В поиске ответа на вопрос, является ли результат лабораторного исследования, полученный у пациента, нормальным, врач проводит его сравнение с другими величинами. Долгое время в качестве базы сравнения использовались так называемые нормы, или нормальные значения, полученные эмпирическим путем, сформировавшиеся в результате устоявшейся практики. При этом дать четкое определение термину «норма» не удавалось. 1969 г. на смену расплывчатому понятию нормы R. Gräsbeck и N. Saris предложили термины «референтное значение» (РЗ) и «референтный интервал» (РИ), развившиеся в последующие 10 лет в теорию референтных значений. Наиболее полно история данного вопроса, включая основные этапы развития теории, а также перечень нерешенных проблем представлены в работе J. Siest и соавт. «Теория референтных значений: незаконченная симфония» [1]. Цель данного обзора — изложить основные рекомендуемые мировыми экспертами подходы и методы определения РИ, включая алгоритмы для переноса и верификации РИ, обозначить текущие проблемы в современной теории и практике РИ.

Наиболее полно терминология и методические указания, рекомендуемые консенсусом экспертов, даны в документе Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI) [2]. РИ определяется на референтной выборке условно здоровых людей, соответствующих оговоренным критериям, т. е. на группе референтных индивидуумов, представляющих референтную популяцию. Референтное значение (РЗ) — это величина аналита у референтного индивидуума. Совокупность референтных значений формирует референтное распределение. РИ представляет собой 95% центральный диапазон РЗ, ограниченный верхним и нижним референтными пределами.

РИ является статистическим показателем и отражает биологические свойства референтной популяции, на которой был определен, — межиндивидуальную биологическую вариацию. Важно помнить, что по своему определению РИ предназначен быть зеркалом популяции и не может служить критерием суждения о здоровье или патологии. Для принятия решения об отнесении пациента к здоровым или больным, группе риска или для других клинических задач используются пороговые значения (ПЗ) (пороги клинического решения в терминологии ГОСТа [3]). Различиям между РИ и ПЗ посвящен недавний обзор комитета IFCC по РЗ и ПЗ (IFCC C-RIDL) [4], основные из которых представлены в табл. 1.

В зависимости от способа получения данных по РЗ выделяют прямой и непрямой методы определения РИ. В первом случае для решения этой задачи проводится целенаправленный рекрутинг референтных индивидуумов, тогда как при непрямом подходе источником РЗ служит массив данных, уже накопленный в медицинской или лабораторной информационной системе.

В действующем руководстве CLSI рекомендуется прямой метод определения РИ [2]. Вместе с тем в последнее время отмечается возрастающий интерес к непрямому методу, часто называемому теперь «дата майнинг». Несмотря на такие его недостатки, как неполная информация о референтных индивидуумах, исключение нездоровых лиц с помощью статистических упражнений, недостаточность контроля преаналитического этапа и аналитических условий, члены комитета IFCC считают возможным использование непрямого метода в ряде случаев [5]. Это относится к ситуациям, когда сложно рекрутировать требуемое количество референтных индивидуумов для проведения исследования прямым методом, в частности при определении РИ для детей, пожилых лиц, беременных. К достоинствам непрямого метода относятся отсутствие больших затрат на рекрутинг референтных индивидуумов, взятие и тестирование биоматериала; использование РЗ, непосредственно относящихся к обслуживаемой популяции; получение РЗ в пре- и аналитических условиях, соответствующих реальной рутинной практике действующей лаборатории.

При непрямом методе предпочтение отдается использованию данных обследуемых амбулаторно пациентов. В случае госпитальных баз необходима идентификация заболеваний по кодировке с исключением определенных подгрупп в зависимости от исследуемого аналита. Также для исключения могут использоваться другие доступные в системе данные о состоянии здоровья пациента. С целью снижения вероятности наличия патологического результата используются только РЗ пациентов с единственным результатом или в серии измерений выбирается последний результат.

РИ при непрямом методе рассчитываются с помощью специальных математических инструментов, в частности с использованием анализа Blattacharya и его модификаций [2], метода Hoffman [6], F. Arzideh и соавт. [7], которые менее чувствительны к присутствию патологических результатов по сравнению с классическими параметрическим или непараметрическим методами. В Интернете доступны следующие приложения: на базе excel Bellview Bhattacharya analysis (Doug Chesher) https://sourceforge.net/projects/bellview/; на базе excel от Graham Jones http://www.sydpath.stvincents.com.au/; https://www.r-bloggers.com/mining-your-routine-data-for-reference-intervals-hoffman-bhattacharya-and-maximum-likelihood/. В бурно развивающемся мире «биг дата» исследователи активно ищут решения для нивелирования недостатков непрямого метода, определения механизмов исключения выпадающих значений, согласования минимального размера данных и возможных статистических допущений.

Основные этапы определения РИ прямым методом подробно описаны в руководстве CLSI, которое также рекомендовано IFCC [2]. Хорошим примером могут служить протокол, а также стандартные операционные процедуры и примеры анкет, опубликованные комитетом IFCC C-RIDL для многоцентровых исследований [8]. Ниже приведена краткая выдержка из руководства [2] и рекомендаций рабочей группы по аккредитации и стандартам ISO/CEN Европейской федерации лабораторной медицины [9]. Это адаптированный перечень основных шагов при прямом методе:

1. На основе данных литературы проанализируйте возможные факторы биологической и аналитической вариации для исследуемого аналита.

2. С учетом этих данных определите критерии включения/исключения и отразите это в анкете для участников исследования.

3. Установите для данного аналита требуемое количество референтных индивидуумов в зависимости от предполагаемого статистического метода расчета пределов РИ, в том числе для каждой из подгрупп в случае возможного деления РИ по подгруппам.

4. Подпишите у предполагаемых участников информированное согласие на участие в исследовании и соберите заполненные анкеты.

5. Проверьте отобранных потенциальных референтных индивидуумов по данным анкеты на предмет соответствия заранее определенным критериям включения/исключения. Исключите, если необходимо.

6. В случае ожидаемого деления РИ на подгруппы сформируйте подгруппы референтных индивидуумов на основе данных анкеты.

7. Подготовьте отобранных участников к взятию биоматериала в соответствии с процедурой, обычно используемой в лаборатории.

8. Соберите и обработайте образцы.

9. Определите Р.З.: анализируйте образцы с использованием хорошо проверенных и контролируемых методов.

10. Постройте гистрограмму РЗ и оцените распределение данных.

11. Идентифицируйте возможные ошибки и/или выпадающие значения.

12. Проанализируйте Р.З.: выберите статистический метод и рассчитайте референтные пределы и доверительные интервалы.

13. Документируйте все шаги и процедуры.

Важно помнить, что необходимо, помимо обеспечения качества, на аналитическом этапе стандартизовать и строго контролировать различные преаналитические процедуры.

Описанный выше алгоритм прямого метода относится к так называемому подходу a priori, когда исключение по заданным критериям выполняется до взятия биоматериала. В случае a posteriori критерии исключения применяются после сбора образцов, и в такой ситуации придется рекрутировать заведомо большее число потенциальных референтных индивидуумов, чтобы в конечном итоге иметь достаточное их количество в референтной выборке с точки зрения статистики.

В табл. 2 приведен

Надо отметить, что критерии включения/исключения являются одним из самых дискуссионных моментов в исследованиях по определению Р.И. Прежде всего, не существует единого понятия условно здорового человека. С практической точки зрения очень жесткие ограничения приведут к низкой реализуемости задачи рекрутинга требуемого количества референтных индивидуумов, а также существенно повысят стоимость предварительного обследования и отбора. При определении критериев включения/исключения важно помнить об основном предназначении РИ — служить отражением исследуемой популяции. Необходимо приводить четкое описание отобранной референтной популяции для ясного понимания ограничений применимости РИ, полученных в исследовании.

При определении РИ предполагается как визуальная оценка распределения РЗ, так и использование набора статистических инструментов. Анализ скатерограммы РЗ позволяет предположить наличие выбросов — значений аналита, существенно отличающихся от общего массива Р.З. Для принятия решения об их исключении часто используют правило Dixon/Reed: если отношение разницы значений между выпадающим значением и соседним к нему РЗ к разнице между крайними значениями всего полученного диапазона РЗ ≥0,3, то данное выпадающее значение подлежит исключению из референтной выборки. Если присутствуют 2—3 выброса с одной стороны распределения, то данное правило применяется к наименьшему выпадающему значению. В случае, если оно подлежит исключению, то остальные также исключаются. Если нет, то тогда исследователь либо оставляет эти выпадающие значения, либо применяет процедуру блока Barnett и Lewis [2]. IFCC также рекомендует подход, изначально предложенный Тurkey и доработанный Horn, согласно которому выбросы идентифицируются в квартилях. Рассчитываются значения нижнего Q1 и верхнего Q3 квартилей, межквартильный размах IQR=Q3—Q1. Исключаются Р.З., выходящие за нижнюю границу, определяемую как Q1—1,5IQR, или превышающие верхний порог Q3+1,5IQR. Заметим, что после удаления выброса подходящий тест необходимо применить к оставшимся РЗ на предмет выявления другого выпадающего значения.

Существует несколько методов для расчета пределов РИ: параметрический, непараметрический, робастный. Первый предполагает нормальное (или «гауссово») распределение РЗ, и пределы РИ рассчитываются как среднее РЗ±1,96 SD. Однако в случае биологических аналитов такое распределение встречается нечасто. Для расчета пределов РИ непараметрическим методом форма распределения РЗ не имеет значения. По этой причине он рекомендован IFCC [2]. Для определения РИ непараметрическим методом РЗ ранжируются от меньшего к большему. В случае выборки в 120 РЗ в качестве 2,5 перцентиля выбирается РЗ на третьей позиции и РЗ на 118-м месте для 97,5 перцентиля.

Если распределение ненормальное, то можно предпринять попытку трансформировать данные, используя наиболее подходящий метод трансформации, например логарифмический, и затем проверить полученные РЗ на нормальность распределения. Надо отметить, что в рамках глобального многоцентрового исследования РЗ по РИ удалось провести успешную трансформацию для подавляющего большинства исследованных аналитов [10]. Было показано, что два способа давали близкие значения, но в случае параметрического метода наблюдали более узкие доверительные интервалы (ДИ) для пределов РИ по сравнению с непараметрическим. Для аналитов, ассоциированных с метаболическим синдромом, наблюдали более узкие РИ, рассчитанные с помощью параметрического метода, по сравнению с непараметрическим.

Пределы РИ должны представляться с 90% ДИ, описывающими диапазон значений истинного предела РИ с 90% вероятностью. Чем уже ДИ, тем надежнее Р.И. Считается приемлемым, если ДИ не превышает 0,2 ширины РИ [9]. Наиболее сильно на ДИ влияет размер выборки. В связи с этим, согласно рекомендациям IFCC, для расчета РИ непараметрическим методом требуется как минимум 120 РЗ [2]. Для определения пределов РИ параметрическим методом необходимо более 200 РЗ, так как в районе 150 РЗ и ниже параметрический метод нестабилен [10]. Широко распространенным способом расчета ДИ является bootstrap-метод. В нем вероятность распределения пределов РИ оценивается в ходе 100 итераций расчета РИ для псевдовыборок и более, которые формируются на основе имеющейся базы РЗ специальным генератором повторных выборок.

Для случаев, когда доступно небольшое количество РЗ, IFCC допускает применение робастного метода, который не требует нормального распределения РЗ и устойчив к выбросам. Используется специальный робастный алгоритм, присваивающий РЗ различный вес в зависимости от удаленности РЗ от медианы. Робастный метод позволяет установить РИ в случае 20 референтных индивидумов, однако с неприемлемо широкими ДИ. В связи с этим IFCC рекомендует иметь как минимум 80 РЗ для использования робастного метода [2].

Краткое описание статистических подходов для исследований по РИ представлено в обзоре Y. Ozarda [11], включая перечень инструментов для принятия решения о выделении РИ для подгрупп. В него вошли:

1) метод Harris и Boyd, рекомендующий разделение РИ для двух подгрупп численностью n₁ и n₂, если отношение стандартных отклонений для подгрупп (большего к меньшему) превысит 1,5, или если рассчитанный z*-критерий по формуле

z*=3[(n₁+n₂)/240]^1/2

превысит 3;

2) метод Lahti и соавт. с оценкой доли индивидуумов за пределами РИ для двух подгрупп в «хвосте» общего распределения всех РЗ;

3) метод, разработанный K. Ichihara и J.C. Boyd, оценивающий значимость различия средних в подгруппах и предлагающий рассмотреть возможность разделения РИ, если SDR — отношение стандартного отклонения среднего в подгруппах к межиндивидуальному отклонению — выше 0,3 [10].

Однако приведенные методы обладают ограничениями, и для принятия решения, помимо статистики, исследователю необходим вдумчивый визуальный анализ распределения РЗ, сопоставления с физиологией и другими данными по возможным источникам вариации Р.З. Наиболее частыми критериями для разделения РИ по подгруппам являются пол и возраст. Опыт глобального многоцентрового исследования IFCC по РЗ свидетельствует о целесообразности проведения отдельно статистического анализа для мужчин и женщин при выяснении необходимости установить РИ для разных подгрупп. Повышенное внимание необходимо уделять анализу возможного разбиения на возрастные подгруппы у аналитов, зависимых от индекса массы тела. Эти два источника вариации могут усиливать влияние друг друга на распределение РЗ, симулировать или маскировать эффект на РЗ в зависимости от аналита и возрастной динамики индекса массы тела в популяции. Следует отметить, что при расчете РИ для различных подгрупп требуется соблюдение рекомендованного минимального количества референтных индивидуумов в каждой из подгрупп.

В последние годы проведено несколько многоцентровых исследований по установлению РИ с большими выборками референтных индивидуумов в северных странах, Азии, Австралии, Канаде, 12 странах, вошедших в глобальный проект комитета IFCC, включая Россию [10—12]. С целью практического использования полученных результатов комитет IFCC C-RIDL призывает лаборатории к активному проведению процедуры переноса и верификации РИ, установленных в ходе исследований. Это также соответствует требованиям стандарта ISO15189, согласно которому каждая лаборатория периодически должна оценивать используемые ею Р.И. По сравнению с самостоятельной разработкой РИ верификация является более реалистичной задачей и не требует привлечения больших ресурсов.

Детальные инструкции содержатся в руководствах CLSI [2, 13]. Несмотря на то что в документе [2] «валидация» и «верификация» используются как синонимы, хотелось бы обратить внимание на различие, прокомментированное в обзоре [12]. По сути оба термина обозначают получение доказательств соответствия определенным требованиям. Вместе с тем исторически термин «валидация» применяется в отношении процедуры объективного подтверждения применимости аналитической системы для указанной цели и соответствия аналитических характеристик системы, внедряемой в работу лаборатории, заявленным требованиям в заранее установленных пределах. Она предусматривает тестирование большего количества образцов и сбора данных. Процедура валидации подразумевает, что лаборатория должна установить РИ прямым методом. Однако если лаборатория переносит в свою практику РИ из литературы, инструкций к реагенту или от другой лаборатории, то соответствующий процесс подтверждения приемлемости использования переносимых РИ определяется как верификация.

Возможны два основных сценария при переносе РИ — сравнение аналитических систем или популяций. Если лаборатория решила сменить метод (или анализатор), т. е. обслуживаемая популяция осталась прежней, то перенос РИ внутри лаборатории превращается в «сравнение аналитических систем». Данная задача решается в соответствии с документом CLSI, рекомендованным IFCC [13]. Следует помнить, что перенос РИ с одной аналитической платформы на другую, основанный на математической коррекции результатов измерений, невозможен, если имеются существенные различия между аналитическими процессами на каждой платформе. Это, например, характерно для многих иммунохимических методов ввиду использования разных антител к разным эпитопам аналита, перекрестной реактивности антител с множеством циркулирующих форм определяемого аналита и существенных отличий в калибровке. Решение о проведении исследования по сравнению методов с целью переноса РИ рекомендуется принять после изучения публикаций по сопоставлению метода лаборатории и метода, использованного для установления РИ, результатов ранее проведенных исследований о возможности переноса РИ между методами, данных производителей об аналитических характеристиках методов и результатов программ внешнего контроля качества.

Для получения статистически надежных результатов сравнительных измерений исследуемых проб биоматериала должно быть не менее 40. Концентрация аналита в пуле биоматериала должна охватывать весь аналитический диапазон измерений — от низких до высоких значений с равномерным распределением по концентрациям. Нет необходимости брать образцы биоматериала у специально отобранных лиц, достаточно использовать биоматериал, оставшийся в лаборатории после проведения заказанных анализов. Лучше избегать хранения образцов и проводить измерения обоими методами в течение 2 ч или быстрее, если известно, что аналит нестабилен (например, лактат, аммиак). Если есть необходимость в хранении образцов до исследования, то важно строго соблюдать условия хранения — температуру, время, стабилизатор и другие, необходимые для обеспечения стабильности исследуемого аналита. Условия хранения должны быть описаны в надежных источниках литературы и рекомендациях производителей исследуемых методов. Измерения в пробах должны быть равномерно распределены по времени и выполнены в течение 3—5 рабочих дней (всего 40 проб, 8 проб в день в течение 5 дней).

По результатам сравнительных измерений проводят графический и статистический анализы. Строят графики рассеяния исходных результатов с последующим расчетом коэффициента корреляции (или коэффициента детерминации — r²) и коэффициентов линейной регрессии, графики отличий (Бланд—Альтмана) и график остатков. Выявляют и удаляют выбросы и единичные экстремально высокие или низкие значения концентраций. Для корректного переноса референтных пределов по уравнению простой линейной регрессии необходимо, чтобы r²≥0,95. Если r²≤0,7, перенос невозможен. При промежуточных значениях коэффициента детерминации возможен расчет по уравнению регрессии Deming. При визуальной оценке графиков определяются равномерность распределения отличий в зависимости от концентрации, отсутствие кластеризации результатов, близость к нормальному распределения остатков в зависимости от концентрации. Нормальный характер распределения остатков должен быть подтвержден графически (график Q—Q). Кроме того, по мнению экспертов, смещение по оси Y не должно быть большим по сравнению с шириной Р.И. При соблюдении всех вышеперечисленных условий можно использовать уравнение линейной регрессии для расчета пределов РИ для новой аналитической системы. Подробно алгоритм переноса РИ с одной аналитической системы на другую описан в статье об исследовании CALIPER, предлагаемой читателям в переводе в данном номере журнала [14]. В случае узкого РИ, например у натрия, возможна ситуация, когда для перерасчета РИ предпочтительнее оценка смещения средних двух методов [2]. Независимо от использованного способа переноса, будь то принятие изначальных РИ или их перерасчет тем или иным образом, IFCC рекомендует провести далее процедуру верификации новых РИ, о чем пойдет речь ниже.

При переносе РИ от аналогичной аналитической системы на другую популяцию стандарт CLSI допускает применение двух подходов: субъективную оценку и верификацию с использованием образцов от условно здоровых лиц, соответствующих критериям включения/исключения и представляющих популяцию, обслуживаемую лабораторией. В первом случае лаборатория должна сопоставить свои характеристики с параметрами лаборатории, в которой были разработаны РИ, с целью убедиться в их схожести. Основные пункты для анализа: географические и демографические критерии, преаналитические процедуры, аналитический метод, референтная популяция, использованный протокол и статистические методы для расчета Р.И. При задокументированном совпадении допускается применение переносимых РИ [2].

Схема применения второго подхода с использованием небольшой референтной выборки представлена на рисунке

При верификации РИ, установленных для подгрупп, стандарт CLSI допускает проверку РИ для одной из подгрупп: в случае ее успешной верификации возможно сделать заключение о верификации РИ для всех подгрупп. Однако такое решение может вызывать сомнения, и желательно проводить верификацию для каждой из подгрупп.

Стандарт CLSI предусматривает дополнительный вариант переноса РИ для аналитов с высокой клинической значимостью, правильная интерпретация которых критична для лаборатории. Это предполагает расчет РИ робастным методом на референтной выборке из 60 условно здоровых лиц. Полученные Р.И. сравниваются с РИ из полноценного исследования, включавшего не менее 120 Р.З. Для выявления значимых различий между двумя референтными выборками применяются упомянутые ранее правила выделения РИ для подгрупп (метод Harris/Boyd и др.) [2]. В этом варианте лаборатории также необходимо самостоятельно принять решение для каждого аналита о приемлемости ширины ДИ РИ, рассчитанных таким образом.

Помимо способов верификации, рекомендованных в стандарте CLSI, существуют и другие подходы, в частности data mining — использование локальных информационных баз данных, позволяющее отобрать сотни и тысячи результатов лабораторных исследований условно здоровых индивидуумов. В этом случае применяется оценка меры центральной тенденции распределения данных (медианы или моды), которая более устойчива к присутствию патологических результатов, чем пределы Р.И. Для оценки аналитического или популяционного смещения сравниваются медиана данных, извлеченных из информационной системы, с медианой выборки РЗ, использованных для установления Р.И. Помимо этого, необходимо мониторировать процент аномальных результатов и оценить долю флагов, т. е. значений, попадающих за пределы используемого РИ, — текущую и ожидаемую при переходе к верифицированному Р.И. Если изменение доли флагов не превысит допустимые пределы, то РИ считается приемлемым. Согласно концепции минимального, оптимального и желаемого предела смещения, доля флагов может варьировать в диапазоне от 1,0 до 1,8% для флагов о выходе за нижний предел РИ и от 5,7 до 3,3% для флагов превышения верхней границы Р.И. Авторы работы [15] не рекомендуют использовать data mining, если нет четкого различия между распределениями РЗ здоровых и нездоровых лиц или существует значительное смещение между методами, приводящее к ложному завышению или занижению доли флагов. Альтернативный стандарту CLSI подход — мониторинг медианных значений и частоты результатов за пределами РИ может с успехом применяться не только для первичной верификации, но и при проведении периодических подтверждений корректности использующихся Р.И. При проведении верификации полезно дополнительно рассчитать РИ непрямым методом на основе данных информационной системы. В дальнейшем периодически проводить аналогичные расчеты и сравнивать получаемый РИ с первоначально рассчитанным непрямым методом РИ для подтверждения стабильности используемого РИ и отсутствия аналитического или популяционного смещения.

Сегодня лаборатория обладает современным арсеналом средств для установления адекватных Р.И. Доступны протоколы и результаты многоцентровых исследований для большого перечня аналитов и множества платформ, разработаны процедуры переноса и верификации Р.И. Возрастает значимость технологий data mining, создающих новые возможности по установлению и верификации РИ для разных популяций и сложных для рекрутинга групп — детей, пожилых, беременных. По мере накопления данных молекулярно-биологических исследований могут возникать новые задачи, в частности разработки РИ для подгрупп с различным генотипом.

Сведения об авторах

Евгина С.А. — https://orcid.org/0000-0002-4945-7269

Савельев Л.И. — https://orcid.org/0000-0002-5180-6560

Евгина С.А., Савельев Л.И. Современные теория и практика референтных интервалов. Лабораторная служба. 2019;8(2):36-44. https://doi.org/10.17116/labs2019802136

Автор, ответственный за переписку: Евгина Светлана Александровна — e-mail: s.evgina@fedlab.ru; тел.: +7(910)422-0078; https://orcid.org/0000-0002-4945-7269

Corresponding author: Evgina S.A. — e-mail: s.evgina@fedlab.ru;
tel.: +7(910)422-0078; https://orcid.org/0000-0002-4945-7269