Эпидемические проявления холеры в Сибири и на Дальнем Востоке России в период седьмой пандемии регистрировались в виде отдельных случаев завоза инфекции на территорию или ассоциированных с завозом острых местных вспышек в 1970-е и 1990-е годы. В частности, в 1970-е годы протекали крупные вспышки холеры в Омске, Новосибирске и Барнауле. В 1990-е годы были зарегистрированы завозы инфекции в Омске, Новосибирске, Барнауле (1994 г.), Иркутске и Ачинске (1997 г.), Уссурийске, Владивостоке, Южно-Сахалинске (1999 г.) и вспышки — во Владивостоке и Южно-Сахалинске в 1999 г. [1—3].

Ретроспективный анализ особенностей структурной организации детерминант патогенности в геномах, изолированных при эпидемических осложнениях в регионе штаммов возбудителя холеры, показал дифференциацию их на группы в зависимости от периода пандемии [4]. При этом было показано, что этиологическим агентом холеры в Сибири и на Дальнем Востоке в 1990-е годы послужили атипичные генетически измененные варианты вибриона Эль-Тор с классической аллелью гена субъединицы В холерного токсина, характеризующиеся вариабельностью дополнительных ассоциированных с патогенностью детерминант. Однако генотипирование V. cholerae по комплексу указанных детерминант позволяет идентифицировать лишь крупные кластеры штаммов, распределение на которые согласуется с периодом и направлением завоза возбудителя на территорию. Вместе с тем для понимания закономерностей развития осложнений по холере на территории, реконструкции эпидемической цепи и установления родства разных групп штаммов необходимо дальнейшее изучение генетического разнообразия популяций патогена.

Известно, что углубленная молекулярно-генетическая характеристика микробных патогенов основывается на изучении отдельных локусов генома с применением различных подходов к молекулярному типированию. Один из таких подходов — мультилокусный анализ числа вариабельных тандемных повторов (MLVA — Multiple Locus Variable-Number Tandem Repeats Analysis) в геноме микроорганизмов, достаточно широко используется в молекулярной эпидемиологии инфекционных болезней, изучении популяционной динамики возбудителей, оценке их генетического разнообразия [5, 6]. Метод характеризуется относительной простотой выполнения протокола, хорошей воспроизводимостью, высокой дискриминирующей способностью и возможностью межлабораторного сопоставления результатов. В геноме холерного вибриона, как и ряда других микроорганизмов, идентифицированы содержащие короткие повторяющиеся последовательности участки, используемые в качестве мишеней для MLVA-типирования [7, 8].

С учетом изложенного цель исследования — изучение генетического разнообразия и родства штаммов V. cholerae O1 El Tor, выделенных в завозных очагах и в период вспышек холеры в Сибири и на Дальнем Востоке, на основе мультилокусного анализа числа вариабельных тандемных повторов.

Штаммы. В исследование включено 83 штамма V. cholerae О1 El Tor, изолированных от больных, вибриононосителей и из объектов окружающей среды в завозных очагах и в период вспышек холеры в Сибири и на Дальнем Востоке. Кроме того, проведен анализ 4 изолятов V. cholerae О1 классического биовара, 4 нетоксигенных изолированных от людей в период эпидемиологического благополучия V. cholerae О1 El Tor (группа сравнения), 2 контрольных штаммов классического и Эль Тор биоваров.

Экстракцию ДНК штаммов V. cholerae осуществляли c использованием коммерческого набора для выделения нуклеиновых кислот Рибо-Преп («Амплисенс», Москва). Качество выделения ДНК оценивали электрофоретически в 0,9% агарозном геле, концентрацию — спектрофотометрически на NanoVue Plus («GE Health Care», США).

MLVA-типирование. Амплификацию локусов вариабельных тандемных повторов V. choleraе (VcA, VcB, VcС, VcD, VcG) осуществляли с использованием стандартных наборов для амплификации ДНК («Синтол», Москва) и предложенных А.С. Водопьяновым и соавт. [7] последовательностей праймеров, меченных флуоресцентными красителями (в структуру праймеров к локусу VcA включена флуоресцентная метка FAM, к VcB — R6G, к VcC и VcG — TAMRA, к VcD — ROX).

Размер ампликонов устанавливали методом капиллярного электрофореза на ДНК-анализаторе ABI Prism 3130 Genetic Analyzer с использованием программного пакета GeneMapper 4.0 в сравнении с маркером молекулярной массы GeneScan™ 500 LIZ™ Size Standard. Расчет числа повторов в геноме исследуемых штаммов V. choleraе осуществляли в сравнении с таковым маркерного штамма, для которого структура локусов определена секвенированием. В качестве маркерного использовали штамм V. choleraе О1 El Tor И-1300. Аллельный профиль его определен как VcA7_VcB21_VcC9_VcD7_VcG8.

MLVA-генотип исследуемых штаммов V. choleraе определяли как совокупность аллельных вариантов каждого локуса и представляли в виде числового паттерна с последовательностью локусов — VcA_VcB_VcС_VcD_VcG.

Кластерный анализ результатов MLVA проводили по алгоритмам UPGMA (Unweighted Pair-Group Method using Arithmetic averages — попарное невзвешенное кластирование с арифметическим усреднением) и MST (minimum spanning tree — минимальное остовное дерево) для категориальных данных с использованием инструментов программного комплекса BioNumerics версии 6.0−7.5 («Applied Maths», Бельгия).

Дискриминирующую способность MLVA-типи-рования определяли на основании расчета индекса Хантера—Гастона [9].

Аллельный полиморфизм локусов оценивали посредством расчета индекса аллельного полиморфизма h по формуле:

h=1–Sx²_i[ⁿ/_ni–1],

где x_i — частота встречаемости аллели i в локусе и n — число штаммов, имеющих аллельный вариант i.

Исследование структуры пяти локусов вариабельных тандемных повторов показало, что в данной выборке штаммов V. cholerae О1 максимальным полиморфизмом характеризуется локус VcВ, минимальным — VcC (табл. 1).

На дендрограмме, построенной по алгоритму UPGMA, определено 34 генотипа, в том числе 23 — уникальных. Индекс Хантера—Гастона составляет 0,750.

При анализе по алгоритму MST все исследованные штаммы V. cholerae О1 El Tor распределены по семи кластерам (рис. 1).

Существенно дистанцированные от кластера I кластеры II—VI образованы генетически измененными вариантами холерного вибриона биовара Эль-Тор с классической аллелью гена ctxB. Кластеры II—IV вв.ключают изоляты из завозных очагов в Сибири в 1994 г. При этом кластер II объединяет штаммы V. cholerae О1 El Tor, выделенные в завозных очагах в Омске и Барнауле, эпидрасследование установило их связь с завозом инфекции из Индии. Спонтанный мутант одного из этих штаммов с делецией протяженного участка первой хромосомы (в области мобильных генетических элементов, несущих детерминанты патогенности) демонстрирует изменение MLVA-профиля в сравнении с исходным вариантом по типу дупликации в локусе VcA (исходный профиль 16_9_9_7_6, измененный — 17_9_9_7_6). Пять других штаммов V. cholerae О1 El Tor, выделенных в 1994 г. в Омске, Новосибирске, Барнауле и ассоциированных с завозом из Турции, сгруппировались в два близкородственных кластера — III и IV.

Пятый кластер сформирован штаммами V. cholerae О1 El Tor, выделенными в 1997 г. от двух больных и одного вибриононосителя в Иркутске и Ачинске. При эпидемиологическом расследовании этих случаев холеры было установлено, что заболевшие прибыли на территорию России железнодорожным транспортом (поезд Ташкент—Иркутск) из Казахстана.

Наиболее крупный VI кластер включает в себя все исследуемые штаммы V. cholerae О1 El Tor, выделенные в период эпидемических осложнений на Дальнем Востоке в 1999 г. Этот кластер представлен тремя близкородственными комплексными генотипами, объ-единяющими 20, 14 и 10 штаммов, и группой их однолокусных вариантов (см. рис. 1). Доминирующий генотип кластера, аллельный профиль которого охарактеризован как 7_22_9_7_8, представлен штаммами, изолированными от больного в завозном очаге, от больных, вибриононосителей и из объектов окружающей среды в разных очагах в период вспышки холеры в Южно-Сахалинске (табл. 2).

Седьмой, существенно дистанцированный от всех указанных выше, кластер на дендрограмме объединяет нетоксигенные штаммы, выделенные от больных острыми кишечными инфекциями или транзиторных вибриононосителей в период эпидемиологического благополучия и от хронического вибриононосителя в Омске в 1973 г. Их MLVA-профили характеризуются значительным отличием от токсигенных V. cholerae О1 El Tor как по составу локусов (отсутствие в геноме локуса VcB), так и по структурной организации (значительно большее число повторов в локусе VcC и меньшее в VcD и VcG в сравнении с токсигенными штаммами). Изолированный в завозном очаге в Южно-Сахалинске в 1999 г. нетоксигенный штамм локализуется на той же ветви дендрограммы, что и кластер нетоксигенных V. cholerae. Вибрионы классического биовара формируют на дендрограмме отдельные узлы, наиболее приближенные к генетически измененным вариантам биовара Эль Тор (см. рис. 1).

Изучение генетического разнообразия популяций токсигенных штаммов V. cholerae в период эпидемических осложнений в Сибирском и Дальневосточном регионах выявило кластеризацию их на генотипы в зависимости от структуры детерминант патогенности (типичные и атипичные генетически измененные вибрионы Эль Тор). Дифференциация атипичных V. cholerae О1 El Tor ассоциируется, в свою очередь, с установленным временем и направлением завоза. Так, в отдельные кластеры распределились изолированные в завозных очагах в Сибири в 1994 и 1997 г. штаммы: II кластер образован завозными из Индии штаммами, два близкородственных кластера III и IV — штаммами из Турции, кластер V — штаммами из Казахстана. Изоляты периода эпидемических осложнений на Дальнем Востоке 1999 г. объ-единены в отдельный кластер с тремя комплексными генотипами (с их одно- и двухлокусными вариантами). Подобное распределение на различные MLVA-генотипы в зависимости от структуры и локализации СТХ профага показано S. Choi и соавт. [10] при исследовании выделенных в разные периоды пандемии штаммов V. cholerae. При этом максимальная неоднородность также оказалась характерна для атипичных вариантов вибриона Эль Тор. Гетерогенность популяции генетически измененных V. cholerae El Tor установлена Т.А. Кульшань и соавт. [11] при мультилокусном анализе вариабельных тандемных повторов предпандемичных и пандемичных штаммов V. cholerae El Tor, изолированных в разных регионах России, а также в странах ближнего и дальнего зарубежья. Более того, Н.И. Смирновой и соавт. [12] показано, что распределение на кластеры геновариантов вибриона Эль Тор ассоциировано с особенностями организации острова пандемичности VSP-II.

Анализ MLVA-профилей V. cholerae О1 El Tor в пределах отдельных вспышек на Дальнем Востоке также показал гетерогенность популяций этиологического агента, однако строгого соответствия генотипа очагу инфекции не установлено. В частности, на вспышке в Южно-Сахалинске доминирующий генотип (7_22_9_7_8) был идентифицирован во всех анализируемых очагах холеры, а его однолокусные варианты (с изменением структуры локуса VcB) — преимущественно в первом наиболее крупном очаге. Во Владивостоке в период вспышки широко распространились штаммы V. cholerae О1 El Tor двух MLVA-профилей, различающиеся на один повтор в локусе VcB. При этом клинические штаммы в первом очаге и при связанном с ним случаях отнесены к одному генотипу (аллель VcB23), во втором очаге — к двум генотипам (аллели VcB23 и VcB24). Учитывая временной интервал между случаями заболевания в очагах, составляющий практически 1 мес, можно предположить распространение V. cholerae О1 El Tor из первого очага и последующее инфицирование людей во втором очаге. Однако идентифицировать среди исследованных штаммов варианты с аллелью VcB23 из объектов окружающей среды второго очага не удалось. Распространенный в объектах окружающей среды второго очага V. cholerae О1 El Tor с аллелью VcB24 мог оказаться производным варианта возбудителя из первого очага.

С учетом изложенного, эпидемические осложнения по холере на Дальнем Востоке в 1999 г. были обус-ловлены V. cholerae О1 El Tor с идентичной структурой четырех локусов — VcA, VcC, VcD, VcG и специ-фичным для конкретной территории числом повторов в локусе VcВ: в Южно-Сахалинске — 22 повтора, во Владивостоке — 23—24 повтора. Исключение составляет лишь выделенный в наиболее крупном очаге в Южно-Сахалинске изолят V. cholerae О1 El Tor с генотипом, распространенным во Владивостоке. В соответствии со сложившимся подходом к анализу генетического родства штаммов, по результатам MLVA-типирования к клональным генетически связанным относят изоляты с идентичным аллельным профилем или однолокусные варианты c изменением структуры одного из локусов [13—15]. На основании этого можно заключить, что обусловившие эпидемические осложнения на Дальнем Востоке в 1999 г. варианты возбудителя холеры относятся к генетически родственным клональным. Вместе с тем доминирование на отдельных территориях (Южно-Сахалинск, Приморский край) штаммов специфических генотипов дает основание судить о том, что имел место завоз различных клональных вариантов возбудителя. Идентификация же однолокусных вариантов на территории может быть результатом дивергенции возбудителя в период вспышки. Подтверждением потенциальной возможности трансформации MLVA-генотипа штаммов V. cholerae служит обнаружение однолокусных вариантов среди спонтанных лабораторных мутантов, утративших гены холерного токсина при пассаже на питательных средах, а также установленная ранее [16] способность к изменению генотипа холерного вибриона в экспериментальных условиях.

Полученные нами результаты по полиморфизму структуры локусов вариабельных тандемных повторов V. cholerae О1 El Tor в период вспышек холеры согласуются с представленными в отечественной и зарубежной литературе данными молекулярно-эпидемиологического анализа. В частности, неоднородность MLVA-профиля V. cholerae О1, связанная с вариабельностью структуры локуса VcB, установлена на вспышке холеры в Казани [17]. Диверсификация исходного клона определена в период эпидемической вспышки холеры в Демократической Республике Конго, продолжавшейся в течение 2011—2012 гг. Изоляты одного MLVA-профиля и их однолокусные варианты были идентифицированы в первую неделю вспышки, затем произошла клональная дивергенция возбудителя параллельно с пространственно-временным распространением вспышки на территории [18]. В период вспышки холеры в Гане в 2014 г. идентифицированы одно- и двухлокусные варианты V. cholerae О1, входящие в один клональный комплекс [19]. Полиморфизм аллельных профилей как в течение одной вспышки, так и в динамике в одном очаге и в образцах клинического материала от одного больного установлен при изучении генетического родства штаммов холерного вибриона в Бангладеш [14, 20, 21]. Следует заметить, что в клиническом материале от контактировавших с больным в очаге обнаруживались не только однолокусные варианты V. cholerae, но и генетически не связанные со штаммом от больного изоляты с различием по трем, четырем и пяти локусам [20]. Такие данные позволяют судить о клональном полиморфизме возбудителя, циркулирующего в очагах инфекции на эндемичных территориях. Однако выделение от больных в очаге в Бангладеш и в более поздние сроки исследования от контактировавших с больными V. cholerae О1 с идентичным или сходным аллельным профилем свидетельствует о селективном преимуществе отдельных клональных вариантов возбудителя. Клональная гетерогенность установлена также на вспышках холеры в двух сельских районах Бангладеш [22]. В то же время Н. Zhou и соавт. [23] при анализе зарегистрированных в Китае эпидемических осложнений показали высокую клональность штаммов V. cholerae на каждой из 7 анализируемых вспышек с идентификацией субклона лишь в одном случае (редукция одного повтора в локусе Vc0437, соответствующему VcD).

Установленное отсутствие строгой территориальной приуроченности MLVA-генотипов вспышечных штаммов V. cholerae, возможность трансформации аллельного профиля свидетельствуют о недостаточной эффективности основанного на анализе 5 локусов вариабельных тандемных повторов подхода к типированию возбудителя холеры при углубленном анализе отдельных эпидемических осложнений. Однако согласованность MLVA-профиля с периодом и направ-лением импортации возбудителя определяет метод в качестве информативного при анализе завозов уникальных клонов на территорию в рамках долгосрочного эпидемиологического анализа. В данном контексте оказалась информативно сокращенная схема MLVA-типирования по трем локусам (VcС, VcD, VcG): дифференциация сибирских и дальневосточных токсигенных штаммов V. cholerae на группы при таком подходе согласуется с установленным по результатам полногеномного секвенирования распределением их на волны 7-й пандемии [24] (рис. 2),

Изолированные при осложнениях по холере в Сибирском и Дальневосточном регионах России штаммы V. cholerae О1 El Tor характеризуются установленной на основании MLVA-типирования гетерогенностью генетической организации, согласующейся с периодом и направлением их завоза на территорию. При отдельных вспышках холеры выяв-лена клональность этиологического агента с идентификацией близкородственных субклонов, формирование которых могло быть результатом пребывания возбудителя в объектах окружающей среды или пассажа через восприимчивый организм.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Миронова Л.В. — e-mail: mironova-lv@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-8481-6442

Пономарева А.С. — e-mail: ackozh@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-0674-6159

Хунхеева Ж.Ю. — e-mail: khunkheeva2015@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-5388-4300

Гладких А.С. — e-mail: angladkikh@gmail.com; https://orcid.org/0000-0001-6759-1907

Балахонов С.В. — e-mail: balakhonov.irk@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-4201-5828

Автор, ответственный за переписку:

Миронова Лилия Валерьевна — д.м.н., заведующая лабораторией холеры ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора; 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78; e-mail: mironova-lv@yandex.ru

Как цитировать:

Миронова Л.В., Пономарева А.С., Хунхеева Ж.Ю., Гладких А.С., Балахонов С.В. Генетическое разнообразие Vibrio cholerae О1 El Tor при эпидемических осложнениях в Сибирском и Дальневосточном регионах. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(4):165-172. https://doi.org/10.17116/molgen201937041