Введение

Традиционным методом оценки состава микробиоты раны является диагностический посев раневого содержимого. В практике работы микробиологических лабораторий широко применяется полуколичественный метод посева мазков раневого отделяемого, полученных с помощью тампонов [1, 2]. В инструктивном документе, действующем в Республике Беларусь, определена процедура дополнительного культивирования биологического материала в среде обогащения [3]. Аналогичная методология микробиологического исследования была приведена в ранее действующем и отмененном в настоящее время Приказе Минздрава СССР от 22.04.85 №535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений» [4]. В свою очередь, в современных российских клинических рекомендациях, касающихся диагностике раневой инфекции, процедура дополнительного культивирования не упоминается [5].

Микробиота, выделенная только со сред обогащения, считается контаминирующей [3] и мешает оценке результата посева для диагностики раневой инфекции. Однако в рамках современных представлений, предполагающих учет влияния межмикробных взаимодействий в составе ассоциаций и биопленки на интенсивность роста микроорганизмов и их патогенные свойства [6—10], изоляты, рассматриваемые как контаминанты, могут стать дополнительным источником информации при интерпретации результатов микробиологического исследования [11]. С появлением новых высокочувствительных методов микробиологической диагностики в клинической практике актуализируется вопрос об этиологической расшифровке инфекционных осложнений, а также определения ведущего патогена, нарушающего процесс репарации [5, 12]. В условиях вялотекущего воспаления с нечеткой клинической картиной, что является типичным состоянием для хронических ран, клиническое значение микроорганизмов, отнесенных при интерпретации результатов посева к категории контаминантов, нуждается в пересмотре.

Использование современных методов индикации и идентификации бактерий с помощью масс-спектрометрии показывает возможность обнаружения микробных ассоциаций в раневом отделяемом при отрицательных результатах диагностического посева [13]. Селективное давление антисептиков и антибиотиков, формирование биопленки, когда бактерии в ее составе проявляют более низкую метаболическую активность, могут объяснить трудности их выделения из клинического материала и возможность получения отрицательных результатов первичного посева. Это также обосновывает необходимость использования дополнительного культивирования образцов раневого отделяемого в средах обогащения с последующим учетом выделенной микробиоты.

Отсутствие четких рекомендаций по выполнению микробиологического исследования ран и интерпретации полученных результатов исследования обусловило актуальность проведения настоящего исследования, которое направлено на сопоставление данных микробиологических посевов раневого отделяемого на плотные питательные среды и после дополнительного культивирования в среде обогащения.

Цель исследования — проанализировать результаты микробиологического исследования образцов раневого отделяемого пациентов.

Материал и методы

Объектом исследования были 405 образцов раневого отделяемого пациентов, госпитализированных для оказания специализированной медицинской помощи в ожоговое отделение ГУЗ «Гомельская городская клиническая больница №1» в период с 2012 по 2020 г. Биологические образцы получали на момент поступления в стационар пациентов с разными сроками существования ран. Анализировали структуру микрофлоры острых ран (ОР) (срок раны до 3 недель, 176 проб) и хронических ран (ХР) (срок раны более 3 недель, 229 проб).

При проведении микробиологического исследования руководствовались национальными и международными рекомендациями [3, 5, 14]. Забор раневого отделяемого проводили ватным тампоном, после предварительной обработки раны [1]. При взятии материала использовали две основные технологии. Из относительно больших по размеру ран (более 5 см²) мазок из раны брали Z-методом путем прокатывания стерильного тампона в зигзагообразном направлении по поверхности раны, избегая ее краев. Для небольших (менее 5 см²) ран использовали метод N.S. Levine, предполагающий роллинг тампона от центра к периферии по всей поверхности раны или по площади не менее 1 см² [14—16]. Для доставки биологического материала в лабораторию ГУ «Республиканский научно-практический центр радиационной медицины и экологии человека» использовали транспортную среду Amies. Посев производили полуколичественным секторным методом. Предварительно тампон с биологическим материалом помещали в 1 мл жидкой питательной среды, встряхивали на вортексе. Полученную суспензию высевали 30—40 штрихами с помощью калиброванной бактериологической петли в сектор А чашки Петри. После этого петлю прожигали и производили 4 штриховых посева из сектора А в сектор I и аналогичным образом — из сектора II и из II в III, из III сектора делали дополнительную «дорожку» в центр чашки Петри. Для диагностического посева использовали кровяной агар (основа колумбийского кровяного агара/Columbia blood agar base с добавлением 5% стерильной дефибринированной лошадиной крови, Oxoid Ltd., Thermo Fisher Scientific, Великобритания), также материал высевали на среду Эндо (агар Эндо/Endo Agar, HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия), желточно-солевой агар (солевой агар с маннитом/Mannitol Salt Agar, с добавлением эмульсии яичного желтка/Egg Yolk Emulsion, HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия), среду для выделения энтерококков (желчно-эскулиновый агар с азидом натрия/Bile Esculin Azide Agar, HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия), среду Сабуро (Агар Сабуро с глюкозой и хлорамфениколом/Sabouraud Chloramphenicol, HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия).

Полуколичественный посев дополняли культивированием биологического материала в течение 24 ч при 37 °C в среде обогащения (триптиказо-соевый бульон/Tryptone Soya Broth, HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия) с последующим высевом на кровяной агар, среду Эндо, желточно-солевой агар, среду Сабуро и среду для выделения энтерококков. Идентификацию штаммов выполняли на автоматическом микробиологическом анализаторе VITEK 2 Compact (BioMerieux, Франция). В результате посева учитывались все изоляты в любом титре, выделенные на первичных плотных питательных средах, а также после среды обогащения. Обнаруженные при посеве изоляты включали в описание микробиологической структуры ОР и ХР. Отрицательным результатом посева, когда в бланке ответа указывали: «роста аэробной микрофлоры не получено», считали отсутствие выделения микроорганизмов при первичном посеве и после использования условий дополнительного культивирования в среде обогащения.

Для возможности сопоставления с установленными диагностическими титрами [2] результат представляли в количестве колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 мл раневого отделяемого. Рост до 30 колоний в секторе А принимали как 10³ КОЕ/мл, от 30 до100 — 10⁴ КОЕ/мл, более 100 в секторе А и/или до 30 колоний в секторе I принимали как 10⁵ КОЕ/мл, до 20 колоний в секторе II — 10⁶ КОЕ/мл, от 30 до40 колоний в секторе II — 10⁷ КОЕ/мл, от 60 до80 колоний в секторе II и/или колонии в секторе III — 10⁸ КОЕ/мл. При представлении количественной структуры объединяли изоляты, полученные в количестве ≤10⁵ КОЕ/мл и >10⁵ КОЕ/мл.

Для сопоставления результата посева с клиническим состоянием раны использовали рекомендации WUWHS (World Union of Wound Healing Societies) [15, 16] и мнемосхемы NERDS&STONEES [17]. Учитывали признаки, отражающие выраженность воспаления: боль, гиперемию кожи; отек и уплотнение мягких тканей; повышение местной температуры; запах из раны; экссудат и его характер; и др. Для установления стадии критической колонизации использовали клинические критерии NERDS: N (non-healing wound) — стагнация размеров раны; E (exudative wound) — увеличение количества экссудата и мацерация краев; R (red and bleeding wound) — наличие в ране крупнозернистых багровых хрупких грануляций; D (debris in the wound) — раневой детрит; S (smell from the wound) — неприятный запах. Критериями глубокой инфекции по STONEES считали: S (size is bigger) — увеличение размеров раны; T (temperature increased) — повышение температуры окружающих тканей; O (probes to or exposed bone) — углубление раны до кости; N (new areas of breakdown) — новые очаги деструкции; EE (exudate, erythema and oedema) — увеличение экссудации, гнойный характер; гиперемия и отек окружающих тканей; S (smell from the wound) — запах из раны. Основанием для установления стадии инфекционного процесса являлось одновременное присутствие в ране трех критериев, что, согласно процедуре валидации NERDS&STONEES, показывает наиболее высокий уровень специфичности и чувствительности [17].

Для статистической обработки результатов использовали частотный анализ в таблицах сопряженности с расчетом критерия χ² и точного двустороннего критерия Фишера. Значимость различий определяли при p<0,05. Статистические исследования, построение графиков проводили с помощью программного пакета Statistica 6.1 (StatSoft Inc., США, регистрационный номер лицензионной версии GS-35F-589).

Результаты

По результатам первичного секторального посева микроорганизмы были выделены из 76 (43,2%) образцов ОР и 139 (60,7%) образцов ХР. Общее количество изолятов составило 106 для ОР и 209 для ХР. Монокультуры были выделены из 47 (62,0%) проб ОР, из 61 (43,9%) пробы ХР. В 29 (38,0%) образцах отделяемого ОР и 76 (56,1%) образцах ХР высевались ассоциации, представленные двумя—четырьмя видами микроорганизмов.

В свою очередь, первичный диагностический посев 100 (56,8%) проб отделяемого ОР и 90 (39,3%) проб отделяемого ХР на плотные питательные среды роста не дал. Статистический анализ показал значимые различия в частотах положительных и отрицательных результатов посевов в ОР и ХР — χ²=12,26; p=0,005. Структура выделенной микробиоты и ее количественные характеристики представлены в табл. 1.

В ОР представители грамположительных (Грам(+)) бактерий составляли 70,7% выделенных культур (n=75), в ХР частота их обнаружения была ниже — 58,4% (n=122) (χ²=4,6; p=0,032). Во всех ранах структура Грам(+) бактерий была представлена в соответствии с убыванием частоты встречаемости следующим образом: Staphylococcus aureus (44,3%, n=47 в ОР; 37,3%, n=78 в ХР), Enterococcus faecalis (13,2%, n=14 в ОР; 14,8%, n=31 в ХР), коагулазонегативные стафилококки (coagulase-negative staphylococci — CoNS) — S. haemolyticus, S. epidermidis, S. hominis (9,5%, n=10 в ОР%; 4,8%, n=10 в ХР), Streptococcus gr.viridans (3,8%, n=4 в ОР; 1,4%, n=3 в ХР).

Грамотрицательные (Грам(–)) бактерии чаще встречались в ХР — в 40,6% (n=85) и были представлены неферментирующими Грам(–) бактериями (НФБ) (23,4%, n=49) и порядком Enterobacterales (17,3%, n=36). Среди энтеробактерий в ХР было идентифицировано 7 видов: Klebsiella pneumoniae (0,5%, n=1), Enterobacter cloacae (3,8%, n=8), Proteus mirabilis (8,6%, n=18), Enterobacter agglomerans (0,5%, n=1), Escherichia coli (2,4%, n=5), Klebsiella aerogenes (0,5%, n=1), Citrobacter freundii (0,5%, n=1). Основными представителями НФБ в ХР были Pseudomonas aeruginosa (12,0%, n=27) и Acinetobacter baumannii (8,1%, n=17); в единичных случаях выделялись A. iwoffii, P. putida, P. fluorscens. В ОР частота обнаружения Грам(–) бактерий была ниже — 26,4%, n=28 (χ²=6,21; p=0,013). Структура представителей порядка Enterobacterales была аналогичной таковой в ХР, но с меньшим видовым разнообразием. В свою очередь, в ОР значимо реже, чем в ХР, встречались НФБ — P. aeruginosa и A. baumannii (8,5%, n=9; χ²=10,47; p=0,001). В одном случае была выделена S. maltophilia (табл. 1).

Таблица 1. Качественная и количественная характеристика микробиоты ОР и ХР по результатам первичного полуколичественного посева

Примечание. НФБ — неферментирующие грамотрицательные бактерии, CoNS — coagulase-negative staphylococci, коагулазонегативные стафилококки, * — отмечены значимые различия в частоте встречаемости групп/видов микроорганизмов между ОР и ХР.

Из ХР изоляты бактерий преимущественно высевались в более высоком диагностическом титре >10⁵ КОЕ/мл (77% штаммов, n=161). Наиболее часто в количестве >10⁵ КОЕ/мл высевались Грам(–) бактерии — 37,3%, n=78. Уровень микробной обсемененности ОР был ниже — микроорганизмы в количестве >10⁵ КОЕ/мл обнаруживались в 62,3% случаев (χ²=7,62; p=0,006).

В результате использования предварительного культивирования в среде обогащения общее количество выделенных штаммов увеличилось, также расширился перечень видов. Из 58 образцов ОР дополнительно было получено 87 изолятов: 66 изолятов Грам(+) бактерий, 18 изолятов Грам(–) бактерий, 3 — C. albicans. Из отделяемого ХР (n=56) выделено 105 штаммов: 73 изолята Грам(+) бактерий, 30 — Грам(–) бактерий, 2 — C. albicans и C. parapsilosis. Штаммы выделялись как в виде монокультур, так и в составе ассоциаций, а также дополняли микробиоту первичного диагностического посева. Детальная видовая характеристика изолятов, обнаруженных после использования среды обогащения, представлена в табл. 2.

Таблица 2. Характеристика микробиоты острых и хронических ран с использованием предварительного культивирования в среде обогащения

Примечание. НФБ — неферментирующие грамотрицательные бактерии, CoNS — coagulase-negative staphylococci, коагулазонегативные стафилококки.

Таким образом, включение дополнительного этапа культивирования в среде обогащения существенно расширило информативность микробиологического исследования раневого отделяемого. Количество положительных результатов посевов проб ОР увеличилось с 43,2% (n=76) до 76,1% (n=134), проб ХР — с 60,7% (n=139) до 85,2% (n=195). Дополнительно было выделено: из ОР 42 монокультуры и 16 ассоциаций (35 изолятов); из ХР — 39 монокультур и 17 ассоциаций (36 изолятов). Состав ассоциаций, полученных при первичном посеве проб ОР, был дополнен 3 изолятами S. aureus, 2 изолятами энтеробактерий (E. cloacae, E. coli), 2 изолятами НФБ (A. baumannii, P. aeruginosa). Ассоциации в ХР пополнили: 1 штамм S. aureus, 3 — S. haemolyticus, 4 изолята НФБ (A. baumannii, P. aeruginosa), 5 изолятов энтеробактерий (P. mirabilis, E. cloacae, C. farmer, K. pneumoniae), 10 штаммов E. faecalis, 1 — C. albicans. Необходимо отметить, что ряд видов, обнаруженных только со среды обогащения, а именно: A. baumannii, P. aeruginosa, S. aureus, E. faecalis, E. coli, K. pneumoniae, нельзя относить к категории контаминантов. Согласно действующим в Республике Беларусь нормативным актам эти виды относятся к категории клинически значимых и подлежат обязательному мониторированию в организациях здравоохранения [18].

Среди общего количества микроорганизмов, выделенных из ОР (n=193) и ХР (n=314), изоляты со среды обогащения составляли существенный объем — 47,2 и 39,0% в виде монокультур; 43,2 и 30,8% в виде ассоциаций (в ОР и ХР соответственно). Аналогичной была частота выделения микроорганизмов в количестве >10⁵ КОЕ/мл после посева на плотные питательные среды — 30,3 и 37,5% в ОР, 40% в ХР. Исключение составляли ассоциации ХР, где изоляты в количестве >10⁵ КОЕ/мл обнаруживались с наиболее высокой частотой — 56,6%. Реже микроорганизмы обнаруживались в количестве ≤10⁵ КОЕ/мл — 22,5 и 19,2% в ОР; 21,0% в ХР, а в составе ассоциаций — с минимальной частотой 12,6%. Количественная структура выделенной микробиоты с учетом дополнительного культивирования представлена на рисунке.

Количественная структура микробиоты, выделенной из острых и хронических ран.

По результатам клинической оценки ХР с использованием критериев мнемосхем NERDS&STONEES у 74 (38%) пациентов, имеющих положительный результат микробиологического посева, установлена критическая колонизация, у 10 (5,3%) пациентов — глубокая инфекция, большинство ХР — 56,7% (n=111) считались колонизированными. Микроорганизмы, выделенные только со среды обогащения (триптиказо-соевый бульон), с практически одинаковой частотой обнаруживались в колонизированных и критически колонизированных ХР — 25,2% (n=28), 29,7% (n=22). У 6 (60%) пациентов, имеющих признаки глубокой инфекции, микроорганизмы также высевались со среды обогащения, дополняя состав микробиоты первичного посева.

Микробиота, выделенная из ОР минимальных сроков существования, от нескольких часов до 2—4-х суток (n=70, 76%), считалась контаминирующей в любом диагностическом титре при отсутствии клинических признаков инфекции. В свою очередь, гранулирующие ОР, существующие от 5 суток до 3 недель, имели положительный результат посева в 76,2% случаев (n=64), в том числе после использования дополнительного культивирования, при этом проявляли клинические признаки колонизации и критической колонизации (n=36, 56,2% и n=28, 43,8%). Микробиота высевалась из этих ОР в различном количестве, что обосновывало необходимость учета микроорганизмов, выделенных как с первичного посева, так и со среды обогащения, при интерпретации результатов микробиологического исследования ран.

Обсуждение

Микроорганизмы являются доказанным патогенетическим фактором формирования ХР. Пролонгация воспаления в ХР и, как следствие, редукция кровотока, нарушение обменных процессов, делает рану более восприимчивой к инфекции. Простое присутствие бактерий в ране не эквивалентно понятию «раневая инфекция» [15, 19]. На современном этапе в клинической практике используют следующие понятия, отражающие взаимоотношения между микроорганизмом и раной: контаминация, колонизация, критическая колонизация, глубокая и системная инфекция [20]. Для контаминации характерно только присутствие микроорганизмов без активной репликации, клинические признаки отсутствуют. При колонизации пролиферирующие микробы не вызывают явного повреждения тканей, однако начальные признаки местного воспаления присутствуют, на этой стадии бактерии вносят вклад в задержку заживления. Критическая колонизация является пограничным состоянием, когда рана на нахождение микробов реагирует первыми клиническими признаками. К критической колонизации относят также нахождение в ране резистентных к антибиотикам штаммов [20, 21]. Раневая инфекция сопровождается активным размножением бактерий и явными местными (при локальной инфекции) и системными (при системной инфекции) клиническими признаками. Современные рекомендации также включают необходимость исследования биопленки (учет ран, потенциальных на наличие биопленки), когда, несмотря на низкое микробное число, в ХР регистрируются клинические признаки хронического воспаления, слабая эритема, изменяется количество экссудата, появляются патологические изменения грануляционной ткани [15].

Бактериологическое исследование является основным методом диагностики инфекционного процесса в ране (уровень доказательности 1А). Традиционно в практике микробиологических лабораторий используется способ посева «тампон-петля». При интерпретации результатов исследования применяют критерии выраженности роста [1, 3, 4]: 1 степень — очень скудный рост (до 10 колоний); 2 степень — скудный рост (10—25 колоний); 3 степень — умеренный рост (не менее 50); 4 степень — обильный, сплошной рост микрофлоры. Рост колоний 3 и 4 степени рассматривают как свидетельство этиологически значимой роли данного микроорганизма в воспалительном процессе, 1 и 2 степень интерпретируется как контаминация.

Ориентировочная оценка выраженности роста объяснялась использованием нестандартных тампонов для взятия раневого отделяемого [4]. Однако на современном этапе применение тампонов промышленного производства в комплексе с унифицированными методами получения мазка из раны может обеспечить возможность оценки результатов полуколичественного посева в КОЕ/мл и сопоставления его с результатами стандартного количественного метода исследования биоптатов. Согласно интерпретации результатов исследования биоптатов, присутствие микроорганизма в количестве >10⁵ КОЕ/г ткани подтверждает его значение как этиологического агента раневой инфекции. Количество ≤10⁵ КОЕ/мл считается этиологически не значимым. Это же количество рассматривается как фактор, определяющий успешность/неуспешность выполнения аутодермопластики [2]. С другой стороны, раны не заживают, несмотря на низкое микробное число, при этом не демонстрируют признаки раневой инфекции. Предполагают, что это связано с колонизацией раны продуцентами биопленки. Отмечают, что первичный посев оказывается не всегда эффективным для обнаружения таких бактерий, что связано с изменением метаболических свойств в составе биопленки [22].

В исследовании A. Morris и соавт. установлена возможность выделения 27% клинически значимых изолятов при культивировании различных видов биологического материала в средах обогащения (результат первичного посева на плотные питательные среды был отрицательным), что явилось основанием изменения тактики лечения пациентов. Структуру выделенных микроорганизмов представляли S. aureus, CoNS, K. pneumoniae, E. coli, P. aeruginosa, C. glabrata, Streptococcus pyogenes. К клинически незначимым контаминантам исследователи отнесли Diphtheroids, Bacillus spp. [23]. Derby P. с соавт., используя дополнительное культивирование образцов патологического материала, увеличили количество потенциально значимых в клиническом отношении изолятов на 7% [24]. R. Siletti и соавт. установлено, что из 520 образцов раневого отделяемого 462 образца дали положительный результат первичного посева, 29 — положительный рост только после среды обогащения, 16 — по результатам роста в среде обогащения дополнили структуру выделенных микроорганизмов первичного посева. Выделенные со сред обогащения изоляты S. aureus, S. pyogenes, S. aureus/Enterococcus spp. и др. обосновали изменение лечебной тактики — спектра используемых антибиотиков [25].

В нашем исследовании также показана эффективность использования дополнительного культивирования в среде обогащения для расширения качественных характеристик микробиоты, выделяемой из ОР и ХР. Культивирование образцов из ран в среде обогащения увеличило количество положительных результатов посевов, расширило состав ассоциаций. Изоляты, полученные с помощью дополнительного культивирования составляли значительное количество среди общего числа микроорганизмов, в том числе выделялись бактерии, подлежащие обязательному мониторингу.

Результаты микробиологического исследования сопоставляются в соответствии с клинической картиной. В сравнении с классическими симптомами инфекции ОР — боль, эритема, отек мягких тканей, гнойное отделяемое, повышение местной температуры, клиническая картина инфекции ХР не всегда дает объективную информацию, симптомы часто бывают скрытыми, что обусловлено особенностями патогенеза ХР. Для ХР возникают трудности в определении стадий колонизации и критической колонизации, а также индикации момента перехода одной стадии в другую при прогрессировании инфекционного процесса [1].

Настоящее исследование показало, что результаты клинической оценки раны не всегда совпадают с результатами первичного микробиологического посева. Из ХР, гранулирующих ОР, имеющих признаки критической колонизации, в ряде случаев микроорганизмы, включая клинически значимые виды, выделяются только после использования сред обогащения, что предопределяет необходимость включения результатов этого этапа микробиологического посева в отчет лаборатории.

Заключение

При выполнении микробиологического посева раневого отделяемого рекомендуется использовать полуколичественный секторный посев, который позволяет получить результат исследования в КОЕ/мл и обеспечивает возможность сопоставления его с результатами стандартного количественного метода исследования биоптатов. Применение дополнительного культивирования пробы в среде обогащения расширяет качественные характеристики микробиоты, повышая информативность микробиологического исследования раневого отделяемого. Исследование показало, что культивирование проб из ран в среде обогащения увеличило количество положительных результатов посевов с 43,2 до76,1% для ОР и с 60,7 до 85,2% для ХР, расширило состав ассоциаций, а также обеспечило дополнительное обнаружение видов, относящихся к категории клинически значимых и подлежащих мониторированию в организациях здравоохранения (A. baumannii, P. aeruginosa, S. aureus, E. faecalis, E. coli, K. pneumoniae). Информативность использования среды обогащения (триптиказо-соевый бульон) подтверждена результатами клинической оценки раны: более, чем в 25% случаев в колонизированных и критически колонизированных ХР, а также гранулирующих ОР, микроорганизмы выделялись только после этапа дополнительного культивирования. Это обосновывает необходимость учета данных, полученных в том числе только со среды обогащения, при интерпретации результатов микробиологического исследования.

Исследование выполнено в рамках финансируемого задания государственной программы научных исследований на 2021—2025 гг. ГПНИ 4 «Трансляционная медицина», подпрограмма 4.2 «Фундаментальные аспекты медицинской науки» по теме: «3.20 Изучение патогенного потенциала клинически значимых штаммов бактерий для повышения эффективности системы инфекционного контроля в стационаре».

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.