Введение

Развитие современной медицины требует совершенствования методов и средств, применяемых в лабораторной диагностике во всех ее аспектах и проявлениях. Постановка диагноза, мониторинг лечения больного, определение перспектив излечения во многом зависят от точности (правильности и прецизионности) результатов измерений, выполняемых в клинической лаборатории. Существующие в этой области международные и отечественные нормативные документы ISO 17511:2020 и ГОСТ ISO 17511-2011 подчеркивают, что измерение величин в биологических пробах требует использования референтных систем измерений, основанных на применении референтных методик измерений и референтных материалов [1, 2]. Именно за счет коммутативных матричных стандартных образцов (вторичных калибраторов) в большинстве случаев в измерениях, выполняемых в лабораторной медицине, реализуется передача единицы от первичных эталонов или международно признанных референтных методов и материалов, что и обеспечивает прослеживаемость результатов измерений. При этом необходимо подчеркнуть, что достижение прослеживаемости результатов измерений является не столько самоцелью, сколько средством получения достоверных и сопоставимых результатов.

В 2012 г. Международное бюро мер и весов (BIPM), Международная федерация клинической химии и лабораторной медицины (IFCC) и Международная организация по аккредитации лабораторий (ILAC) выступили учредителями Объединенного комитета по прослеживаемости в лабораторной медицине (JCTLM) — международной структуры, координирующей и направляющей деятельность по внедрению идеологии прослеживаемости результатов измерений в лабораторной медицине и созданию глобальных условий для обеспечения прослеживаемости. JCTLM поддерживает базы данных референтных материалов и методов, а также лабораторий, оказывающих референтные измерительные услуги в лабораторной медицине [3]. С 2017 г. ФГУП «ВНИИМ им. Д.И. Менделеева» как национальный метрологический институт входит в состав организаций — членов JCTLM.

Особенности биологической матрицы, составляющей клинический материал, предполагают в некоторых случаях получение матрично-зависимых результатов при определении показателей количественного состава исследуемого образца [4]. Многочисленные зарубежные матричные референтные материалы национальных метрологических институтов, предназначенные для определения низкомолекулярных органических соединений, таких как креатинин, глюкоза, мочевина и т.п., в сыворотке крови, моче и других биологических матрицах, имеют статус сертифицированных референтных материалов (Certified Reference Material — CRM). Материалы этого типа сертифицируют (в отечественной терминологии — аттестуют) по референтным методикам и прослеживают к единицам СИ с применением методов высшей точности (газовая хроматография/масс-спектрометрия с изотопным разбавлением — ГХ/МС-ИР, высокоэффективная жидкостная хроматография/масс-спектрометрия с изотопным разбавлением — ВЭЖХ/МС-ИР и др.) [5]. Перечисленные типы измерений относятся к категории органического анализа и являются предметом интересов Рабочей группы по органическому анализу (OAWG CCQM BIPM).

Измерения биологически значимых параметров макромолекул или их комплексов биологического происхождения составляют предмет биоанализа. В последние годы основные направления биоаналитических измерений — измерения нуклеиновых кислот, белков и клеток, выделились в отдельные Рабочие группы в структурах BIPM. Эти измерения имеют свои особенности, нехарактерные для традиционных физико-химических измерений. Так, с точки зрения метрологии, последовательность нуклеотидов, или сиквенс, относят к качественным свойствам (nominal properties), но именно уникальность последовательностей нуклеотидов обеспечивает возможность их направленного выявления и измерений их содержания в клиническом материале. Сиквенсы, расшифрованные в результате аналитического определения последовательности нуклеотидов (секвенирования), депонируют в банки данных, участвующие, как правило, в международном сотрудничестве баз данных последовательностей нуклеотидов (International Nucleotide Sequence Database Collaboration — INSDC) [6]. В настоящее время в проекте INSDC принимают участие три банка данных — GenBank [7, 8], European Nucleotide Archive — ENA [9], и DNA Databank of Japan — DDBJ [10, 11]. Таким образом, результаты измерений нуклеиновых кислот должны прослеживаться к референтным материалам, аттестованным по содержанию молекул ДНК/РНК, содержащих целевые референтные последовательности нуклеотидов.

Измерения, выполняемые в области клеточного анализа, приобретают особую значимость в связи с развитием клеточной заместительной терапии, где «доза клеток» является ключевым параметром. К важным измеряемым показателям относится не только общее число клеток, но и число клеток, экспрессирующих определенный биомаркер, так называемое отношение числа CD-4(+) лимфоцитов к числу CD-8(+) лимфоцитов. Разработка соответствующих референтных материалов и методов ведется участниками Рабочей группы по клеточному анализу (CAWG CCQM BIPM) [12, 13].

В большинстве случаев используемые в Российской лабораторной медицине калибраторы и контрольные материалы, как правило, не имеют официального метрологического статуса и аттестуются с помощью рутинных методов анализа, применяемых в клинико-диагностических (КДЛ) лабораториях. Таким образом, для подавляющего числа лабораторных показателей нет ни прослеживаемых стандартных образцов состава биологических проб, ни аттестованных методик, не говоря уже о материалах типа CRM и референтных методиках.

В настоящей статье мы попытались сформулировать основные пути развития и внедрения методов высшей точности в области органического анализа и биоанализа и показать, как участие ФГУП «ВНИИМ им. Д.И. Менделеева» в международных сличениях, организованных Рабочими группами CCQM BIPM, может обеспечить достижение прослеживаемости для целого ряда измерений в лабораторной медицине.

Измерение низкомолекулярных органических соединений в практике лабораторной медицины

В конце прошлого столетия в международной практике в качестве референтного метода количественного определения уровня низкомолекулярных органических соединений в сыворотке крови был принят метод ГХ/МС-ИР. Этот метод широко использовался и используется до сих пор в качестве референтной процедуры в лабораториях США и Европы, а также применяется при аттестации стандартных образцов сыворотки крови. В последние десятилетия все большую популярность для анализа биологических матриц приобретает метод ВЭЖХ/МС. Высокая селективность, точность и воспроизводимость измерений в сочетании с несложной и быстрой процедурой подготовки проб позволяют рассматривать этот метод в качестве альтернативы ГХ/МС-ИР. К настоящему моменту метод ВЭЖХ/МС-ИР одобрен JCTLM как референтный метод высшего порядка (higher-order reference measurement procedure) и используется в том числе для аттестации стандартных образцов сыворотки крови.

В качестве примеров можно привести подходы, используемые Национальным институтом стандартов и технологий США (NIST), для аттестации некоторых типов стандартных образцов. Так, при аттестации стандартного образца сыворотки крови NIST SRM 909c [14] определение креатинина проводили методом ВЭЖХ/МС-ИР, а определение мочевины и мочевой кислоты — методом ГХ/МС-ИР, хотя для определения мочевой кислоты уже был предложен в качестве референтного метод ВЭЖХ/МС-ИР [15]. При аттестации SRM 3667 (креатинин в замороженной сыворотке крови) [16] для определения креатинина также применяли ВЭЖХ/МС-ИР.

В последнее десятилетие ФГУП «ВНИИМ им. Д.И. Менделеева» совместно с ведущими производителями реагентов для клинико-диагностических лабораторий на Северо-Западе разработал несколько типов стандартных образцов (СО), прослеживаемых к референтным материалам иностранного производства. Так, например, ГСО 9866-2011 состава ДНК сои (комплект ГМ-соя-ВНИИМ) прослеживается к СО ERM-BF410gk (производства JRC, в прошлом IRMM); ГСО 10390-2013 молярной концентрации тестостерона в сыворотке крови (комплект тестостерон-ВНИИМ) — к CO SRM 971a (NIST).

На 54-м заседании МГС в ноябре 2018 г. пять типов стандартных образцов (ГСО 9866-2011, ГСО 9913-2011, ГСО 10023-2011, ГСО 10238-2013, ГСО 10669-2015) были признаны в качестве Межгосударственных стандартных образцов состава и свойств веществ и материалов и зарегистрированы в Реестре МСО государств — участников Соглашения.

Однако, большая часть выпускаемых в стране и используемых в области клинической лабораторной диагностики стандартных образцов по разным причинам не обеспечена должной прослеживаемостью к национальным эталонам. К настоящему времени, по крайней мере, в области органического анализа, появляется возможность реализации такой прослеживаемости. Так, более 5 лет назад был создан государственный (национальный) первичный эталон в области измерений органических веществ на основе масс-спектральных методов (ГЭТ208). Многочисленные успешные международные проекты по сличению результатов измерений органических компонентов в различных матрицах, выполненные с применением этого эталона, показали эквивалентность получаемых результатов с соответствующими результатами ведущих специализированных организаций международного сообщества (например, метрологических институтов США, Великобритании, Германии, Китая и др.).

Так, для различных типов веществ (с учетом их молекулярной массы и полярности) выполнялись определения их чистоты по принципу 100% минус сумма всех примесей. В качестве примера можно привести сличения, в которых принимал участие ВНИИМ им. Д.И. Менделеева, по определению чистоты альдрина (CCQM-K55b), L-валина (CCQM-K55c), фолиевой кислоты (CCQM-K55d) и др. Весьма перспективным для решения этих задач считается внедрение прямого метода — ЯМР (на протонах). Соответствующие пилотные сличения уже были выполнены для двух типов веществ: диметилсульфона (CCQM-P150) и пирибутикарба (CCQM-P150b).

Оценивание сопоставимости результатов измерений национальных метрологических институтов, выполненных для растворов, позволяет оценивать качество и сопоставимость калибровочных/градуировочных растворов со статусом CRM и т.п. И, наконец, следующий уровень (или категория) — сличения в сложных матрицах. Таковыми матрицами могут быть промышленные продукты, объекты окружающей среды, продукты питания и, разумеется, интересующие нас биосреды.

В таблице приведены результаты сличений, организованных Рабочей группой по органическому анализу Консультативного комитета по количеству вещества при Международном бюро мер и весов (OAWG CCQM BIPM) в части, касающейся измерений диагностических маркеров в сыворотке крови человека. Следует отметить, что в перечисленных сличениях принимали участие метрологические институты многих ведущих стран мира (NIST — США, LGC — Великобритания, BAM — Германия, NIM — КНР, NMIJ — Япония, KRISS — Корея). Полные отчеты о результатах выполненных сличений представлены на сайте BIPM [17].

Обобщенные данные по измерениям некоторых диагностических маркеров в сыворотке крови человека, полученные в результате участия ФГУП «ВНИИМ им. Д.И. Менделеева» в ключевых сличениях

Наименование сличений и измеряемый компонент	Принятое референтное значение (KCRV) массовой доли компонента, мг/г	Абсолютная степень эквивалентности di	Относительная степень эквивалентности %di	Метод анализа (используемый изотопный стандарт)
CCQM-K6.2 Холестерин	2,350	–0,038	–1,6	ГХ/МС (13C2 — холестерол)
CCQM-K11.2 Глюкоза	1,164	0,007	0,6	ВЭЖХ-МС/МС (13C6 — глюкоза)
CCQM-K12.2 Креатинин	0,00752	–0,00004	–0,6	ВЭЖХ-МС/МС (метил 13C — креатинин)
CCQM-K109 Мочевина, высокий уровень	1,486	0,01828	0,23	ВЭЖХ-МС/МС (13C, 15N2 — мочевина)
CCQM-K109 Мочевина, нормальный уровень	0,3347	0,00135	0,40	см. выше
CCQM-K109 Мочевая кислота, высокий уровень	0,1365	–0,01274	-9,33	ВЭЖХ-МС/МС (1,3-15N2 — мочевая кислота)
CCQM-K109 Мочевая кислота, нормальный уровень	0,03339	–0,00039	–0,99	см. выше

При выполнении указанных сличений нами во всех случаях был использован «условно» первичный метод измерений — масс-спектрометрия с изотопным разбавлением. При обработке и оценке полученных данных организаторами сличений применялись различные алгоритмы, однако в настоящей статье представлена только та часть, которая позволяет наглядно продемонстрировать степень соответствия полученных нами данных заданным характеристикам.

Так, для каждого аналита существовало так называемое принятое референтное значение (Key Comparison Reference Value) — KCRV, т.е. опорная величина. Одним из способов оценки результатов было сравнение величин абсолютной степени эквивалентности (di), вычисляемых как разница между результатом участника сличений (xi) и референтным значением: di=xi–KCRV, или соответствующих величин относительной степени эквивалентности (%di), вычисляемых как: %di=100 di/KCRV.

Анализируя представленные данные, можно отметить, что в большей части измерений величина %di, или относительного отклонения от опорного значения, не превышала 1,0—1,5%. Только в случае с измерением мочевой кислоты на высоком уровне концентраций отклонение превысило 9%. В целом полученные результаты находятся в одном ряду с результатами ведущих метрологических институтов и позволяют считать, что используемые нами измерительные технологии соответствуют мировому уровню, и их целесообразно использовать для ликвидации отставания Российской Федерации в области качества измерений в лабораторной медицине.

В настоящее время во ВНИИМ им. Д.И. Менделеева начата разработка серии методик высшей точности, которые могут рассматриваться в качестве референтных, и в перспективе позволят вывести производство стандартных образцов для лабораторной медицины в Российской Федерации на качественно новый уровень, соответствующий международно признанным критериям. Одновременно будет обеспечена прослеживаемость к государственным первичным эталонам стандартных образцов (калибраторов), используемых в рутинных анализах.

Измерения нуклеиновых кислот в лабораторной медицине

Качественный анализ, заключающийся в выявлении специфических последовательностей нуклеотидов, используется в лабораторной медицине в основном для диагностики инфекционных заболеваний, а также позволяет выявлять мутантные аллели ДНК в генетических исследованиях для установления родства и идентификации личности в судебной медицине. Выявление целевых фрагментов ДНК считается надежным свидетельством присутствия инфекционного агента в тестируемом образце биоматериала. При этом целевой фрагмент определяют, исходя из последовательности нуклеотидов, прослеживаемой к референтной последовательности, входящей в состав референтных материалов (стандартных образцов ДНК или РНК). Так, RM8375 производства NIST включает в себя образцы ДНК сальмонеллы S. typhimurium LT2, стафилококка S. aureus, синегнойной палочки P. aeruginosa и клостридий C. sporogenes, для которых представлена справочная информация о полногеномной последовательности нуклеотидов, однако данная информация не может быть использована для установления метрологической прослеживаемости [18]. В референтных материалах NIST RM8391, RM8392, RM8393 и RM8398 представлена информация об однонуклеотидных полиморфизмах (SNV), малых вставках и делециях (indels) и гомозиготных референсных генотипах в составе геномной ДНК человека, но в силу недостаточности информации для оценки неопределенности все представленные значения могут рассматриваться только как справочные [19].

Идентификация присутствия фрагментов ДНК, содержащих специфические последовательности нуклеотидов, выполняется в настоящее время, как правило, с применением технологий полимеразной цепной реакции с детектированием по конечной точке (ПЦР) или ПЦР в реальном времени (количественной ПЦР, кПЦР). Определенную долю рынка качественных тест-систем занимают наборы, основанные на использовании других биохимических реакций — лигазной цепной реакции (LCR или NASBA), изотермической цепной реакции — петлевой изотермической амплификации (LAMP), изотермической самоподдерживающейся репликации последовательностей (3SR), амплификации с замещением цепи ДНК (SDA) и др. [20, 21].

Метод кПЦР позволяет также выполнять измерения содержания целевых специфических последовательностей в клиническом материале. Измерения, выполняемые с использованием кПЦР, являются относительными: содержание мишени рассчитывают по отношению к используемому калибратору. В этом случае результаты кПЦР прослеживаются к значениям содержания числа копий целевой последовательности на единицу объема («copy number concentration»), приписанным используемому калибратору. В соответствии с 9-й редакцией брошюры BIMP «Международная система единиц» результаты количественных измерений нуклеиновых кислот выражают через число копий: «Существуют также величины, которые не могут быть выражены через семь основных единиц СИ, но при этом исчисляются. К таким величинам относятся число молекул, число клеточных или биомолекулярных объектов (например, копии конкретной последовательности нуклеиновой кислоты). Исчисляемые величины также являются величинами с единицей «один». Единица «один» является нейтральным элементом любой системы единиц — она необходима и входит в состав автоматически. Включать ее формальным образом по общему решению не требуется. Таким образом, формальная прослеживаемость к СИ может быть установлена с помощью соответствующих проверенных методик измерения» [22]. Интересно, что, несмотря на это, в стандартных образцах ДНК ВОЗ содержание целевых нуклеиновых кислот выражено в международных единицах (МЕ/мл), при этом фактор конверсии МЕ в число копий может различаться [23].

В то же время в лабораторной медицине важно учитывать различия между выявлением целевой последовательности в составе фрагмента ДНК, выявлением генома возбудителя инфекционного заболевания и выявлением собственно возбудителя. Различные целевые последовательности, входящие в состав генома инфекционного агента, могут амплифицироваться в ПЦР с различной эффективностью, что приводит как к появлению ложноотрицательных результатов в качественной диагностике, так и к различиям в результатах количественных измерений, выполняемых с использованием методов кПЦР [24]. Эти различия в эффективности амплификации могут быть связаны непосредственно как со сложностью целевой последовательности, так и с ее размером, размером фрагментов нуклеиновой кислоты, в составе которых она находится, и степенью ее фрагментации. Учитывая относительно высокую стабильность фрагментов ДНК, мы не всегда можем соотносить число копий выявленных целевых последовательностей, число геномов возбудителя и число жизнеспособных микроорганизмов или вирусов; кроме того, потери на преаналитическом этапе, в ходе процедуры подготовки проб, выделения и очистки нуклеиновых кислот, могут оказывать существенное влияние на аналитические результаты [25].

К настоящему времени в качестве референтного метода-кандидата измерений содержания ДНК рассматривают метод цифровой ПЦР (цПЦР), основанный на разделении реакционной смеси на тысячи и десятки тысяч генерируемых микрореакционных объемов. Применение цПЦР позволяет проводить измерения числа копий целевых молекул ДНК, присутствующих в образце, без использования каких-либо калибраторов [26]. Отличительной особенностью этого метода является его пониженная чувствительность к различиям в эффективности амплификации и присутствию примесей ингибиторов в образце, а также более высокая по сравнению с кПЦР чувствительность.

В последние годы ФГУП «ВНИИМ им. Д.И. Менделеева» принимает участие в пилотных и ключевых международных сличениях на высшем уровне точности Рабочей группы по анализу нуклеиновых кислот (NAWG CCQM BIPM). Применение метода цПЦР в ключевых сличениях CCQM-K86с позволило участникам получить сопоставимые результаты измерений содержания целевых последовательностей в диапазоне, близком к пределу количественных измерений ДНК, — порядка 10 копий/мкл и в отношениях числа копий целевых последовательностей 1:1000 (0,1%). На рисунке в графической форме представлены результаты измерений содержания целевой последовательности трансгенной кассеты DP-073496-4 по отношению к содержанию целевой последовательности гена fatA(A) в матрице муки рапса масличного, полученные лабораториями национальных метрологических институтов — участников ключевых сличений CCQM-K86с.

Результаты измерений содержания целевой последовательности трансгенной кассеты DP-073496-4 по отношению к содержанию целевой последовательности гена fatA(A) с расширенной неопределенностью, полученные национальными метрологическими институтами в рамках ключевых международных сличений CCQM-K86c.

В настоящее время наш коллектив принимает участие в международных пилотных сличениях КККВ МБМВ на высшем уровне точности по измерениям числа копий синтетических фрагментов РНК, содержащих последовательности из состава генома вирусов HIV-1 (CCQM-P199) и SARS-CoV-2 (CCQM-P199b). Успешное участие в ключевых международных сличениях CCQK-K86c [27] позволило зарегистрировать в 2019 г. в базе данных калибровочных и измерительных возможностей BIPM первую для Российской Федерации позицию, характеризующую наши измерительные возможности в области измерений ДНК. Признание этой измерительной возможности позволяет нам обеспечивать прослеживаемость результатов измерений нуклеиновых кислот в лабораторной медицине к внесистемной единице СИ — числу копий. Передача единиц содержания ДНК может быть реализована двумя путями. Так, при взаимодействии с организациями-производителями тест-систем может быть выполнена аттестация стандартных образцов предприятий, используемых далее для передачи единицы калибраторам, входящим в тест-системы, применяемые КДЛ. Кроме того, возможна прямая передача единиц от метрологического института в КДЛ через соответствующие СО состава ДНК утвержденного типа.

На сегодня в Российской Федерации выпускается единственный стандартный образец утвержденного типа состава ДНК сои ГСО 9866-2011 (комплект ГМ-соя-ВНИИМ), предназначенный для поверки оборудования для ПЦР в реальном времени. В конце 2020 г. ожидается завершение разработки и утверждение типа СО состава ДНК человека, сертифицированного по содержанию ряда специфических последовательностей. Запланирована разработка целого ряда СО ДНК — биомаркеров инфекционных агентов, в том числе матричных ГСО, позволяющих учесть влияние матрицы биологического материала на процедуру подготовки проб, а также создание ГСО для нужд биофармацевтической промышленности.

Заключение

ФГУП «ВНИИМ им. Д.И. Менделеева» принимает участие в Международной кооперации национальных метрологических институтов в области развития и внедрения методов высшей точности, соответствующих международных сличениях, организуемых рабочими группами по органическому анализу, анализу нуклеиновых кислот и клеточному анализу. Все это позволяет разрабатывать и подтверждать новые измерительные возможности, востребованные в том числе в области лабораторной медицины. Внедрение этих методов в практику производства и аттестации стандартных образцов позволит обеспечить прослеживаемость и должный уровень достоверности результатов для целого ряда измерений в лабораторной медицине.

Участие авторов в написании статьи:

Вонский Максим Сергеевич — написание и правка текста статьи в общей части и части биоанализа, подборка литературы по теме исследования

Крылов Анатолий Иванович — написание и правка текста статьи в общей части и части биоанализа, подборка литературы по теме исследования

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.