Уважаемые читатели журнала «Лабораторная служба»!

Несколько совещаний рабочей группы ФЛМ по лабораторной диагностике COVID-19 были посвящены обсуждению возможностей и ограничений объединения (пулирования) проб, уже в течение длительного времени применяемого в службе крови и активно обсуждаемого в последнее время в зарубежной печати и рекомендациях ВОЗ в качестве одного из способов увеличения производительности и снижения затрат при исследованиях по выявлению SARS-CoV-2. Более того, в условиях имевшей место острой нехватки возможностей выполнить требуемый объем исследований по выявлению SARS-CoV-2 такой подход применялся и в некоторых отечественных лабораториях, взявших на себя риски и ответственность за его использование в отсутствие официальных рекомендаций.

В результате состоявшихся дискуссий рабочая группа не смогла прийти к единому мнению о целесообразности практического использования такого подхода при выявлении SARS-CoV-2. Было принято решение о подготовке обзора публикаций по этой тематике, отражающего имеющиеся в них «за» и «против» его практического использования. Члены рабочей группы И.А. Ольховский и В.А. Гущин взяли на себя труд по подготовке обзора, в ходе работы над которым к ним присоединились коллеги Н.А. Кузнецова и О.В. Рубальский. Помимо имеющихся данных литературы, авторы обзора, текст которого представлен ниже, дали свое видение возможностей практического применения технологии объединения проб при выявлении SARS-CoV-2 в когортах населения с распространенностью инфекции не более 10% в условиях пиковых нагрузок на лабораторные мощности.

Мы были бы признательны читателям журнала за предоставление своих мнений по материалам настоящего обзора.

С уважением,

Сопредседатели рабочей группы ФЛМ по лабораторной диагностике COVID-19

В.Н. Малахов

О.А. Тарасенко

М.В. Шульгина

Введение (постановка проблемы)

Научные данные свидетельствуют о том, что вирус SARS-CoV-2, вызвавший пандемию коронавирусной инфекции COVID19, передается, прежде всего, от человека к человеку при непосредственном контакте и реже — опосредованно путем переноса вируса с контаминированных поверхностей на слизистые оболочки. Проявления инфекции SARS-CoV-2 варьируют от легкой степени до тяжелой. При этом легкое течение может не иметь специфических признаков, по которым можно отличить инфицирование SARS-CoV-2 от других ОРВИ, а у многих людей, инфицированных SARS-CoV-2, симптомы совсем не появляются, несмотря на положительные ПЦР-тесты. Считается, что риск передачи от бессимптомных случаев довольно высокий, достигая 48 и 62% случаев заражений [1], что, по-видимому, может приводить к существенному объему незадокументированной передачи вируса [2]. Можно с уверенностью полагать, что значительная доля передачи инфекции происходит до начала клинических проявлений болезни [3]. Накопленные к сегодняшнему дню данные свидетельствуют об обнаружении РНК SARS-CoV-2 у людей как минимум за 1—3 дня до появления симптомов. При этом самая высокая вирусная нагрузка, измеренная методом ОТ-ПЦР, наблюдается с момента появления первых симптомов и до 5-го дня болезни; что объясняет более эффективное распространение SARS-CoV-2 по сравнению, например, с другими респираторными инфекциями, в том числе SARS-CoV и MERS-CoV. Это имеет важные последствия для противодействия передаче SARS-CoV-2 и подчеркивает важность раннего выявления случаев заболевания и оперативной изоляции потенциального источника инфекции [3, 4].

Продолжительность выявления РНК SARS-CoV-2 обычно составляет 1—2 нед для бессимптомных лиц и до 3 нед и более для пациентов с легким или умеренно-тяжелым течением заболевания. У пациентов с тяжелой формой протекания заболевания COVID-19 выявление РНК SARS-CoV-2 может быть существенно более продолжительным. Следует также отметить, что обнаружение вирусной РНК не обязательно означает, что человек заразен и способен передавать вирус другому человеку. Информацию о продолжительности выделения вируса SARS-CoV-2 у пациентов с различным течением можно также найти в руководящем документе ВОЗ «Критерии освобождения пациентов с COVID-19 из изоляции» [5].

Вместе с тем до сих пор отсутствуют однозначные данные о связи конкретного уровня вирусной нагрузки со степенью риска передачи инфекции. Опубликованные результаты изучения зависимости инфицирования чувствительных клеточных культур от количества вируса в пробах пациентов демонстрируют снижение до 3% инфекционности проб при детекции продукта позже 30-го цикла амплификации в тестах ПЦР-РВ [6]. Наблюдения за низким риском инфицирования окружающих от выздоравливающих пациентов подтверждают данные экспериментов in vitro. Вместе с тем полученные на культурах клеток результаты не могут быть прямо перенесены на показатели контагиозности контактов между людьми. Поэтому предполагается, что человек с любым позитивным ПЦР-тестом является потенциально опасным для окружающих, хотя вероятность передачи, вероятно, будет больше все же именно у людей, имеющих большее выделение вируса.

Не вызывает сомнения, что своевременное выявление инфицированных людей, которые могут распространять SARS-CoV-2, чрезвычайно важно, поэтому общепризнанным подходом для замедления эпидемического процесса является применение массового тестирования с последующим обязательным применением противоэпидемических мероприятий. Отсутствие эффективного послетестового консультирования пациентов и своевременного наложения карантинных ограничений нивелирует профилактическую эффективность тестирования. В то время как адекватно выстроенная система скрининга и профилактических мероприятий позволит избирательно ослаблять меры по физическому дистанцированию людей в условиях пандемии, а значит снижать нагрузку на здравоохранение, с одной стороны, а с другой — гибко регулировать экономическую активность людей.

Проведение массовых скринингов с целью выявления SARS-CoV-2 у людей с бессимптомным течением заболевания считается наиболее эффективной стратегией сдерживания эпидемии, но при этом достаточно трудоемким и затратным мероприятием. При этом опыт ряда организаций, развернувших регулярное скринговое ПЦР-тестирование сотрудников (1—2 раза в неделю), демонстрирует успешность такого подхода для эффективного контроля заболеваемости персонала и обеспечения эффективной производственной деятельности в условиях пандемии.

Вместе с тем возможности быстрого наращивания объемов тестирования ограничены материальной базой лабораторий, недостатком квалифицированных кадров, недоступностью и долгими сроками поставки расходных материалов, что приводит к увеличению сроков получения результатов и снижению эффективности противоэпидемических мероприятий.

Одним из подходов к повышению эффективности и наращиванию объемов тестирования в условиях ограниченных ресурсов лабораторий во многих странах, даже с высоким уровнем финансирования здравоохранения, рассматривается объединение отдельных образцов биоматериала от нескольких пациентов (пулирование) при ПЦР-исследованиях с целью обнаружения РНК SARS-CoV-2.

Цель настоящего документа — анализ накопленного опыта применения пулирования образцов при ПЦР-исследовании для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, а также оценка возможных преимуществ и рисков в условиях деятельности российских лабораторий.

Зарубежный опыт

Возможность использования технологий пулирования образцов при диагностике COVID-19 допускается руководящими документами ВОЗ [7] при тестировании контингентов с низкой распространенностью инфекции и выполнении предварительной валидации конкретных технологических решений.

Так, использование алгоритмов пулирования позволило провести массовое тестирование 10 млн человек за 2 нед в Ухани (Китай) в мае 2020 г. При проведении тестирования образцы от 2,3 млн человек пулировались по 5 образцов от разных людей, таким образом были выявлены 56 инфицированных SARS-CoV-2. Этот метод наиболее эффективен при низкой распространенности инфекции — около 1%.

Данные показывают, что объединение до 30 образцов в пул может увеличить возможности тестирования без приобретения дополнительного оборудования и тест-наборов, обнаруживая положительные образцы с достаточной диагностической точностью. При этом показано, что погранично положительные единичные образцы могут не обнаруживаться в больших пулах, что обычно наблюдалось у выздоравливающих пациентов на 14—21-й день симптоматической инфекции. Поскольку выделение вируса после 14-го дня нетяжелой инфекции COVID-19 гораздо менее опасно для окружающих по сравнению с первыми днями заболевания, считается, что потеря таких образцов при скрининге некритична по влиянию на эпидемиологический процесс. Размер пула может соответствовать различным сценариям заражения и может быть оптимизирован в соответствии с ограничениями инфраструктуры [8].

Размещенный на сайте U.S. Food and Drug Administration (FDA) текст признает, что «объединение образцов в пулы — важный инструмент общественного здравоохранения, поскольку он позволяет быстро пройти тестирование большему числу людей, используя меньше ресурсов. Поскольку образцы объединены в пулы, ожидается, что в целом будет выполняться меньше тестов, а это означает, что будет использоваться меньше расходных материалов, однако это также позволяет вовлекать в обследование более многочисленные контингенты и позволяет пациентам быстрее получать свои результаты. Хотя существует опасение, что объединение образцов может затруднить обнаружение положительных результатов, поскольку объединение в лаборатории разбавляет любой вирусный материал, присутствующий в образцах, данные валидации наборов демонстрируют, что тесты правильно идентифицировали все объединенные образцы, содержащие положительный образец [9].

В ходе исследования, проведенного Еврейским университетом Хадасса, было проанализировано 133 816 образцов объединенных в 17 945 пулов, размерами по 5 или 8 образцов. В целом удалось сэкономить 76% реакций ПЦР по сравнению с индивидуальным тестированием с приемлемым снижением чувствительности [10].

Австралийские исследователи оценили чувствительность теста Cepheid Xpert® Xpress SARS-CoV-2 RT-PCR («Cepheid», США) для выявления РНК SARS-CoV-2 в пулах из 4 и 6 образцов. Для создания пулов были использованы клинические образцы, содержащие SARS-CoV-2, и отрицательные образцы. Результаты работы показали, что объединение по 4 или 6 образцов практически не влияет на чувствительность теста [11].

В другом исследовании оценивается эффективность протокола пулирования, в котором образцы объединяются после экстракции РНК с использованием набора 2019-nCoV CDC EUA («IDT», США). Тестирование 114 образцов, объединенных в 38 пулов (по 3 образца), не выявило существенных различий по чувствительности анализа между пулом и индивидуальными образцами [12].

Хотя предполагается, что пулирование образцов эффективно только для групп населения с уровнем инфицирования ниже 5%, теоретически даже при уровне заражения 10% объединение образцов можно использовать для уменьшения количества необходимых тестов примерно на 40% (по сравнению с индивидуальным тестированием). Хотя большие пулы являются наиболее предпочтительными для тестирования популяций с очень низким уровнем заражения, предполагается, что размер пула <10 является почти оптимальным в широком диапазоне уровней инфицирования [13].

Вопросы внедрения пулирования образцов в широкомасштабный скрининг в США обсуждались на недавнем вебинаре, запись которого представлена по ссылке https://www.darkdaily.com/webinar/pooled-testing-what-your-lab-needs-to-know-about-managing-a-fall-winter-surge-in-the-covid-19-pandemic/

Следует обратить внимание на предлагаемое программное обеспечение логистики и автоматизации разделения выборок пациентов, образцы которых могут вовлекаться в технологию пулирования. Предложенное решение позволяет уже на этапе регистрации направления автоматически формировать маршрутизацию образца и в случае положительного результата в пуле выделяет его исходные образцы для повторного тестирования в индивидуальном порядке. Использование программы практически полностью исключает проблемы перепутывания проб и «распулирования».

Более того, использование программного обеспечения позволяет фиксировать место и время взятия образца и отслеживать временные интервалы на всех этапах транспортировки и выполнения анализа до передачи результата в электронную карту пациента.

Наиболее полное изложение вопросов использования пулирования проб в практике деятельности клинических лабораторий представлено в недавней публикации [14]. Авторы выделяют пять основных критериев пригодности аналитов для технологии пулирования проб и пять основных шагов практического внедрения данных технологий.

Отечественный опыт

В Российской Федерации в настоящее время отсутствуют диагностические тест-системы, допущенные в официальном порядке для выполнения тестов в пулированных образцах.

Предварительные данные, полученные в отдельных лабораториях и озвученные при обсуждении вопроса членами рабочей группы ФЛМ, продемонстрировали, что пулирование небольшого (от 2 до 10) количества проб позволило своевременно выполнять исследования и обеспечить необходимые объемы тестирования в условиях чрезвычайно напряженной ситуации с материальным обеспечением деятельности лабораторий на начальном этапе развития эпидемии. Применение пулирования в группах пациентов, при обследовании которых доля положительных результатов не превышает 5%, и при объединении не более 3 образцов от разных пациентов не привело к значительному снижению эффективности лабораторной диагностики, позволило снизить нагрузку на лабораторию и затраты на обследование таких групп.

Принципы методик и алгоритмы пулирования образцов биоматериала

На сегодняшний день подробно описаны несколько алгоритмов пулирования проб, применение которых позволяет проводить масштабные скриниговые исследования. Пулировать можно как исходные образцы (назальные и ротоглоточные мазки), так и выделенную из образцов РНК. Все описанные ниже алгоритмы могут быть использованы для приготовления объединенных проб как исходных образцов, так и РНК.

Две схемы одинарного пулирования образцов предложены Дорфманом в 1943 г.

При использовании первого метода смешивается равное количество образцов и тестируется один раз, затем каждый образец из положительного пула тестируется индивидуально. В отрицательных пулах все образцы считают отрицательными. Схема пулирования изображена на рис. 1, а.

Второй метод пулирования более сложный и включает добавление дополнительного раунда пулирования. Смешивается равное количество образцов и тестируется (1-й раунд пулирования), затем положительный пул разбивается на дополнительные пулы и тестируется (2-й раунд пулирования), после чего каждый образец из положительного пула (после 2-го раунда) тестируется индивидуально. В отрицательных пулах все образцы считают отрицательными. Схема пулирования на рис. 1, б [15].

Рис. 1. Схема пулирования образцов по Дорфману [15].

Алгоритмы двойного пулирования:

Многомерный алгоритм (Multi-dimensions) объединения образцов является вариантом алгоритма Дорфмана. Первый раунд пулирования такой же, как описано выше, но для положительных пулов во 2-м раунде пулирование проводят с использованием «квадратной матрицы». Матрица представляет собой квадрат с 9 ячейками на каждой стороне, при этом каждая ячейка представляет индивидуальный образец. Образцы в каждой строке и каждом столбце тестируются как отдельный пул, в общей сложности проводится шесть тестов (для матрицы с 9 ячейками-образцами), где каждый образец попадает в 2 пула. Если образец содержит вирусную РНК SARS-CoV-2, оба пула (и строка, и столбец) будут положительными, что позволит идентифицировать человека. Такая квадратная матрица может иметь различные размеры, так, использование 96-луночного планшета (8 рядов и 12 столбцов) позволяет объединить 96 образцов в 20 пулов [16]. Увеличение матрицы от квадрата до куба также дает возможность увеличить количество протестированных образцов [17]. Схема представлена на рис. 2.

Рис. 2. Схема многомерного (Multi-dimensions) алгоритма пулирования образцов [15].

Тестирование за один раунд пулирования (One-step solution). Алгоритм пулирования со многими перекрывающимися группами позволяет сделать все тесты за 1 раунд. Этот подход основан на модели распределения, которая известна как триплеты Киркмана (Kirkman triples). Используется плоская матрица, в которой каждая строка представляет один тест (пулы по 3 образца), а каждый столбец — одного человека. Каждый тест должен включать в себя одинаковое количество образцов, и образец каждого человека должен быть протестирован одинаковое количество раз. Может быть удобен при работе с роботизированными станциями [18]. Схема представлена на рис. 3.

Рис. 3. Схема алгоритма пулирования образцов для тестирования в один раунд [15].

Экономические преимущества

Итоговая экономическая эффективность с учетом баланса стоимости предотвращенных случаев заражения за счет увеличенного объема скрининга, с одной стороны, и возможных потерь в связи с пропуском слабоположительных образцов, с другой, в отношении пулирования при скрининге на COVID-19 на момент подготовки настоящего документа не была исследована. Конкретные примеры экономии материальных ресурсов при тестировании пулировнных образцов, приводимые в зарубежных источниках, не могут напрямую быть перенесены в условия деятельности лабораторий в Российской Федерации в связи с существенными различиями в оплате труда сотрудников, используемого оборудования, аналитических технологий и реальной стоимости расходных материалов. Соответствующие публикации российского опыта в доступных источниках отсутствуют.

Ниже приводятся теоретические расчеты. Ориентировочная себестоимость расходных материалов рассчитана на тестирование 100 000 человек, среди которых при распространенности инфекции 1% инфицированы 1000 человек. В этом примере экономию расходных материалов оценивали, исходя из объединения 100 000 образцов в пулы по 9 для алгоритмов как одинарного, так и двойного пулирования. При этом максимальная экономия может составить около 12 млн руб, а стоимость выявления 1 случая инфицированности снизится с 32 000 до 20 000 тыс. руб. Понятно, что экономия ресурсов будет увеличиваться при снижении доли инфицированных пациентов среди обследуемого контингента и при увеличении количества образцов, собранных в одном пуле, а также от технологических решений, позволяющих экономить использование дорогостоящих импортных наконечников для дозирования.

Проблемные вопросы, связанные с использованием метода пулирования в деятельности клинических лабораторий

В литературе достаточно полно обсуждаются проблемы, связанные с применением методик пулирования, и основная из них — повышенный уровень риска пропуска инфицированных пациентов. В качестве аргумента в пользу выполнения технологий пулирования приводятся результаты исследований, демонстрирующие, что наиболее инфекционно опасные бессимптомные носители вируса отличаются его высокой концентрацией и, следовательно, вероятность пропуска тестами пониженной чувствительности по сравнению с более чувствительными тестами минимальна. Об этом свидетельствуют и теоретические расчеты, и опыт опубликованных зарубежных исследований [11, 18]. Кроме того, при использовании алгоритма пулирования первичных образцов без разведения проблемы разведения вирусной нагрузки и снижения чувствительности теста de facto отсутствуют.

Как вариант снижения вероятности ложноотрицательного результата возможно предусмотреть рекомендации по обязательному повторному тестированию пациента, что вполне вероятно при скрининге в организованных коллективах предприятий.

Более того, в сравнении с использованием допущенных для диагностики COVID-19 тестов на выявление вирусных антигенов метод ПЦР отличается большей чувствительностью даже при 10-кратном разведении образца. Исходя из этого, результат теста, выполненного методом ПЦР-РВ в пуле из 10 образцов, по диагностической чувствительности будет соответствовать выполнению десяти отдельных тестов на антиген для тех же 10 пациентов.

Вторым проблемным аспектом может стать повышенный риск перепутывания проб при дополнительных манипуляциях, связанных с процедурами пулирования образцов. В этом отношении следует указать, что проблемы перепутывания проб относятся к вопросам организации технологического процесса и настроек лабораторного программного обеспечения, имеющийся опыт позволяет минимизировать возможные риски. В статье [12] представлено описание лабораторной стратегии для уменьшения ошибок в процессе объединения, которые включают: 1) надзор за процессом сборки пула вторым сотрудником; 2) проверку ручных расшифровок вторым сотрудником; 3) запрет на сообщение об отрицательных объединенных образцах до завершения индивидуального тестирования положительных пулов; 4) использование стандартных рабочих листов для записи двух идентификаторов (номер образца и имя пациента) каждого образца в пулах; 5) требования к оператору подписи на каждом этапе процесса тестирования. Недавно во время цитируемого выше вебинара был представлен пример программного обеспечения для автоматизированных станций пулировнания образцов.

Характерные для России проблемы могут быть также связаны с необходимостью пересматривать тарифы ОМС при выполнении пулирования проб в случае снижения стоимости такого тестирования. Наши аргументы, позволяющие преодолеть возникающие сомнения: взаимодействие с ФОМС в вопросе использования пулирования в случае расширения тестирования пациентов в рамках гарантированной медицинской помощи может быть решено за счет выделения отдельного временного тарифа для отдельных обследуемых контингентов либо для выделенных лабораторий, обследующих выделенные контингенты пациентов с низкой распространенностью позитивных результатов. В качестве альтернативного прецедента подобных решений можно привести примеры тарификации сложных тестов, предполагающих проведение в отдельном проценте случаев подтверждающих постановок (диагностика вирусных гепатитов, ВИЧ-инфекции и др.). Как и случае с тестами пулированных проб на COVID-19, аналогия заключается в том, что в каждой аналитической серии для подтверждающих повторных тестов используется разное количество расходных материалов в зависимости от количества действительно позитивных образцов.

В случаях, когда обследуются бессимптомные пациенты по личной инициативе за счет собственных средств или средств работодателя, вопрос оплаты из средств ФОМС не рассматривается в принципе. Важно отметить, что внедрение технологии пулирования повлечет снижение стоимости, что повысит доступность тестирования и возможности выполнения повторных исследований, а в итоге приведет к повышению эффективности противоэпидемических мероприятий и снижению риска инфицирования населения.

Выводы

1. Пулирование образцов при выполнении молекулярно-генетических анализов может быть применено к когортам населения с распространенностью инфекции не более 10% в условиях пиковых нагрузок на лабораторные мощности при обязательном выполнении внутрилабораторного контроля конкретного уровня чувствительности выполняемого теста. Оптимальные методики и алгоритмы работы с пулированными образцами требуют специальной валидации в условиях работы российских лабораторий.

2. Основным ограничением использования пулирования образцов для выявления вируса SARS-CoV-2 в настоящее время является отсутствие в инструкциях к диагностическим тест-системам соответствующей опции. Считаем целесообразным внесение возможности применения пулирования образцов в рамках оговоренных ограничений при подготовке фирмами-производителями комплекта документов для получения Регистрационного удостоверения Росздравнадзора.

3. Считаем актуальным вопрос организации производства и использования в внутрилабораторном и межлабораторном контроле контрольных материалов с установленным уровнем вирусной нагрузки.

4. Проведение молекулярно-генетического тестирования вируса SARS-CoV-2 в пулированных образцах до внесения необходимых дополнений в инструкции фирм-производителей диагностических тест-систем допустимо выполнять в медицинских организациях на основании локальных документов, соответствующих действующему законодательству, как действие в чрезвычайных обстоятельствах.

5. Считаем целесообразным организацию клинико-лабораторного исследования, направленного на изучение диагностической и экономической эффективности использования разных алгоритмов пулирования образцов при обследовании отдельных контингентов населения.

P.S.

На момент подачи данного документа для размещения на страницах журнала «Лабораторная служба» в Российской Федерации развернута массовая вакцинация населения против инфекции COVID-19 и приняты законодательные акты, ограничивающие объемы обязательного тестирования граждан на COVID-19. Вместе с тем, несмотря на результативность принятых решений по обеспечению лабораторий новым оборудованием и расходными материалами, накопление опыта работы специалистов, представленные вопросы использования пулированных проб остаются актуальными. Прежде всего, в связи с предоставляемой возможностью снижения затратности и сроков тестирования и как результат — экономией бюджета здравоохранения и повышения доступности выполнения тестов для большего числа людей, в том числе на платной основе. Кроме того, до сих пор остается до конца неясной частота потенциально эпидемически опасных случаев выделения вирусных частиц у вакцинированных людей при бессимптомном или малосимптомном проявлении заболевания. Наконец, собранная в настоящем документе информация и рекомендации могут быть полезны при возможном появлении новых мутаций коронавируса, устойчивых к поствакцинальному иммунитету, а также для оперативных мероприятий в случае новых глобальных эпидемий.