Маркерная хромосома, несущая гены рРНК, сопряженная с интеллектуальной недостаточностью: клинический случай

Авторы:

Лемская Н.А.,

Юлия Владимировна Максимова,

Шорина А.Р.,

Юдкин Д.В.,

Телепова А.С.,

Романенко С.А.

Журнал: Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2018;36(4):199-202.

DOI: 10.17116/molgen201836041199

Прочитано: 4582 раза

Скачать PDF

Резюме

Маркерные хромосомы — это структурно ненормальные хромосомы, которые могут быть как сверхчисленными в карио-типе, так и заменять одну из хромосом. Очень часто маркерные хромосомы являются причиной развития различных патологий, в частности интеллектуальной недостаточности. Данное исследование посвящено молекулярно-цитогенетическому анализу акроцентрической маркерной хромосомы пациента с аутизмом и интеллектуальной недостаточностью. С помощью локализации пэйнтинг-проб хромосом человека показано ее происхождение из прицентромерных районов p и q плеч хромосомы 15. Для более детального установления района происхождения данной хромосомы была проведена ее микродиссекция с последующей локализацией на метафазных пластинках как здорового контроля, так и пациента. Подтверждено ее происхождение из ядрышконесущей хромосомы 15. В результате локализации плазмиды, несущей рДНК, на хромосомах пациента были выявлены два кластера генов рибосомных РНК. Окрашивание с помощью нитрата серебра показало, что оба кластера являются активными. Рассмотрен возможный вклад выявленной хромосомной патологии в формирование клинической картины.

Ключевые слова

маркерная хромосома
район 15q11—q13
гены рРНК
аутизм
интеллектуальная недостаточность
маркерная хромосома
район 15q11—q13
гены рРНК
аутизм
интеллектуальная недостаточность

Дата публикации: 30.04.2020

Введение

Малые сверхчисленные маркерные хромосомы — это структурно ненормальные хромосомы, которые могут быть как дополнительными по отношению к нормальному карио-типу, так и заменяющими какую-либо хромосому. Их размер, как правило, меньше, чем размер хромосомы 20 на этой же метафазной пластинке [1]. В 86% случаев малые сверхчисленные маркерные хромосомы происходят из акроцентрических хромосом, в частности 75% происходят из хромосомы 15 [2]. Район 15q11—q13 известен своей нестабильностью и частыми перестройками. В результате появляются малые сверхчисленные маркерные хромосомы благодаря инверсии и дупликации проксимального конца хромосомы 15. Это приводит к тетрасомии 15p и частичной тетрасомии 15q. Клинические проявления у таких пациентов выражаются ранней центральной гипотонией, задержкой развития и интеллектуальной недостаточностью умеренной степени, эпилепсией и аутизмом. Описаны два типа маркерных хромосом, относящихся к inv dup (15) с различными фенотипическими признаками. Первый тип — метацентрическая или субметацентрическая гетерохроматиновая хромосома, у носителей которой в фенотипе не проявляются синдромы Прадера—Вилли/Ангельмана (критический район 15q11). Второй тип включает проявления синдрома Прадера—Вилли/Ангельмана, а маркерная хромосома содержит эухроматиновый участок (критический район 15q12 или 15q13). Большинство изодицентрических хромосом 15q12 или 15q13 возникает из двух гомологичных материнских хромосом во время мейоза, и их частота образования коррелирует с возрастом матери при беременности [2].

Материал и методы

Этика. Пациент вовлечен в исследование строго в соответствии с международными стандартами, которые включают в себя осведомленность об исследовании, согласие на участие в исследовании и гарантии конфиденциальности. Все исследования соответствовали этическим стандартам, разработанным в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации с поправками, внесенными в 2000 г.

Описание клинического случая. Пробанд — пациент мужского пола, возраст 6 лет. Во время беременности у его матери развилась преэклампсия, были угрозы прерывания. При рождении оценка по шкале Апгар 7/8 баллов, показана задержка внутриутробного развития по гипопластическому типу. Выявлена задержка психомоторного развития: удержание головы с 7 мес, научился сидеть к 1-му году жизни, в 2 года мог ходить с посторонней поддержкой. На момент обследования пациент использует в речи 5—6 простых слов, на обращенную речь не реагирует, навыков самообслуживания нет. Визуально отмечаются малые аномалии развития: макроцефалия с умеренно выраженной акроцефалией, высокий лоб, гипертелоризм, эпикант, широкое уплощенное переносье, маленький короткий нос, «рот карпа», расщелина мягкого неба, низкое расположение ушных раковин, макротия, сходящееся косоглазие, клинодактилия V пальцев кистей, конусовидная деформация концевых фаланг кистей. Нижние конечности с вальгусной деформацией, частичная кожная синдактилия II—III пальцев стоп. Со стороны половой системы отмечены двусторонний крипторхизм, паховая ретенция. По результатам ЭхоКГ отмечены малые сердечные аномалии: добавочная хорда левого желудочка, открытое овальное окно.

Получение суспензий клеток и GTG-окрашивание хромосом. Препараты метафазных хромосом были получены из кратковременных культур В-лимфоцитов венозной крови по стандартному протоколу [3]. GTG-окрашивание проводилось соответственно ранее описанной методике [3]. Метафазные пластинки анализировали с помощью микроскопа Olympus BX 53 и программного обеспечения ВидеоТест Карио 3.1 («iMicroTec», Россия).

Микродиссекция метафазных хромосом и флуоресцентная гибридизация in situ. Маркерные хромосомы были диссектированы по описанной ранее методике [4] с использованием микроскопа Olympus IX 51 и микроманипулятора Eppendorf Transferman NK2. ДНК диссектированных хромосом была амплифицирована с помощью набора для полногеномной амплификации GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit («Sigma-Aldrich», США). Полученные зонды метили дигоксигенином. Каждая библиотека была получена из одной копии маркерной хромосомы.

Для локализации генов рРНК использовали плазмиду pHr13, несущую гены 18S, 28S и 5,8S рРНК [5], которую амплифицировали и метили с помощью набора для полногеномной амплификации WGA («Sigma-Aldrich») как описано выше.

Флуоресцентную гибридизацию in situ всех использованных в исследовании зондов проводили по ранее описанной методике [4]. Метафазные пластинки анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus BX 53 и программного обеспечения ВидеоТест FISH 2.0 («iMicroTec», Россия).

Результаты и обсуждение

Анализ кариотипа пробанда (рис. 1)

Рис. 1. GTG-окрашенный кариотип пробанда. mar — маркерная хромосома.

показал наличие маркерной хромосомы в 100% метафазных пластинок (n=74). Анализ кариотипов родителей показал отсутствие хромосомных патологий. Маркерная хромосома пациента представляет собой акроцентрическую хромосому, размером сопоставимую с хромосомой 20. Для установления происхождения маркерной хромосомы мы локализовали библиотеку сортированных хромосом человека на метафазных пластинках пациента. На маркерной хромосоме локализовалась библиотека хромосомы 15 (рис. 2, а),

Рис. 2. Результаты флуоресцентной гибридизации in situ. а — локализация библиотеки хромосомы 15 на метафазных хромосомах пробанда; б — локализация библиотеки диссектированной маркерной хромосомы на метафазных хромосомах здорового контроля; в — локализация библиотеки диссектированной маркерной хромосомы на метафазных хромосомах пробанда; г — локализация генов рРНК на метафазных хромосомах пробанда. На рис. а, в, г стрелкой указана маркерная хромосома.

при этом метилась проксимальная часть р-плеча. Для визуализации границ перестройки необходимо было провести реципрокный пэйнтинг. Для этого была выполнена микродиссекция маркерной хромосомы с последующей локализацией полученной библиотеки на метафазных пластинках пациента и здорового контроля. Всего было получено 3 библиотеки из индивидуальных маркерных хромосом. Локализация всех полученных библиотек на метафазных пластинках здорового контроля показала их гомологию с прицентромерными районами хромосомы 15 (см. рис. 2, б), а на хромосомах пациента — также с дистальным и проксимальным концами маркерной хромосомы (см. рис. 2, в). Хромосома 15 содержит ядрышкообразующие районы, которые показали гомологию участкам маркерной хромосомы. В связи с этим было принято решение локализовать гены рРНК на метафазных пластинках пациента. Результат локализации показал наличие двух кластеров генов рРНК на проксимальном и дистальном концах маркерной хромосомы (см. рис. 2, г).

Для оценки активности кластеров рДНК на маркерной хромосоме проведенно окрашивание хромосом пробанда с помощью нитрата серебра. В результате показано, что оба кластера рДНК на маркерной хромосоме являются активными (рис. 3).

Рис. 3. Окрашивание активных ядрышкообразующих райо- нов на метафазных хромосомах пробанда. Стрелкой указана маркерная хромосома.

Описанная перестройка затрагивает район 15q11—q13, известный своей нестабильностью. В нем часто формируются точки разрыва с последующим формированием маркерных хромосом, что приводит к тетрасомии 15p и частично 15q. Клиническая и цитогенетическая картина, характерная для этого пациента, соответствует синдрому дупликации 15q11—q13, который зачастую сопровождается синдромами Прадера—Вилли или Ангельмана, так как затронут критический район для этих синдромов [6—9]. Особо следует отметить увеличение копийности генов рРНК, при котором на маркерной хромосоме экспрессируются дополнительные копии, что также может вносить вклад в развитие клинической картины. Ранее показано, что правильная сборка рибосом очень важна для дифференцировки нервных клеток, в частности для формирования дендритов [10], при этом нарушения синтеза рРНК приводили к развитию нейродегенерации у мышей [11]. Таким образом, данная перестройка приводит не только к дупликации критического района 15q11—q13, но и к появлению двух дополнительных районов ядрышкового организатора, нарушению количества рДНК и соответственно рРНК, что вносит свой вклад в формирование патологического фенотипа.

Благодарность. Авторы выражают благодарность М. Фергюсон-Смиту (Кембриджский университет, Великобритания) за предоставленные библиотеки хромосом человека.

Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда, грант 15−15−10001.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах:

Сведения об авторах

Телепова Алена Сергеевна (Alena S. Telepova) — старший лаборант, Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, 630090, Новосибирск, Россия

Романенко Светлана Анатольевна (Svetlana A. Romanenko) — к.биол.н., старший научный сотрудник, Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, 630090, Новосибирск, Россия

Лемская Наталья Анатольевна (Natalya A. Lemskaya) — к.биол.н., научный сотрудник, Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, 630090, Новосибирск, Россия

Максимова Юлия Владимировна (Yulia V. Maksimova) — д.м.н., проф., заведующая кафедрой медицинской генетики, Новосибирский государственный медицинский университет, 630091, Новосибирск, Россия

Шорина Асия Ринатовна (Asia R. Shorina) — врач-генетик, Новосибирская городская клиническая больница №1, 630047, Новосибирск, Россия

Юдкин Дмитрий Владимирович (Dmitry V. Yudkin) — к.биол.н., заведующий сектором хромосомных патологий, Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, 630090, Новосибирск, Россия; e-mail: dim@mcb.nsc.ru

Для корреспонденции:Юдкин Дмитрий Владимирович — канд. биол. наук, заведующий сектором хромосомных патологий ИМКБ СО РАН, e-mail: dim@mcb.nsc.ru