Введение

Биоэнергетические дисфункции в настоящее время признаны отличительной чертой многих острых и хронических заболеваний, а биоэнергетическая коррекция рассматривается как многообещающая терапевтическая опция в рамках нового направления митохондриальной медицины [1]. Разработка стратегий оценки биоэнергетики человека в норме и при патологии в настоящее время является интенсивной областью трансляционных исследований. Митохондрии играют центральную роль в биоэнергетике, так как генерируют аденозинтрифосфат (АТФ) путем окислительного фосфорилирования (OXPHOS). Помимо синтеза АТФ митохондрии выполняют множество других функций, например продуцируют активные формы кислорода (АФК) комплексами электронно-транспортной цепи I и III, регулируют кальциевую сигнализацию, а высвобождение электрон-транспортного белка цитохрома С из митохондрии — точка невозврата в цепи апоптотического каскада [2, 3]. Поскольку перечисленные функции включают механизм цепи переноса электронов, они тесно связаны с OXPHOS. Таким образом, изменения в любой из этих функций могут прямо или косвенно изменять биоэнергетику.

Уже давно изучается биоэнергетика в органах, которые имеют высокую потребность в энергии и содержат большое количество митохондрий: это мозг, сердце, печень и скелетные мышцы. Однако роль митохондрий в циркулирующих клетках и регуляция митохондриями функций клеток крови начали раскрываться лишь относительно недавно. Примечательно, что гемопоэз представляет собой высокоэнергетический процесс, который зависит от OXPHOS-образования АТФ [4] и сопровождается функциональными изменениями в митохондриальной массе, митохондриальном потенциале (Δψ) (разность электрических потенциалов на внутренней мембране митохондрий) и генерации митохондриальных активных форм кислорода (mtROS) [5]. Это в конечном счете приводит к включению разного количества митохондрий в каждый терминально дифференцированный тип клеток, за исключением зрелых эритроцитов, которые не содержат функциональных митохондрий [6]. Независимо от плотности митохондрий в клетке, эта органелла играет жизненно важную сигнальную и гомеостатическую роль во всех зрелых типах клеток крови [7]. Например, увеличение выработки mtROS и управляемый митохондриями апоптоз связаны с активацией тромбоцитов [8] и активацией дендритных клеток [9], в то время как увеличение потребления кислорода митохондриями сопровождает активацию лимфоцитов [10]. Таким образом, правильное функционирование митохондрий — эссенциальное условие гемопоэза и функциональной активности зрелых клеток крови.

Митохондриальная дисфункция в патогенезе неметаболических заболеваний

Изменения в митохондриальной энергетике, продукции АФК и передаче сигналов апоптоза являются частью патогенеза многих заболеваний сердечно-сосудистой, дыхательной и нервной систем [11—14]. Например, при сердечной недостаточности нарушение функции цепи переноса электронов, приводящее к недостаточному производству АТФ и увеличению выработки mtROS, влечет за собой возникновение биоэнергетического дефицита в миокарде [15]. При легочной гипертензии митохондриальная дисфункция, приводящая к снижению OXPHOS (с сопутствующим увеличением гликолиза) и подавлению митохондриальной апоптотической сигнализации, связана с гиперпролиферацией гладкомышечных клеток легочной артерии и их устойчивостью к апоптозу — двумя основными молекулярными механизмами, которые приводят к ремоделированию сосудов [16, 17]. В отличие от патологий со сниженной функцией митохондрий клетки дыхательных путей у людей, страдающих астмой, демонстрируют повышенное OXPHOS и активность цикла трикарбоновых кислот [18, 19]. Хотя большинство исследований сосредоточены на измерении функции митохондрий в клетках солидных тканей в первичном патологическом очаге, накопившиеся данные предполагают, что вызванные патологией изменения в биоэнергетике могут происходить системно. Например, при болезни Паркинсона ингибирование митохондриального комплекса I, наблюдаемое в нейронах черной субстанции, также было констатировано в циркулирующих тромбоцитах [20]. Аналогично у страдающих астмой повышенное OXPHOS наблюдалось не только в клетках дыхательных путей, но и в циркулирующих тромбоцитах [21]. Таким образом, растет осознание того, что системная оценка биоэнергетической функции не только может обеспечить понимание патогенных механизмов, но также потенциально применима в качестве инструмента персонализированной медицины для диагностики заболеваний, мониторинга динамики и оценки терапевтической эффективности.

Клетки крови как системные маркеры биоэнергетики

Хотя значение исследования биоэнергетического статуса очевидно, существует много препятствий для измерения функции митохондрий человека в солидных тканях. Возможно, самым большим препятствием является отсутствие доступа к достаточному количеству неповрежденной жизнеспособной ткани. Только неповрежденные митохондриальные мембраны обеспечивают функциональность митохондриальной цепи переноса электронов. Таким образом, замороженная или поврежденная ткань не даст точной картины функции митохондрий. В настоящее время биопсия мышц остается «золотым стандартом» с точки зрения получения богатой митохондриями ткани человека. Однако эти исследования являются высокоинвазивными и ограничены количеством ткани, которая может быть получена [22]. С другой стороны, биомаркеры системы крови уже давно используются клинически для диагностики заболеваний и прогнозирования из-за уникального свойства крови взаимодействовать (через перфузию) с каждой системой органов, а также отвечать на воздействие факторов окружающей среды и эндогенных нейрогуморальных сигналов. В соответствии с этой концепцией использование клеток периферической крови рассматривается как реализуемая опция для измерения функции митохондрий в трансляционной медицине. Технически также возможно тестирование активности цепи переноса электронов в клетках эпителия щеки, полученных при буккальном мазке [23]. В следующих разделах будут описаны преобладающие методы, используемые для измерения биоэнергетики клеток крови, и последние достижения в этой области трансляционных исследований.

Методы измерения функции митохондрий и биоэнергетического статуса клеток крови

В конце 1980-х годов был опубликован ряд работ по изучению митохондриальных различий между здоровыми и больными индивидуумами на основе измерения активности или экспрессии изолированных митохондриальных ферментов в клетках крови. Например, S. Sangiorgi и соавт. показали, что у пациентов с мигренью активность комплекса I, комплекса IV и цитратсинтазы была снижена по сравнению с контрольной группой [24], а W.D. Parker и соавт. продемонстрировали снижение активности комплекса I в митохондриях тромбоцитов при болезни Паркинсона [25]. Аналогично изменения активности изолированных митохондриальных ферментов тромбоцитов наблюдались у пациентов с болезнью Хантингтона [26], болезнью Альцгеймера [27] и шизофренией [28]. Хотя эти исследования были важны для установления того, что митохондриальные изменения происходят в периферических клетках, важно отметить, что различная ферментативная активность изолированных митохондриальных энзимов не всегда коррелирует с аналогичными сдвигами в OXPHOS. Это связано с тем, что белки цепи переноса электронов физиологически экспрессируются в избытке, каждый комплекс осуществляет различную степень контроля над дыханием и должен быть достигнут порог ингибирования, прежде чем дефицит комплекса повлияет на выработку АТФ [29].

Одним из наиболее информативных тестов для определения функции митохондрий является измерение митохондриального дыхания, которое не только отражает активность комплексов электронно-транспортных цепей, но также непосредственно зависит от функции АТФ-синтазы и Δψ. Митохондриальное дыхание классически оценивается с использованием полярографического электрода Кларка, который измеряет потребление кислорода в клетках или изолированных митохондриях в режиме реального времени [30]. Респирометрическая система высокого разрешения Oroboros [31] (Oroboros Instruments, Австрия), представленная в 1994 г., усовершенствовала традиционную технологию электродов Кларка, чтобы обеспечить амперометрическое измерение потребления O₂ с максимальной чувствительностью и точностью [32]. Основными преимуществами системы Oroboros по сравнению с традиционными электродами Кларка являются система контроля температуры, которая позволяет измерять потребление O₂ при различных температурах в диапазоне 2—45°C, и относительно небольшой объем пробы, необходимый для респирометрического анализа [33].

Появление анализатора Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer (Agilent, США) на следующем технологическом этапе способствовало высокопроизводительным измерениям в клеточной биоэнергетике [33, 34]. В этой системе используются новые флуоресцентные датчики в формате многолуночных планшетов для одновременного измерения с высоким разрешением скорости потребления кислорода (oxygen consumption rate — OCR) и скорости закисления внеклеточной среды (extracellular acidification rate — ECAR), используемой для расчета скорости гликолиза в интактных клетках [35]. Кроме того, это единственная система, которая позволяет одновременно измерять до 90 различных образцов за один цикл и требует относительно небольшого количества клеток крови [36].

Как и респирометр Oroboros, Seahorse XF оптимизирован для последовательного введения в систему нескольких химических модуляторов для исследования различных аспектов биоэнергетики в одном и том же наборе клеток в текущем эксперименте. Наиболее распространен митохондриальный стресс-тест (Mitochondrial Stress Test — MST). MST включает внесение в клеточную систему ингибитора АТФ-синтазы олигомицина А, за которым следуют протонофор карбонилцианид-4-(трифторметокси)фенилгидразон (FCCP) и, наконец, ротенон и антимицин А — ингибиторы комплексов электронно-транспортной цепи I и III соответственно [37]. Измерения OCR после добавления этих модуляторов генерируют биоэнергетический профиль, из которого могут быть рассчитаны следующие параметры:

а) базальная скорость потребления кислорода (basal OCR). Представляет базальный уровень дыхания клеток в отсутствие каких-либо модуляторов и характеризует потребность клетки в энергии в устойчивом состоянии. Для определения митохондриальной скорости потребления кислорода (mitochondrial OCR) из базальной скорости потребления кислорода вычитается немитохондриальная скорость потребления кислорода (non-mitochondrial OCR);

б) скорость потребления кислорода в условиях протонной утечки (proton-leak OCR). Этот параметр измеряют после добавления олигомицина А. Ингибирование транслокации протонов через комплекс V (АТФ-синтаза) олигомицином А увеличивает Δψ, что уменьшает перенос электронов через комплексы I—IV. Таким образом, остаточная скорость потребления кислорода, на которую не влияет олигомицин А, обусловлена протонной утечкой через внутреннюю мембрану и не зависит от выработки АТФ. Этот параметр часто называют неэффективным дыханием. В то время как в физиологических условиях наблюдается минимальная утечка протонов, значительное увеличение утечки протонов может указывать на повреждение митохондриальной мембраны или повышенную активность митохондриальных разобщающих белков. Вычитание proton-leak OCR из базальной OCR позволяет вычислить OCR, связанную с синтезом АТФ (ATP-linked OCR);

в) максимальная скорость потребления кислорода (maximal OCR). Добавление протонофора FCCP снижает Δψ за счет переноса протонов из межмембранного пространства через внутреннюю мембрану в матрикс митохондрий, тем самым разобщая транспорт электронов комплексами I—IV с синтезом АТФ в комплексе V. Ослабление Δψ снимает ограничение с дыхательной цепи, что приводит к увеличению OCR до максимальной способности дыхательной системы, но без сопряженного синтеза АТФ. Снижение максимальной OCR может свидетельствовать о повреждении дыхательной цепи или ограничении доступности субстрата. Вычитание базальной OCR из максимальной OCR дает резервную емкость (reserve capacity OCR), показывающую до какого предела клетка может увеличить дыхание в ответ на биоэнергетический стресс;

г) немитохондриальная скорость потребления кислорода (non-mitochondrial OCR). Добавление ротенона или комбинации ротенона и антимицина А полностью ингибирует цепь переноса электронов и, таким образом, ингибирует OCR за счет митохондриального дыхания.

Остаточная OCR после введения этих соединений представляет потребление кислорода за счет клеточных процессов, отличных от митохондриального дыхания, и может включать активность ферментов липоксигеназы, циклооксигеназы, ксантиноксидазы или NADPH-оксидазы.

Примечательно, что в дополнение к модуляторам, используемым в базовом MST, множество других субстратов и ингибиторов могут быть отдельно введены в анализ для исследования конкретных аспектов энергетики [38, 39].

Планшетный формат регистрации респирометрии в клеточных суспензиях исключает возможность анализа на уровне отдельной клетки. Следовательно, считываемые параметры отражают средние значения биоэнергетических маркеров по популяции клеток и не учитывают индивидуальную межклеточную вариабельность. Этого недостатка лишена многоцветная проточная цитофлуориметрия, использующая витальную окраску Δψ-чувствительными флуорохромами — липофильными катионами (JC-1, CMXRos и др.), которые накапливаются в энергизированных митохондриях согласно уравнению Нернста и флуоресцируют в зависимости от уровня Δψ [40]. С учетом достаточного количества проточных цитометров в клинико-диагностических лабораториях отечественных лечебно-профилактических учреждений и низкой себестоимости одного определения эта технология наиболее проста для реализации.

Базальный биоэнергетический уровень клеток крови

Создание метода для точного измерения биоэнергетических характеристик клеток крови поднимает ряд вопросов, на которые необходимо ответить, чтобы использовать данный метод в качестве потенциального трансляционного исследовательского или клинического инструмента. В частности, важно определить, как следует анализировать биоэнергетические данные, каковы характеристики биоэнергетического профиля здоровых клеток крови и насколько велика индивидуальная и межиндивидуальная вариабельность в популяции.

При определении характеристик биоэнергетического профиля здорового человека важен выбор типа клеток, используемых в качестве тестерных. Из-за переменного количества митохондрий, содержащихся в каждой субпопуляции клеток крови, и дифференциальной экспрессии митохондриальных белков, поддерживающих специализированные функции отдельных типов клеток крови, последние имеют различные исходные биоэнергетические профили. Сравнение биоэнергетического профиля в различных типах клеток крови у одного индивидуума показало, что моноциты, лимфоциты и тромбоциты демонстрируют выраженный ответ на митохондриальные модуляторы в MST, в то время как нейтрофилы имеют незначительные изменения в скорости потребления кислорода, что предполагает минимальную роль OXPHOS в нейтрофилах [36]. Кроме того, отчетливые различия паттернов скорости потребления кислорода наблюдаются для моноцитов, лимфоцитов и тромбоцитов. Например, тромбоциты имеют высокую скорость АТФ-связанного дыхания при низкой резервной емкости и утечке протонов, в то время как лимфоциты имеют значительно более высокую утечку протонов при меньшем АТФ-связанном дыхании [36]. Эти данные демонстрируют, что сравнения между биоэнергетическими профилями данных следует проводить только с использованием одного и того же типа клеток.

После завершения биоэнергетических измерений в рамках анализа данных необходимо сопоставление отдельных параметров биоэнергетического профиля. Чтобы объединить параметры биоэнергетического профиля в интегральную метрику, которая обеспечивает совокупную оценку общей функции митохондрий, B.K. Chacko и соавт. предложили индекс биоэнергетического здоровья (Bioenergetic Health Index — BHI) [41, 42]. Значение BHI прямо пропорционально резервной емкости (reserve capacity OCR) и скорости потребления кислорода для синтеза АТФ (ATP-linked OCR) и обратно пропорционально процессам, не генерирующим АТФ: скорости потребления кислорода в условиях протонной утечки (proton-leak OCR) и немитохондриальной скорости потребления кислорода (non-mitochondrial OCR) (уравнение 1) [41].

Согласно этому уравнению, BHI соответствует изменениям в цепи переноса электронов или наличию субстратов и прямо пропорционален способности генерировать АТФ, но обратно пропорционален неэффективному потреблению кислорода. В соответствии с этим окислительное повреждение дыхательной цепи снижает BHI [41, 42]. Примечательно, что вычисление интегрального индекса с использованием всех измеренных параметров может выявить различия в OCR, которые могут быть неочевидны при простом сравнении отдельных параметров биоэнергетического профиля. Например, при сопоставлении отдельных параметров биоэнергетического статуса моноцитов кардиохирургических пациентов и моноцитов здоровых лиц не было выявлено значимых отличий. Однако рассчитанный BHI оказался ниже в группе кардиохирургических пациентов в сравнении с контрольной группой [43].

B.K. Chacko и соавт. выполнили многомерный корреляционный анализ шести биоэнергетических параметров тромбоцитов 85 здоровых доноров [44]. Констатирован широкий диапазон межиндивидуальных различий OCR. Например, базальная и максимальная OCR варьировали в пределах 50—150 и 50—250 пмоль O₂/мин соответственно. Однако существовала сильная корреляция между базальной OCR и максимальной OCR (113), что предполагает общий механизм регуляции этих параметров у здоровых индивидуумов [44].

Биоэнергетика клеток крови при заболеваниях

Как отмечалось выше, биоэнергетические изменения связаны с патогенезом многих заболеваний различных органов, и накопленные данные позволяют предположить, что эти митохондриальные изменения могут быть системными, а не ограничиваются первично пораженным органом. Таким образом, очевидный вопрос заключается в том, могут ли параметры биоэнергетики клеток крови служить в качестве биомаркера заболеваний. На этот вопрос отвечают результаты ряда контролируемых исследований, демонстрирующих измененную биоэнергетику клеток крови при тромбоэмболии легочной артерии [45], сепсисе [46], бронхиальной астме и болезни Паркинсона [47]. C. Avila и соавт. показали, что тромбоциты у людей с сахарным диабетом 2-го типа демонстрируют снижение базальной и АТФ-связанной OCR одновременно с повышением маркеров окислительного стресса [48]. При изучении биоэнергетики моноцитов у пациентов с порфирией установлено, что в них скорость потребления кислорода в условиях протонной утечки и максимальное дыхание значительно ниже по сравнению со здоровыми лицами. Кроме того, указанные параметры еще ниже в моноцитах у пациентов с активной порфирией по сравнению с пациентами в стадии ремиссии [49].

Нами (Г.В. Черепнев и Я.В. Прокопьев, неопубликованные данные) в пилотном исследовании был воспроизведен с модификациями цитофлуориметрический протокол [40] окрашивания сперматозоидов пациента с астенозооспермией Δψ-чувствительным рациометрическим флуорохромом JC-1 (цитометр BD FACSVerse, BD Biosciences, США) (рисунок).

Проточная цитометрия сперматозоидов пациента с астенозооспермией.

а — дот-плот распределения сперматозоидов по размеру и гранулярности; б — гистограмма распределения сперматозоидов по размеру; в — гистограмма распределения сперматозоидов по гранулярности; г — гистограмма распределения клеток региона R1 по митохондриальному потенциалу (Δψ); д — гистограмма распределения клеток региона R2 по митохондриальному потенциалу (Δψ).

Сперматозоиды разделились на субпопуляцию с большим размером и высокой гранулярностью — регион R1 и субпопуляцию с меньшим размером и низкой гранулярностью — регион R2 (см. рисунок, а). В субпопуляции R1 доля сперматозоидов с низким Δψ составила 17,6% (см. рисунок, г), в то время как в субпопуляции R2 доля сперматозоидов с низким Δψ составила 58,3% (см. рисунок, д). Таким образом, констатирована гетерогенность Δψ сперматозоидов при астенозооспермии, коррелирующая с морфологическими характеристиками клеток. Логично допустить, что именно сперматозоиды с низко энергизированными митохондриями обладают слабой подвижностью, характерной для астенозооспермии.

В совокупности перечисленные исследования демонстрируют, что биоэнергетика циркулирующих клеток крови меняется при ряде патологий и также может служить полезным инструментом для потенциального анализа патогенетических механизмов. По мере накопления биоэнергетических данных о различных патологиях можно оценивать специфичность конкретных паттернов изменений при отдельных заболеваниях, чтобы потенциально превратить этот инструмент в минимально инвазивный диагностический тест.

Параметры биоэнергетики клеток крови в качестве суррогатных маркеров для других типов клеток

Насколько биоэнергетические сдвиги в клетках крови коррелируют с биоэнергетикой солидных тканей? Многие исследования доказывают, что клетки периферической крови действительно могут отражать биоэнергетику солидных тканей в норме и при патологии. Биоптат мышечной ткани — «золотой стандарт» биоматериала для анализа функции митохондрий. В этом контексте важное значение получают результаты исследования [50], где на нечеловекообразных приматах было показано, что биоэнергетика моноцитов и тромбоцитов отражает биоэнергетику скелетных мышц, измеренную у одного и того же животного.

Клетки периферической крови отражают биоэнергетику не только в мышечной ткани. У нечеловекообразных приматов базальная и максимальная OCR тромбоцитами и моноцитами достоверно коррелируют с коэффициентом контроля дыхания митохондрий, изолированных из сердца [50]. Кроме того, максимальное дыхание моноцитов коррелирует с максимальным дыханием митохондрий, изолированных из лобной коры головного мозга [51]. В этом исследовании на группе нечеловекообразных приматов использовали 18F-дезоксиглюкоза-позитронно-эмиссионную томографическую визуализацию для неинвазивного измерения метаболизма глюкозы в различных областях мозга. Было показано, что максимальная OCR тромбоцитами и BHI моноцитов достоверно коррелируют с метаболизмом глюкозы в различных областях мозга.

При бронхиальной астме из-за увеличения скорости метаболизма аргинина в митохондриях снижается скорость гликолиза, а митохондриальное дыхание увеличивается [52]. У больных бронхиальной астмой индивидуальная биоэнергетика тромбоцитов отражает базальную и максимальную OCR и интенсивность гликолиза в эпителиальных клетках дыхательных путей [53].

В сумме эти исследования демонстрируют, что специфические параметры биоэнергетики моноцитов и тромбоцитов отражают митохондриальное OXPHOS и гликолиз в тканях различных типов. На первый взгляд это может показаться противоречащим существующей догме о том, что митохондрии в тканях отдельных типов высокоспециализированы для поддержания энергетических и сигнальных потребностей данной ткани. Действительно, между разными типами клеток существуют сильные корреляции, но абсолютные значения OCR могут сильно отличаться между различными тканями в зависимости от энергетических потребностей этой ткани. Например, максимальная OCR митохондриями головного мозга была в два раза выше, чем у моноцитов [51]. Данные различия определяют специализацию митохондрий в клетках разных типов, при этом сохраняется системное сходство. Механизмы, которые объясняют сходство в биоэнергетике между клетками разных типов, остаются неясными и, вероятно, регулируются сочетанием генетических, средовых и гуморальных факторов. Однако, пока эти механизмы раскрываются, накапливающиеся данные свидетельствуют о том, что клетки периферической крови могут быть использованы в качестве суррогатного биоматериала для оценки биоэнергетики клеток других тканей и органов.

Заключение

Несмотря на ряд проблем, клетки периферической крови становятся привлекательным тест-объектом для изучения биоэнергетических функций в норме и при патологии. В настоящем обзоре приведены доказательства, обосновывающие использование параметров биоэнергетики клеток крови в качестве биомаркеров заболеваний, а также в качестве инструмента для исследования митохондриальных механизмов. Недавние достижения в технологии биоэнергетических измерений, оптимизация анализа данных и применение этого подхода к клиническим выборкам стимулировали развитие трансляционной биоэнергетики, но до внедрения этой методики в качестве клинического инструмента необходимо преодолеть ряд препятствий. В настоящее время анализатор Seahorse XF и Δψ/ROS-чувствительные флуорохромы для лазерной проточной цитометрии обеспечивают эффективную платформу для высокопроизводительного скрининга биоэнергетики в клетках периферической крови. Многомерные методы анализа данных предоставили важную информацию о компонентах и характеристиках биоэнергетического профиля здоровых индивидуумов и его связи с метаболомом [44]. Констатирована межиндивидуальная и индивидуальная временнáя вариабельность биоэнергетических параметров клеток крови. Сравнительные исследования, демонстрирующие различия в биоэнергетике между здоровыми и больными, а также сильные корреляции между биоэнергетикой клеток крови и клиническими параметрами, показывают перспективность и диагностическую и прогностическую ценность этого инструмента.

В качестве трансляционного инструмента биоэнергетика клеток крови обеспечивает понимание митохондриальных механизмов патогенеза заболеваний и позволяет получать биоэнергетическую информацию менее инвазивным способом, чем биопсия мышц или кожи, и технологически проще, чем 18F-дезоксиглюкоза-позитронно-эмиссионная томография или 13P-магнитно-резонансная спектроскопия. Это имеет решающее значение для клинических исследований больших выборок или для пролонгированных исследований с несколькими временными точками. Как только в этих клинических испытаниях будут определены стандартные биоэнергетические параметры и значения, дискриминирующие здоровых и больных, измерение биоэнергетики циркулирующих клеток может быть внедрено в клиническую практику в качестве инструмента персонализированной медицины для патогенетической диагностики, мониторинга течения заболевания, контроля эффектов митохондриально-адресованных лекарственных веществ [54] и прогнозирования исходов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.