Автоматизированный метод измерения активности L-аспарагиназы
Журнал: Лабораторная служба. 2025;14(1): 32‑37
Прочитано: 713 раз
Как цитировать:
L-Аспарагиназа является неотъемлемым компонентом комбинированной схемы лечения острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ). Терапевтический эффект объясняется гидролизом аспарагина и практически полным удалением этой аминокислоты из плазмы, что приводит к остановке клеточного цикла и апоптозу злокачественных клеток, которые не способны синтезировать аспарагин [1—3]. Из-за технологических и логистических ограничений сложно измерять концентрацию аспарагина в сыворотке крови [4, 5]. Поскольку существует прямая корреляция между уровнем активности L-аспарагиназы и снижением концентрации аспарагина, активность аспарагиназы в сыворотке крови стала критерием прогнозирования фармакодинамической эффективности препаратов аспарагиназ [1]. L-Аспарагиназа — фермент бактериального происхождения. Фармакокинетические свойства препаратов аспарагиназы различаются в зависимости от продуцирующего микроорганизма (Escherichia coli и Erwinia chrysanthemi), наличия химической и биологической модификации (нативные L-аспарагиназы, конъюгированные с полиэтиленгликолем, рекомбинантные) и производителя препарата [3, 6]. При этом у пациентов наблюдается значимая вариация ее активности при введении одной и той же формы и дозы препарата [7, 8]. Будучи чужеродным белком, препараты L-аспарагиназ способны индуцировать реакции гиперчувствительности с выраженными клиническими проявлениями или без таковых (так называемая тихая инактивация), что приводит к снижению активности аспарагиназы в плазме крови и быстрому ее клиренсу. Нередко проявляется и неиммунная токсичность (острый панкреатит, остеонекроз, тромбоз, гепатотоксичность, гипертриглицеридемия), которую некоторые исследователи ассоциируют с избыточно высокой активностью аспарагиназы в плазме [3, 5, 9]. Изложенное выше привело к формированию рекомендаций о необходимости терапевтического лекарственного мониторинга (ТЛМ) активности аспарагиназы в протоколах лечения ОЛЛ [1, 10, 11].
Цель статьи — описание адаптации метода измерения активности аспарагиназы в сыворотке крови на современном биохимическом анализаторе для использования в повседневной клинической практике ТЛМ.
Активность аспарагиназы определяли с помощью метода сопряженных ферментативных реакций [12]. L-Аспарагиназа катализирует гидролиз L-аспарагина в L-аспартат. Глутаминовая щавелевоуксусная трансаминаза впоследствии катализирует трансаминирование L-аспартата и α-кетоглутарата в оксалоацетат и L-глутамат. Затем оксалоацетат восстанавливается до малата в присутствии яблочной дегидрогеназы с одновременным окислением восстановленного β-никотинамидадениндинуклеотида (НАДН) в β-никотинамидадениндинуклеотид (НАД+), что сопровождается снижением абсорбции на длине волны 340 нм при температуре 37 °C. Скорость снижения абсорбции пропорциональна активности аспарагиназы. За основу адаптации нами были взяты методические подходы, реализованные в работах [13, 14].
Смесь реагентов готовилась, как описано в табл. 1.
Таблица 1. Состав смеси реагентов (на 400 мл)
| Реагент | Исходная смесь | ||
| производитель, номер по каталогу | количество | концентрация в исходной смеси | |
| H2O деионизированная | 280 мл | — | |
| Трис-HCl буфер (10-кратный, pH 7,4 ) | Sigma-Aldrich #93313 | 40 мл | 50 мМ/л |
| Глицерин | Sigma-Aldrich #G5516 | 80 мл | 20% |
| НАДН | Sigma-Aldrich #N8129) | 51,077 мг | 180 мкМ/л |
| α-кетоглютарат | Sigma-Aldrich #K-3752 | 40 мг | 0,526 ммол/л |
| АСТ (GOT) 1 кМЕ* | Sigma-Aldrich #G-2751-1KU | 136 мкл* | 360 МЕ/л |
| МДГ 5 кМЕ* | Sigma-Aldrich #M-2634-5KU | 13,2* | 220 МЕ/л |
| Альбумин человеческий 20% | Takeda | 400 мкл | 0,02% |
Примечание: GOT — глутаминовая щавелевоуксусная трансаминаза; МДГ — малат дегидрогеназа. * — объем раствора фермента во флаконе, в котором содержится заявленная активность аспарагиназы, варьирует от лота к лоту. В зависимости от указанного объема следует корректировать объем раствора фермента, вносимого в реакционную смесь до заданной каталитической концентрации.
Полученные 400 мл реагента делили на две части по 200 мл. Одна часть (200 мл) использовалась в исходном виде (реагент Rblank). К оставшимся 200 мл исходного реагента добавляли 26,4 мг L-аспарагина (Catalog #A0884 Sigma-Aldrich L-Asparagine) до полного растворения для получения рабочего реактива (RColor). Реагенты разливали во флаконы для реактивов анализатора AU 480 («Becman Coulter») объемом 30—60 мл и хранили при –80 °C.
Калибраторы и контроли готовили из фармпрепарата пегелированной аспарагиназы Онкаспар (ПЭГ-аспарагиназа, Oncaspar, производитель «Лаборатории Сервье Индастри», Франция, держатель регистрационного удостоверения АО «Сервье», Россия) или нативной аспарагиназы из Escherichia coli от «Sigma-Aldrich» (Catalog #9015-68-3).
Для получения исходного раствора аспарагиназы Онкаспар с активностью 750 МЕ/мл во флакон с лиофилизатом добавляли 5 мл воды. Далее 100 мкл этого раствора смешивали с 900 мкл 50% раствора глицерина. Полученный стоковый раствор с активностью 75 МЕ/мл аликвотировали по 0,2 мл и хранили при –80 °C.
L-аспарагиназу от «Sigma-Aldrich» разводили в 1 мл 50% раствора глицерина. Полученный стоковый раствор с активностью 100 МЕ/мл аликвотировали по 0,2 мл и хранили при –80 °C.
Для приготовления калибраторов стоковые растворы аспарагиназ последовательно разводили пулированной сывороткой крови человека до концентраций 1000; 500; 250; 100; 50,0; 25,0; 12,5; 6,25 МЕ/л. Пулированную сыворотку крови без аспарагиназы использовали как «нулевой» калибратор (присвоенное значение активности аспарагиназы 0 МЕ/л).
Стоковые растворы аспарагиназ разводили другим пулом сывороток до концентраций 571,4; 81,6 МЕ/л и использовали в качестве контролей.
Пулы сывороток собирали из оставшихся проб для биохимических исследований в клинико-диагностической лаборатории ГАУЗ СО ОДКБ. Пул собирался от пациентов без гематологических заболеваний и не получающих лечение препаратами аспарагиназы. В пул не включались пробы с аналитически значимой липидемией, иктеричностью и гемолизом.
Калибровочные и контрольные образцы аликвотировались по 0,2 мл и хранились при –80 °C.
Все измерения проводили на автоматическом биохимическом анализаторе AU 480 («Beckman Coulter»). В реакционных ячейках анализатора смешивались 190 мкл реагента и 10 мкл сыворотки крови пациентов, калибраторов или контролей. Регистрировали скорость снижения абсорбции на длине волны 340 нм при температуре 37 °C. В расчетах использовали участок кинетической кривой с 14-го по 27-й циклы. Активность аспарагиназы определяли по калибровочной кривой с расчетом по сплайну. Для каждого типа аспарагиназ (ПЕГ-аспарагиназа и нативная аспарагиназа от «Sigma-Aldrich») калибровку проводили по калибровочным стандартам, приготовленным из соответствующей аспарагиназы. Предварительные исследования показали значительное влияние матрикса проб на результаты. Все дальнейшие измерения проводили с использованием бланка по образцу с реагентом, не содержащим аспарагин (реагент Rblank 190 мкл+10 мкл калибратора, контроля или пробы пациентов; пункт в программе анализатора: Sample Blank: «RColour-RBlank», табл. 2). Образцы калибраторов и холостая проба анализировались в двух повторах. Типичный калибровочный график представлен на рис. 1.
Таблица 2. Параметры программы теста определения активности аспарагиназы
| Настройки анализатора | |
| Common test parameters | Test name — Test name: RBlank, Multi reagent Swich: Yes — Test name: RColour. Multi reagent Swich: Yes — Decimal place: 2 Sample Blank: «RColour-RBlank» |
| Specific test parameters | RColour, BColour: — Sample Volume: 10 Dilution: 0 — Pre-Dilution Rate: 1 — Reagent Volume(R1): 190 Dilution: 0 — Reagent Volume(R2): 0 Dilution: 0 — Wave Light Pri: 340, Sec: 660 — Method: RATE — Reaction Slope: «—» — Measuring poit-1 First: 14, Last: 27 — Lag time chek: NO |
| Calibration Specific RColour | — Calibration Type: 7AB — Formula: Spline — Counts: 2 — <Calibrator parameters> — Point-1: Калибратор 7 — Conc: 0,00 — Point-2: Калибратор 6 — Conc: 12,5 — Point-3: Калибратор 5 — Conc: 25,0 — Point-4: Калибратор 4 — Conc: 100 — Point-5: Калибратор 3 — Conc: 250 — Point-6: Калибратор 2 — Conc: 500 — Point-7: Калибратор 1 — Conc: 1000 |
Рис. 1. Снимок экрана анализатора AU 480. Типичная калибровочная кривая.
Conc — концентрация калибраторов, OD — оптическая плотность.
Калибраторы и образцы всех трех уровней контролей исследовались перед началом каждой аналитической серии.
Программируемые в анализаторе AU 480 параметры представлены ниже (см. табл. 2).
Предел бланка (LoB), предел обнаружения (LoD) и нижний предел количественного измерения (LoQ) метода определяли как рекомендовано [15, 16].
LoB определяли как наибольшую кажущуюся активность, выявляемую при неоднократных измерениях в пробе, не содержащей аспарагиназы (в бланке). LoD это самая низкая активность аспарагиназы, которую можно надежно отличить от нуля, т.е. от LoB.
Значения LoB и LoD рассчитывали по результатам измерений в бланке и пробе с низкой активностью фермента, равной 6,25 МЕ/л. Измерения выполнены в течение 12 дней в 4 пулах бланка и пробы с низкой активностью. LoB и LoD рассчитывали как:
LoB=Xb+1,645 SDb,
где Xb и SDb — среднее значение и стандартное отклонение активности аспарагиназы повторных измерений в бланке.
LoD=LoB+1,653 SDs,
где SDs — стандартное отклонение активности аспарагиназы повторных измерений в пробе с активностью 6,25 МЕ/л.
LoQ был определен с использованием подхода приемлемой прецизионности (функциональной чувствительности) и правильности. Для этого измеряли активность аспарагиназы в 4 пулах сывороток крови с 7 различными каталитическими концентрациями (6,25; 12,5; 13,6; 25,0; 50,0; 81,6 и 100 МЕ/л) в каждом пуле. Строили график зависимости коэффициента вариации (КВ%) от активности аспарагиназы при аппроксимации экспериментальных точек степенной функцией:
КВ%=C0·Xc1,
где C0 и c1 — коэффициенты модели, а X — активность фермента. За LoQ принимали минимальное значение активности аспарагиназы, которое измеряется с КВ=20% и смещением от целевого значения не более 15%. Кроме того, LoQ определяли как активность, равную сумме среднего значения и 10 SD повторных измерений в бланке.
Внутрисерийную прецизионность оценивали путем анализа контрольных проб (571,4 и 81,6 МЕ/л) в 12 повторах. Межсерийную прецизионность оценивали, измеряя ежедневно контрольные сыворотки крови в 5 повторах в течение 5 дней.
Статистический анализ проведен с использованием программ Analyse-it (Analyse-it Software, Ltd.) и Microsoft Excel (Windows 10).
Значения LoB и LoD рассчитаны по результатам 44 измерений в пробах, не содержащих аспарагиназу, и в 50 пробах с активностью 6,25 МЕ/л. Средняя активность в бланке составила 0,33 МЕ/л, SDb — 1,24 МЕ/л. Средняя активность в пробе с низкой активностью была 6,66 МЕ/л и пулированное SDs — 2,98 МЕ/л. Рассчитанные значения LoB и LoD — 2,4 и 7,33 МЕ/л соответственно.
Для определения LoQ за 15 дней выполнено 311 измерений в пулах сывороток крови с различной активностью аспарагиназы (табл. 3). График зависимости КВ от активности аспарагиназы представлен на рис. 2. Рассчитанное значение LoQ как наименьшей активности аспарагиназы, измеряемой с КВ=20%, составило 12,52 МЕ/л, при этом правильность (смещение от целевого значения) была –2,7%. LoQ, определенное как активность аспарагиназы, десятикратно превышающее среднее значение активности в бланке, равно 12,7. Полученные результаты позволили установить LoQ на уровне 13,0 МЕ/л.
Таблица 3. Результаты измерений активности аспарагиназы в пулах сывороток при установлении LoQ
| Активность (МЕ/л) | n | Среднее значение (МЕ/л) | SD (МЕ/л) | КВ (%) |
| 6,25 | 50 | 6,65 | 2,95 | 44,3 |
| 12,5 | 47 | 12,16 | 2,08 | 17,1 |
| 13,6 | 48 | 13,16 | 2,45 | 18,6 |
| 25 | 39 | 24,56 | 2,10 | 8,6 |
| 50 | 36 | 47,36 | 3,43 | 7,2 |
| 81,6 | 51 | 88,14 | 5,68 | 6,4 |
| 100 | 40 | 100,30 | 2,75 | 2,7 |
Примечание. n — количество измерений; SD — стандартное отклонение измерений в пулах с соответствующей активностью аспарагиназы; КВ — коэффициент вариации.
Рис. 2. Профиль прецизионности измерений активности аспарагиназы в пулах сывороток при установлении LoQ.
Внутрисерийный КВ составил 2,1 и 0,97% соответственно для контрольных проб с активностью 81,6 и 571,4 МЕ/л. Межсерийный КВ для этих контрольных сывороток был соответственно 6,4 и 5,5%.
L-Аспарагиназа является критически важным компонентом терапии острого лимфобластного лейкоза. В рекомендациях международных экспертов однозначно зафиксирована необходимость мониторинга активности аспарагиназы в крови.
В настоящей работе показана возможность применения полностью автоматизированного метода измерения активности аспарагиназы в сыворотке крови на биохимическом анализаторе. Аналитические характеристики метода удовлетворяют требованиям к биоаналитическим методам [17] и близки к таковым, установленным в работе исследователей [13], взятой нами за основу при адаптации, и данным, представленным двумя сертифицированными лабораториями США, использующими тот же аналитический принцип [18, 19]. Такой подход позволяет в полной мере реализовать ТЛМ аспарагиназы в реальном времени у пациентов с ОЛЛ.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Литература / References:
Подтверждение e-mail
На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.
Подтверждение e-mail
Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.
