Введение

Последние несколько лет в медицинском сообществе проходят дискуссии о методах определения основного циркулирующего метаболита витамина D в крови — 25-гидрокси-витамина D (25(OH)D). Одни говорят, что единственно верным решением определения его концентрации в крови является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемным масс-спектрометрическим детектором (ВЭЖХ-МС/МС), другие утверждают, что определять содержание 25(OH)D можно и с использованием иммунохимического метода (ИХА).

Действительно, метод ВЭЖХ-МС/МС является «золотым стандартом» определения концентрации как 25(OH)D, так и широкого перечня прочих клинически значимых биомаркеров в крови. Другими областями клинического применения этого метода является метаболомика и липидомика, требующие одновременного определения от десятков до сотен аналитов. В связи с этим количество клинико-диагностических лабораторий (КДЛ), использующих в рутинной практике технологию ВЭЖХ-МС/МС, только увеличивается. Однако большинство лабораторий по-прежнему для решения большинства поставленных задач полагается на метод ИХА. Многие специалисты 10—15 лет назад считали, что ВЭЖХ-МС/МС совершит революцию в лабораторных исследованиях в КДЛ, и данная технология быстро заменит ИХА. Этого не произошло из-за трудоемкого процесса пробоподготовки и анализа, а также ввиду высокой стоимости хроматографического и масс-спектрального оборудования. Для того чтобы метод ВЭЖХ-МС/МС стал неотъемлемой частью рутинных операций в области клинической химии, производители оборудования должны стремиться к полной автоматизации и «кнопочному дизайну» своих инструментов.

При работе с автоматическими анализаторами залогом получения качественного результата являются поддержание оборудования в исправном состоянии (техническое обслуживание, бережное обращение), своевременная калибровка, постоянный контроль качества работы тест-системы, а также автоматический экспорт результатов в лабораторную информационную систему. Для хроматографического метода вышеуказанные аспекты являются также крайне важными, однако не менее значимым фактором становится профессионализм специалистов, которые разрабатывают и валидируют методики, а впоследствии осуществляют пробоподготовку образцов и интерпретацию результатов.

В рамках работы Объединенного комитета по прослеживаемости в лабораторной медицине (JCTLM) ряд производителей иммунохимических тест-систем на витамин D начали использовать калибровочный материал, который соответствует NIST SRM 2972 (25-Hydroxyvitamin D₂ and D₃ Calibration Solutions) [1]. Использование такого калибровочного материала позволяет получать сопоставимые результаты вне зависимости от выбранного метода определения.

ООО «Научный центр ЭФиС» при сотрудничестве с ФГБУ «Федеральный научный центр физической культуры и спорта» проводит исследования по сходимости результатов, полученных при использовании различных лабораторных методов. В данной работе приводятся результаты сравнения определения концентрации 25(OH)D в сыворотке методами ИХА и ВЭЖХ-МС/МС.

Материал и методы

Для сравнения методов ВЭЖХ-МС/МС и ИХА выбраны 50 обезличенных случайных образцов сыворотки крови из архива ООО «Научный центр ЭФиС», отобранных в вакуумные пробирки с активатором свертывания и гелем фирмы «GreinerBio-One», Австрия, с длительностью хранения не более 2 нед при температуре –25 °C. После размораживания образцы анализировали с использованием рассматриваемых в данной работе методов 1 день с использованием одной вакуумной пробирки. Определение иммунохимическим методом осуществлялось на автоматическом анализаторе UniCell DxI 800, «Beckman Coulter, Inc.» (США), с использованием реагента Access 25(OH) Vitamin D Total, лот 922472, срок годности 31.07.21, и калибратора Access 25(OH) Vitamin D Total Calibrators, лот 922477, срок годности 30.06.21.

ВЭЖХ-МС/МС-анализ выполняли на жидкостном хромато-масс-спектрометре с тройным квадрупольным масс-анализатором LCMS-8060, «Shimadzu», Япония. В качестве стандартов использовались образцы 25-OH-D₃ и 25-OH-D₂ высокой чистоты (>99%) фирмы «Sigma Aldrich», США. Для разделения соединений использовали метод обращенно-фазовой хроматографии с использованием аналитической колонки Acquity UPLC BEH C18, 2,1×100 мм, 1,7 мкм и защитной колонки Acquity UPLC BEH C18 5×2,1 мм, 1,7 мкм, обе производства «Waters Inc.» (США).

Для определения 25-OH-D₃ и 25-OH-D₂ выбраны характеристичные переходы, обладающие наибольшей интенсивностью и селективностью, один из которых использовался для количественного, а другие — для качественного определения. Идентификацию метаболитов витамина D проводили по времени удерживания и отношению интенсивности иона-предшественника к ионам-продуктам. Для количественного определения 25-OH-D₃ и 25-OH-D₂ использовали метод градуировочного графика. ВЭЖХ-МС/МС-методика определения 25-OH-D₃ и 25-OH-D₂ является линейной в диапазоне концентраций анализируемых соединений от 1 до 200 нг/мл.

Статистический анализ

Статистический анализ данных выполняли с помощью пакета программ IBM SPSS Statistics 20, Microsoft Excel 2007. Количественные непрерывные показатели проверялись на нормальность распределения с помощью критерия Колмогорова—Смирнова. Из методов параметрической статистики применялся t-критерий Стьюдента для оценки количественных непрерывных величин при нормальном распределении. Результат или разница значений считались достоверными при уровне значимости α≤0,05. Для расчета коэффициента корреляции применялся ранговый метод Спирмена. Регрессионный анализ для определения степени связи между показателями проводился методом линейного тренда.

Результаты

Во всех отобранных для исследования образцах концентрации 25-OH-D₂, измеренные методом ВЭЖХ-МС/МС, находились ниже предела количественного определения методики (<1 нг/мл), поэтому далее для выражения концентраций витамина 25-OH-D₃, полученных ВЭЖХ-МС/МС и ИХА, мы будем использовать термин 25(OH)D.

Статистическая значимость нормальности распределения результатов витамина D,полученных ВЭЖХ-МС/МС и иммунохимическим методами, составила 0,696 и 0,581 соответственно, по критерию Колмогорова—Смирнова, т.е. данные числовые ряды имеют нормальное распределение.

В таблице представлена сводная статистика результатов определения 25(OH)D, полученных исследуемыми методами.

Сводная статистика результатов определения витамина 25(OH)D методами масс-спектрометрии и иммунохимии

При оценке коэффициента корреляции ранговым методом Спирмена выявлена высокая двусторонняя корреляция результатов — 0,971 (p<0,001).

При сравнении 47 образцов, содержащих 25(OH)D в диапазоне от 3,53 до 80,55 нг/мл, коэффициент вариации составил в среднем 5,04±3,31% (мин. 0,2, макс. 13,3).

Смещение результатов, полученных на автоматическом анализаторе UniCell DxI 800 по сравнению с эталонной методикой ВЭЖХ-МС/МС, рассчитанное по графикам Блэнда—Алтмана, составило 2,32% (доверительный интервал 95% от –7,62 до 12,27) и приведено на рис. 1.

Рис. 1. График Блэнда—Алтмана для данных 25(OH)D, полученных на автоматическом анализаторе UniCell DxI 800 по сравнению с эталонной методикой ВЭЖХ-МС/МС.

На рис. 2 показан линейный регрессионный анализ ассоциации полученных результатов определения витамина 25(OH)D исследуемыми методами.

Рис. 2. Ассоциация результатов измерений 25(OH)D методами ИХА и ВЭЖХ-МС/МС.

Обсуждение

Результаты, полученные методами ИХА и ВЭЖХ-МС/МС, показали очень хорошую сходимость, это также подтверждается результатами внешней оценки качества EQAS, коэффициент вариации в цикле 17 (январь 2020 г. — декабрь 2020 г.) в программе Иммунохимия (ежемесячная) не превышал 13,3% по измеренным нами результатам анализа контрольного материала методами ИХА (UniCell DxI 800) и ВЭЖХ-МС/МС.

В трех исключенных из статистической обработки образцах с использованием обоих методов анализа получены высокие концентрации 25(OH)D, причем результаты ВЭЖХ-МС/МС по сравнению с ИХА были значительно ниже. Концентрации 25(OH)D, измеренные методом ИХА, составили 135,7, 175,5 и 210,68 нг/мл, ВЭЖХ-МС/МС — 73,8, 90,4 и 92,2 нг/мл соответственно. Мы предполагаем, что завышенные концентрации 25(OH)D, полученные методом ИХА, могут объясняться высокой перекрестной реактивностью входящих в состав реагента антител с короткоживущим «почечным» метаболитом витамина D — 1,25-дигидроксивитамином D. Данная гипотеза подкрепляется информацией, указанной в инструкции к иммунохимическому набору [1].

Заключение

Выбор метода определения витамина D в крови остается полным предпочтением направляющего лечащего врача. Результаты, полученные с использованием набора Access 25(OH) Vitamin D Total, «Beckman Coulter» (анализатор UniCell DxI 800), показали близкие результаты с «эталонным» методом ВЭЖХ-МС/МС. Для исключения возможной перекрестной реактивности мы не рекомендуем принимать препараты, содержащие витамин D, за 12 ч до предполагаемого взятия крови при анализе витамина D методом ИХА. Такого ограничения при использовании ВЭЖХ-МС/МС нет.

Конфликт интересов и источники финансирования отсутствуют.

The authors Declare no conflicts of interest.

Авторы подтверждают, что статья или ее части ранее не были опубликованы.