделенными в 1997 г. от двух больных и одного вибриононосителя в Иркутске и Ачинске. При эпидемиологическом расследовании этих случаев холеры было установлено, что заболевшие прибыли на территорию России железнодорожным транспортом (поезд Ташкент—Иркутск) из Казахстана.

Наиболее крупный VI кластер включает в себя все исследуемые штаммы V. cholerae О1 El Tor, выделенные в период эпидемических осложнений на Дальнем Востоке в 1999 г. Этот кластер представлен тремя близкородственными комплексными генотипами, объ-единяющими 20, 14 и 10 штаммов, и группой их однолокусных вариантов (см. рис. 1). Доминирующий генотип кластера, аллельный профиль которого охарактеризован как 7_22_9_7_8, представлен штаммами, изолированными от больного в завозном очаге, от больных, вибриононосителей и из объектов окружающей среды в разных очагах в период вспышки холеры в Южно-Сахалинске (табл. 2).

Таблица 2. MLVA-генотипы штаммов V. cholerae О1 El Tor, выделенных в Приморском крае и Южно-Сахалинске в 1999 г. Примечание. * SLV — single locus variant (однолокусный вариант); DLV — double locus variant (двухлокусный вариант); ** — нетоксигенный штамм V. cholerae О1 El Tor, выделенный от вибриононосителя в завозном очаге; полужирным выделены вариабельные локусы.
Два других крупных генотипа включают преимущественно штаммы из Приморского края (завозные очаги в Уссурийске и Владивостоке и вспышка во Владивостоке) за исключением одного изолята от больного в Южно-Сахалинске. Однолокусные варианты этих генотипов несут в большинстве случаев вариабельную аллель локуса VcB (пять штаммов), в двух случаях идентифицированы варианты по локусам VcD (один штамм), VcG (один штамм). В кластере VI присутствует лишь один двухлокусный вариант (DLV — double locus variant) с измененными аллелями VcB и VcD (см. табл. 2).

Седьмой, существенно дистанцированный от всех указанных выше, кластер на дендрограмме объединяет нетоксигенные штаммы, выделенные от больных острыми кишечными инфекциями или транзиторных вибриононосителей в период эпидемиологического благополучия и от хронического вибриононосителя в Омске в 1973 г. Их MLVA-профили характеризуются значительным отличием от токсигенных V. cholerae О1 El Tor как по составу локусов (отсутствие в геноме локуса VcB), так и по структурной организации (значительно большее число повторов в локусе VcC и меньшее в VcD и VcG в сравнении с токсигенными штаммами). Изолированный в завозном очаге в Южно-Сахалинске в 1999 г. нетоксигенный штамм локализуется на той же ветви дендрограммы, что и кластер нетоксигенных V. cholerae. Вибрионы классического биовара формируют на дендрограмме отдельные узлы, наиболее приближенные к генетически измененным вариантам биовара Эль Тор (см. рис. 1).

Обсуждение

Изучение генетического разнообразия популяций токсигенных штаммов V. cholerae в период эпидемических осложнений в Сибирском и Дальневосточном регионах выявило кластеризацию их на генотипы в зависимости от структуры детерминант патогенности (типичные и атипичные генетически измененные вибрионы Эль Тор). Дифференциация атипичных V. cholerae О1 El Tor ассоциируется, в свою очередь, с установленным временем и направлением завоза. Так, в отдельные кластеры распределились изолированные в завозных очагах в Сибири в 1994 и 1997 г. штаммы: II кластер образован завозными из Индии штаммами, два близкородственных кластера III и IV — штаммами из Турции, кластер V — штаммами из Казахстана. Изоляты периода эпидемических осложнений на Дальнем Востоке 1999 г. объ-единены в отдельный кластер с тремя комплексными генотипами (с их одно- и двухлокусными вариантами). Подобное распределение на различные MLVA-генотипы в зависимости от структуры и локализации СТХ профага показано S. Choi и соавт. [10] при исследовании выделенных в разные периоды пандемии штаммов V. cholerae. При этом максимальная неоднородность также оказалась характерна для атипичных вариантов вибриона Эль Тор. Гетерогенность популяции генетически измененных V. cholerae El Tor установлена Т.А. Кульшань и соавт. [11] при мультилокусном анализе вариабельных тандемных повторов предпандемичных и пандемичных штаммов V. cholerae El Tor, изолированных в разных регионах России, а также в странах ближнего и дальнего зарубежья. Более того, Н.И. Смирновой и соавт. [12] показано, что распределение на кластеры геновариантов вибриона Эль Тор ассоциировано с особенностями организации острова пандемичности VSP-II.

Анализ MLVA-профилей V. cholerae О1 El Tor в пределах отдельных вспышек на Дальнем Востоке также показал гетерогенность популяций этиологического агента, однако строгого соответствия генотипа очагу инфекции не установлено. В частности, на вспышке в Южно-Сахалинске доминирующий генотип (7_22_9_7_8) был идентифицирован во всех анализируемых очагах холеры, а его однолокусные варианты (с изменением структуры локуса VcB) — преимущественно в первом наиболее крупном очаге. Во Владивостоке в период вспышки широко распространились штаммы V. cholerae О1 El Tor двух MLVA-профилей, различающиеся на один повтор в локусе VcB. При этом клинические штаммы в первом очаге и при связанном с ним случаях отнесены к одному генотипу (аллель VcB23), во втором очаге — к двум генотипам (аллели VcB23 и VcB24). Учитывая временной интервал между случаями заболевания в очагах, составляющий практически 1 мес, можно предположить распространение V. cholerae О1 El Tor из первого очага и последующее инфицирование людей во втором очаге. Однако идентифицировать среди исследованных штаммов варианты с аллелью VcB23 из объектов окружающей среды второго очага не удалось. Распространенный в объектах окружающей среды второго очага V. cholerae О1 El Tor с аллелью VcB24 мог оказаться производным варианта возбудителя из первого очага.

С учетом изложенного, эпидемические осложнения по холере на Дальнем Востоке в 1999 г. были обус-ловлены V. cholerae О1 El Tor с идентичной структурой четырех локусов — VcA, VcC, VcD, VcG и специ-фичным для конкретной территории числом повторов в локусе VcВ: в Южно-Сахалинске — 22 повтора, во Владивостоке — 23—24 повтора. Исключение составляет лишь выделенный в наиболее крупном очаге в Южно-Сахалинске изолят V. cholerae О1 El Tor с генотипом, распространенным во Владивостоке. В соответствии со сложившимся подходом к анализу генетического родства штаммов, по результатам MLVA-типирования к клональным генетически связанным относят изоляты с идентичным аллельным профилем или однолокусные варианты c изменением структуры одного из локусов [13—15]. На основании этого можно заключить, что обусловившие эпидемические осложнения на Дальнем Востоке в 1999 г. варианты возбудителя холеры относятся к генетически родственным клональным. Вместе с тем доминирование на отдельных территориях (Южно-Сахалинск, Приморский край) штаммов специфических генотипов дает основание судить о том, что имел место завоз различных клональных вариантов возбудителя. Идентификация же однолокусных вариантов на территории может быть результатом дивергенции возбудителя в период вспышки. Подтверждением потенциальной возможности трансформации MLVA-генотипа штаммов V. cholerae служит обнаружение однолокусных вариантов среди спонтанных лабораторных мутантов, утративших гены холерного токсина при пассаже на питательных средах, а также установленная ранее [16] способность к изменению генотипа холерного вибриона в экспериментальных условиях.

Полученные нами результаты по полиморфизму структуры локусов вариабельных тандемных повторов V. cholerae О1 El Tor в период вспышек холеры согласуются с представленными в отечественной и зарубежной литературе данными молекулярно-эпидемиологического анализа. В частности, неоднородность MLVA-профиля V. cholerae О1, связанная с вариабельностью структуры локуса VcB, установлена на вспышке холеры в Казани [17]. Диверсификация исходного клона определена в период эпидемической вспышки холеры в Демократической Республике Конго, продолжавшейся в течение 2011—2012 гг. Изоляты одного MLVA-профиля и их однолокусные варианты были идентифицированы в первую неделю вспышки, затем произошла клональная дивергенция возбудителя параллельно с пространственно-временным распространением вспышки на территории [18]. В период вспышки холеры в Гане в 2014 г. идентифицированы одно- и двухлокусные варианты V. cholerae О1, входящие в один клональный комплекс [19]. Полиморфизм аллельных профилей как в течение одной вспышки, так и в динамике в одном очаге и в образцах клинического материала от одного больного установлен при изучении генетического родства штаммов холерного вибриона в Бангладеш [14, 20, 21]. Следует заметить, что в клиническом материале от контактировавших с больным в очаге обнаруживались не только однолокусные варианты V. cholerae, но и генетически не связанные со штаммом от больного изоляты с различием по трем, четырем и пяти локусам [20]. Такие данные позволяют судить о клональном полиморфизме возбудителя, циркулирующего в очагах инфекции на эндемичных территориях. Однако выделение от больных в очаге в Бангладеш и в более поздние сроки исследования от контактировавших с больными V. cholerae О1 с идентичным или сходным аллельным профилем свидетельствует о селективном преимуществе отдельных клональных вариантов возбудителя. Клональная гетерогенность установлена также на вспышках холеры в двух сельских районах Бангладеш [22]. В то же время Н. Zhou и соавт. [23] при анализе зарегистрированных в Китае эпидемических осложнений показали высокую клональность штаммов V. cholerae на каждой из 7 анализируемых вспышек с идентификацией субклона лишь в одном случае (редукция одного повтора в локусе Vc0437, соответствующему VcD).

Установленное отсутствие строгой территориальной приуроченности MLVA-генотипов вспышечных штаммов V. cholerae, возможность трансформации аллельного профиля свидетельствуют о недостаточной эффективности основанного на анализе 5 локусов вариабельных тандемных повторов подхода к типированию возбудителя холеры при углубленном анализе отдельных эпидемических осложнений. Однако согласованность MLVA-профиля с периодом и направ-лением импортации возбудителя определяет метод в качестве информативного при анализе завозов уникальных клонов на территорию в рамках долгосрочного эпидемиологического анализа. В данном контексте оказалась информативно сокращенная схема MLVA-типирования по трем локусам (VcС, VcD, VcG): дифференциация сибирских и дальневосточных токсигенных штаммов V. cholerae на группы при таком подходе согласуется с установленным по результатам полногеномного секвенирования распределением их на волны 7-й пандемии [24] (рис. 2),

Рис. 2. UPGMA-денодрограмма, построенная на основании выборочного анализа исследуемых штаммов по трем локусам (VcC, VcD, VcG). I, II, III — волны распространения холеры; * — штаммы V. cholerae О1 El Tor, для которых определена нуклеотидная последовательность генома [24].
впервые описанные A. Mutreja и соавт. [25]. Корреляция результатов MLVA-типирования с распределением на генотипы на основании анализа полных геномов возбудителя холеры показана при изучении закономерностей распространения возбудителя во время крупных осложнений на эндемичных территориях Бангладеш [26], Мозамбика [27], что определяет актуальность дальнейшего изучения особенностей геномной структуры возбудителя холеры с применением технологий высокопроизводительного секвенирования.

Заключение

Изолированные при осложнениях по холере в Сибирском и Дальневосточном регионах России штаммы V. cholerae О1 El Tor характеризуются установленной на основании MLVA-типирования гетерогенностью генетической организации, согласующейся с периодом и направлением их завоза на территорию. При отдельных вспышках холеры выяв-лена клональность этиологического агента с идентификацией близкородственных субклонов, формирование которых могло быть результатом пребывания возбудителя в объектах окружающей среды или пассажа через восприимчивый организм.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Миронова Л.В. — e-mail: mironova-lv@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-8481-6442

Пономарева А.С. — e-mail: ackozh@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-0674-6159

Хунхеева Ж.Ю. — e-mail: khunkheeva2015@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-5388-4300

Гладких А.С. — e-mail: angladkikh@gmail.com; https://orcid.org/0000-0001-6759-1907

Балахонов С.В. — e-mail: balakhonov.irk@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-4201-5828

Автор, ответственный за переписку:

Миронова Лилия Валерьевна — д.м.н., заведующая лабораторией холеры ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора; 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78; e-mail: mironova-lv@yandex.ru

Как цитировать:

Миронова Л.В., Пономарева А.С., Хунхеева Ж.Ю., Гладких А.С., Балахонов С.В. Генетическое разнообразие Vibrio cholerae О1 El Tor при эпидемических осложнениях в Сибирском и Дальневосточном регионах. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(4):165-172. https://doi.org/10.17116/molgen201937041

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail

Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.