Принятые сокращения: EJC — exon junction complex, NMD — nonsense mediated decay, мРНП-частица — рибонуклеопротеиновая частица, 3’-UTR — 3’-нетранслируемая область, ЭПР — эндоплазматический ретикулум, NPC — nuclear pore complex, MD — motor domain, CBD — cargo binding domein, HC — heavy chain, LC — light chain, KAP — kinesin associated protein, LIC — light intermediate chain, IC — intermediate chain, АТФ — аденозинтрифосфат.

После этапа ремоделинга мРНК транспортируется к месту ее локализации в цитоплазме. Белки, определяющие локализацию мРНК в цитоплазме, могут взаимодействовать с ней, начиная с этапа транскрипции или же с момента ремоделинга на цитоплазматической стороне ядерной поры [1—5].

В зависимости от своего функционального значения и набора белков в составе мРНП-частицы мРНК может принимать различную локализацию и участвовать в разных процессах в цитоплазме. Будет ли мРНК подвержена сайленсингу, трансляции или деградации в цитоплазме, определяют Р-тельца и мРНП, находящиеся в их составе. Иную локализацию принимает мРНК во время эмбриогенеза, формируя локусы, где происходит трансляция и дальнейшее развитие тканей [6—10].

В процессе транспорта мРНК эукариот к месту ее локализации в цитоплазме участвуют элементы цитоскелета, моторные белки и белки-адаптеры, обеспечивающие прикрепление мРНК к моторным белкам и фибриллам [9, 11—13]. Семейства моторных белков консервативны среди эукариот. Они образуют транспортные системы, служащие для перемещения «грузов» внутри цитоплазматического компартмента, такие как кинезиновый, динеиновый и миозиновый транспорт [12—14]. Однако у живых организмов не существует полностью автономных систем, и механизмы транспортировки мРНП-частиц действуют взаимосвязанно и осуществляют сложную координацию посредством множества адаптерных белков [11, 15—17]. В данной статье мы раскрываем детали сложного механизма локализации и транспорта мРНП-частицы в цитоплазме эукариотических клеток.

В то время как транскрипция и экспорт мРНК внутри ядра интенсивно изучаются, о транспорте мРНК в цитоплазме известно сравнительно мало. В данной статье мы описываем важнейшие этапы этого процесса: транспорт мРНК к месту локализации с использованием моторных белков и определение места локализации мРНК в цитоплазме.

Механизмы локализации мРНК в цитоплазме эволюционно консервативны. В этот процесс вовлечено много факторов, которые совместно распознают и связывают мРНК и, взаимодействуя с дополнительными факторами, образуют мРНП-комплекс, компетентный к локализации в определенном месте. В то время как многие белки, участвующие в этом процессе, консервативны между видами, другие эволюционно различаются, но обладают сходными функциями. РНК-связывающие белки распознают cis-действующие мотивы или «сигналы локализации» РНК. Эти последовательности обычно (но не всегда) находятся в 3’-нетранслируемой области РНК (UTR) и взаимодействуют с РНК-связывающими белками, формируя основу мРНП-частицы еще в ядре. Лучшим известным примером того, как ядерные взаимодействия мРНК могут влиять на ее расположение в цитоплазме, является EJC (the exon junction complex). Связавшись с мРНК, EJC выходит вместе с ней в цитоплазму и отсоединяется от мРНК во время начала трансляции [1, 3]. EJC включает в себя многочисленные факторы, вовлеченные в сплайсинг пре-мРНК, экспорт мРНК, нонсенс-опосредованный распад мРНК (NMD) (рис. 1).

В группу белков EJС входят фактор сплайсинга RNPS1 и факторы Upf2 и Upf3b, участвующие в нонсенс-опосредованном распаде мРНК [5]. Первоначально белок RNPS1 был охарактеризован как коактиватор, способный повысить эффективность сплайсинга пре-мРНК in vitro [18]. Также данный белок является компонентом комплекса ASAP, который, в свою очередь, вовлечен в индукцию апоптоза. Белки Upf2, Upf3b и Upf1 являются центральными компонентами NMD. В ходе проведенных исследований было выяснено, что с полисомами ассоциированы в основном сплайсированные мРНК [4]. Влияние сплайсинга на результат трансляции напрямую зависит от расположения EJC. Данный комплекс может располагаться в кодирующем районе мРНК, что приводит к увеличению продуктов трансляции. Но если EJC находится в районе 3’-UTR, это оказывает противоположный эффект и может вызывать распад мРНК посредством NMD. В настоящее время NMD рассматривается как некий защитный механизм, позволяющий клеткам избавиться от аномальных мРНК, содержащих преждевременные кодоны терминации, во избежание синтеза укороченных, нефункциональных белков [19].

Наиболее очевидно проявляется функциональная важность локализации мРНК в цитоплазме на стадии развития ооцитов и в период эмбриогенеза у Drosophila, когда мРНК располагается в определенных районах цитоплазмы [20]. В этом случае мРНК в течение эмбриогенеза транслируется в том же месте, где располагается, тем самым давая начало локальному процессу развития тканей [10]. Например, неправильная локализация мРНК oscar в передней части эмбриона приводит к формированию зародышевых клеток и структур брюшной полости вместо головы [21, 22]. Такое же влияние распределения мРНК на эмбриональное развитие описано у других организмов — Xenopus laevis [7], Caenorhabditis elegans [6], Danio rerio [8] и Saccharomyces cerevisiae [9].

В цитоплазме эукариот мРНК может располагаться в Р-тельцах. Такие мРНП-комплексы необходимы для того, чтобы определить, какие мРНК будут подвергнуты деградации, какие — сайленсингу, а какие — трансляции [23, 24]. С Р-тельцами связаны стресс-гранулы — мРНП-частицы, которые образуются под действием каких-либо стрессовых сигналов и подавляют процесс трансляции. Образование стресс-гранул обратимо, и они диссоциируют при ослаблении стрессовых сигналов, восстанавливая трансляцию мРНК [20].

Кроме того, мРНК могут локализоваться в местах функционирования продуктов их трансляции (центросомы, ЭПР). Такое распределение может возникать как до трансляции, так и после [2].

Итак, после экспорта из ядра к мРНК присоединяются дополнительные факторы, которые определяют ее судьбу в цитоплазме. Образовавшиеся мРНП транспортируются к местам локализации с помощью элементов цитоскелета и молекулярных белков-моторов (рис. 2).

Элементы цитоскелета, к которым привлекается мРНК (актиновые филаменты или микротрубочки), определяют молекулярные «моторы», тип движения (одно- или двунаправленный) и свойства транспорта (скорость, производительность) [8, 25].

В сложном механизме транспорта важнейшую роль играют «моторные» белки, которые активно транспортируют временно трансляционно неактивные мРНП-частицы к месту трансляции, используя сеть цитоскелета (см. рис. 2).

В цитоплазме мРНК перемещается с помощью 3 семейств «моторных» белков: миозинов, кинезинов и динеинов. Кинезины транспортируют мРНК к (+)-концам микротрубочек, в то время как цитоплазматический динеин транспортирует их к (–)-концам микротрубочек. И динеины, и кинезины участвуют в локализации мРНК в ооцитах Drosophila melanogaster [26—29]. «Моторные» белки используют энергию гидролиза АТФ для создания конформационных изменений, которые приводят к направленному движению мРНК. Механизмы, по которым молекулярные «моторы» прикрепляются к мРНК, и как именно осуществляется асимметричный транспорт мРНК, пока недостаточно ясны.

Кинезиновое семейство белков транспортирует различные элементы клетки (органеллы, белки, мРНК) по микротрубочкам многих эукариотических клеток. Канонический кинезин-1 является одним из наиболее изученных представителей этого семейства [14]. Он представляет из себя тетрамерный белковый комплекс, состоящий из двух идентичных тяжелых цепей (HC) и двух легких цепей (LC). Домен HC отвечает за связывание белка с микротрубочками и гидролиз АТФ, в то время как гомодимер LC связывает транспортируемые структуры с HC (рис. 3).

Кинезин-1 играет роль в транспорте некоторых мРНК в клетках нервной системы позвоночных [30—32]. Нейроны эукариот имеют сложное полярное строение, и мРНК транспортируется в них на длинные дистанции — и в синапсы дендритов, и внутри аксона [11, 33, 34]. Локальная трансляция мРНК происходит в ответ на сигнал в синапсе [35]. Поскольку цитоплазматическое пространство в нейронах содержит высоко поляризованную сеть микротрубочек, с (–)-концами микротрубочек в клеточном теле и (+)-концами микротрубочек на клеточной периферии, кинезин-1 был предпочтительным кандидатом для участия в транспорте мРНК и других молекул в антероградном направлении к синапсу, что и было показано при анализе кинезин-содержащих комплексов из тканей мозга мыши. Эти комплексы состояли из мРНК-связывающих белков и мРНК [32]. Транспорт больших гранул мРНК in vivo нарушался в случае нефункционального кинезина-1, что свидетельствовало о роли кинезина в транспорте мРНК в нейронах. Также было показано участие кинезина-1 в транспорте shankl мРНК в нейронах крысы [36].

В ооцитах Drosophila melanogaster локализация мРНК определяет как специфичную клеточную полярность, так и полярность развития, и может служить основанием для использования эмбриона в качестве модели для исследования движения и локализации мРНК. Известно, что локализация мРНК oscar в течение оогенеза дрозофилы необходима как для обеспечения переднезадней симметрии эмбриона, так и для детерминации половых клеток [37]. В ооцитах, не имеющих HC канонического кинезина, мРНК оscar не локализуется в заднем полюсе, что показывает участие HC канонического кинезина в локализации этой мРНК. Было показано, что LC не являются необходимыми для функцио-нирования канонического кинезина. В составе неканонического кинезина-2 был обнаружен LC-подобный белок KAP, и показано, что кинезин-2 также участвует в транспорте и локализации оscar мРНК [38, 39]. Изучение в ооцитах Xenopus показало прямую роль кинезинового мотора в локализации мРНК для локализации Vg1 мРНК. Также было показано, что не только кинезин-1, но и кинезин-2 является компонентом Vg1 мРНП-частицы [40].

Динеинзависимый транспорт РНК. Семейство динеиновых моторных белков эукариот состоит из двух классов: аксонемный динеин и цитоплазматический динеин. Именно цитоплазматический динеин отвечает за транспорт к (–)-концу микротрубочек, участвует в движении хромосом и позиционирует веретено деления в митозе и участвует в позиционировании органелл в клетке. Цитоплазматический динеин является сложным комплексом, состоящим из каталитической гомодимерной тяжелой цепи и дополнительных некаталитических субъединиц, которые не отвечают за движение динеина, но могут быть необходимы для его взаимодействия с различными транспортируемыми молекулами [12] (см. рис. 3). Известным адаптером в составе динеинового комплекса является белок динактин, который был обнаружен как активатор динеинзависимого транспорта. Теперь известно, что он необходим практически для всех функций динеина. Динактиновый комплекс содержит по крайней мере 11 субъединиц и необходим для локализации динеина, его процессивности и взаимодействия с транспортируемыми молекулами (см. рис. 3). Кроме того, динактин может быть вовлечен в координацию транспорта транспортируемых молекул, связанного как с динеиновым, так и с кинезиновым «моторами» [13].

Роль динеина в локализации мРНК была впервые продемонстрирована на эмбрионах дрозофилы, где транспорт таких мРНК, как wingless, hairy и ftz к апикальной цитоплазме приводит к координированной сегментации эмбриона [41, 42]. Динеин связывает эти транскрипты с помощью белков BicaudalD (BicD) и Egaltarian (Egl) [41, 43]. Динеин также отвечает за локализацию мРНК bicoid и gurken в эмбриогенезе дрозофилы [27, 28]. Локализация этих мРНК играет роль в установлении как в переднезадней, так и спинно-брюшной оси эмбриона дрозофилы [44].

Миозинзависимый транспорт РНК. Семейство миозиновых «моторов» очень разнообразно и кодируется 20 структурно и функционально различными классами генов [45]. Большинство миозиновых «моторов» содержат N-концевой «моторный» домен, используемый для связывания актина и гидролиза АТФ, «шейный» домен, необходимый для связывания легкой цепи, и С-концевой домен для связывания транспортируемых молекул [46] (см. рис. 3).

Было показано, что для транспорта мРНК в S. cerevisiae необходим миозиновый «моторный» белок V класса — Myo4p. Известно, что белок Ash1 S. cerevisiae является транскрипционным фактором, который репрессирует переключение типа спаривания в дочерней клетке, блокируя экспрессию HO эндонуклеазы [47]. Для мРНК Ash1 был показан механизм локализации в клетке. Для правильной локализации мРНК Ash1 необходим РНК-связывающий белок She2p, который связывает белок She3p, который в свою очередь рекрутирует Myo4p. Этот миозин-содержащий мРНП комплекс транспортируется по сети цитоскелета дочерних клеток [48—51].

Миозин участвует в локализации мРНК β-актина в фибробластах позвоночных. Нокдаун миозина II-B и ингибирование его АТФазной активности нарушают локализацию β-актина в фибробластах мыши [52]. Миозиновый «мотор» также вовлечен в транспорт мРНК оscar в ооцитах дрозофилы, в частности, миозин V класса необходим для транспорта на короткие расстояния на заднем полюсе ооцита [53].

Внутриклеточный транспорт эукариот представляет собой серии движений по микротрубочкам в обоих направлениях. Как координируются процессы, управляемые различными моторными белками, пока не очень ясно. Механические взаимодействия между моторами с противоположным движением необходимы для осуществления эффективного транспорта. Так, действия динеина и кинезина тесно сопряжены, и нарушение функции одного из них приводит к нарушениям транспорта в обоих направлениях [15]. Есть некоторые доказательства, что динактин может быть мостиком для взаимодействий динеина и кинезина [12, 16, 17]. Динактин может взаимодействовать с кинезином-2 и, вероятно, повышает процессивность кинезина-2 [16, 54].

Существует несколько моделей действия «моторов». По одной из моделей динеин и кинезин участвуют во время переноса «груза» одновременно, и их активность регулируется на уровне комплекса «груз»—«мотор»—микротрубочки. Активность «моторов» определяется либо изменением скорости включения/выключения мотора, либо связыванием белков-партнеров, либо посттрансляционными модификациями моторных белков [55]. По альтернативной гипотезе «перетягивания каната» — моторные белки «борются» за транспортируемые молекулы и «сильнейший выигрывает». Эта модель также подтверждается некоторыми экспериментами [56].

В то время как взаимодействия мРНК Ash1 и Myo4p у S. cerevisiae и динеина и мРНК, кодирующей белки сегментации эмбрионов у D. Melanogaster, хорошо изучены, доказательств прямой связи факторов, вовлеченных в распознавание мРНК и связывание с молекулярными «моторами», найдено очень мало. Общая модель предполагает, что РНК-связывающие белки распознают специфичные элементы (обычно в 3’UTR) и взаимодействуют с белками-адаптерами, которые связывают «моторные» белки с мРНК [57].

Ключевым свойством большинства путей транспорта мРНК является необходимость «заякоривать» РНК в месте ее локализации, и в этом процессе моторные белки также принимают участие. Для «заякоривания» транскриптов в эмбрионах Drosophila melanogaster необходимы микротрубочки, но не актомиозиновая система. Также показано, что динеин необходим для «заякоривания» ftz мРНК у Drosophila melanogaster [58]. Эти данные получены в экспериментах с применением ингибитора АТФаз, что приводило к остановке динеинзависимого транспорта, но не оказывало влияния на «заякоривание» мРНК [58].

Еще много белков, отвечающих за локализацию мРНК в цитоплазме эукариот, до сих пор неизвестны, как и непонятен механизм, определяющий связывание мРНК с различными моторными системами. Изучение факторов, сопровождающих мРНК на всем протяжении от транскрипции до места локализации в цитоплазме, позволит пролить свет на все необходимые для движения и местонахождения в цитоплазме преобразования мРНП-частиц.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

При работе с животными нами были соблюдены все применимые международные, национальные и институциональные принципы ухода и использования животных.

Сведения об авторах:

Сведения об авторах

Глухова Анна Анатольевна (Glukhova Anna Anatolievna); e-mail: anyapochta6@gmail.com

Набирочкина Елена Николаевна (Nabirochkina Elena Nikolaevna); e-mail: elenan5@rambler.ru

Копытова Дарья Владимировна (Kopytova Daria Vladimirovna); e-mail: d_dmitrieva@mail.ru

Для корреспонденции: Копытова Дарья Владимировна (Kopytova Daria Vladimirovna), канд. биол. наук, старший научный сотрудник, Институт биологии гена Российской академии наук, Москва 119334, Россия; e-mail: d_dmitrieva@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-1086.