Achromobacter spp. (Kingdom: Bacteria; Phylum: Proteobacteria; Class: Beta Proteobacteria; Order: Burkholderiales; Family: Alcaligenaceae; Genus: Achromobacter) — грамотрицательный неферментирующий микроорганизм, вызывающий внутрибольничные инфекции. Обнаружен в крови, спинальной, перитонеальной и плевральной жидкостях, гное, моче, мазках из глаза, уха, зева, нестерильной дистиллированной воде и растворах хлоргексидина [1]. Achromobacter spp. сложно идентифицировать с помощью фенотипических методов, особенно в ранних (48 ч) культурах. Возможна ложная идентификация как Bordetella, Pseudomonas, Burkholderia. В настоящее время род Achromobacter насчитывает 16 видов. Дополнительно выделяют геногруппы 1, 3, 8, 9, 12, 13, 16, 17, 18, 19, 20, не оформленные как виды. Метод масс-спектрометрии (MicroFlex, «Bruker», Германия) идентифицирует представителей только некоторых видов Achromobacter spp. и, преимущественно, как A. xylosoxidans. Таким образом, видовая идентификация возможна только с помощью молекулярно-генетических методов. В молекулярно-эпидемиологическом анализе хорошо зарекомендовал себя метод мультилокусного секвенирования (Multi Locus Sequence Typing, MLST), впервые предложенный M. Maiden и соавт. в 1998 г. [2]. Для Achromobacter spp. такой подход был разработан T. Spilker и соавт. в 2012 г. [3]. Секвенирование семи мишеней позволяет различать как виды и геногруппы, так и штаммы внутри видов/геногрупп. Ранее мы продемонстрировали высокую дифференцирующую способность фрагмента гена gltB, кодирующего С-концевой участок белка, в анализе генотипов Achromobacter spp. [4]. В видовой идентификации хорошо зарекомендовал себя ген оксациллиназы bla-OXA, характерный для большинства представителей этого рода, отличающихся резистентностью к β-лактамам [5]. Протестировав все три перечисленных подхода к генотипированию на расширенной выборке образцов от пациентов и штаммов, мы пришли к заключению о возможности сокращения мишеней в идентификации Achromobacter spp. без потери эффективности дифференциации, но с уменьшением расходов и времени на анализ. Разработке метода экспресс-генотипирования микроорганизмов рода Achromobacter посвящено настоящее исследование.

Материалы. В данной работе были использованы образцы мокроты, трахеального аспирата, мазков из зева от 75 пациентов, у которых ранее был обнаружен нами Achromobacter spp. на основе анализа гена gltB. Пациенты с диагнозами муковисцидоз, врожденный порок развития легких, бронхоэктазы, аспергиллема легких или подвергавшиеся искусственной вентиляции легких, проходили лечение в НИИ пульмонологии ФМБА, ФГБУН НЦЗД, ФГБУ РДКБ Минздрава России, ДКБ № 1 Ярославля, КДКП Владивостока, НИИ СП им. Н.В. Склифосовского.

Выделение ДНК. ДНК из биологических образцов выделяли согласно инструкции к набору реактивов The Maxwell 16 Tissue DNA Purification Kit на приборе Maxwell MDX Instrument («Promega», США).

Идентификацию Achromobacter spp. в биологическом образце проводили на основе амплификации и секвенирования фрагментов гена gltB с праймерами, предложенными для MLST Burkholderia cepacia complex (Bcc) (табл. 1), по методике с нашими модификациями [4]. Последовательности гена использовали в определении генотипов Achromobacter spp., которые нумеровали в порядке выявления, с обязательной регистрацией в GenBank.

MLST Achromobacter spp. выполняли по протоколу Т. Spilker и соавт. [3], что позволяло определить генотип согласно международной схеме, а также вид на основе секвенирования фрагмента в 765 п.н. гена nrdA.

Выявление гена оксациллиназы bla-OXA проводили с помощью амплификации ДНК образца с праймерами, предложенными J. Turton и соавт. (см. табл. 1). Аллельный вариант гена bla-OXA идентифицировали посредством сравнения полученной нуклеотидной последовательности с данными базы CBMAR: Comprehensive Beta-lactamase Molecular Annotation Resource (http://14.139.227.92/mkumar/lactamasedb/).

Секвенирование ПЦР-продуктов выполняли согласно протоколу к набору BigDye Terminator 3.1 Cycle Sequencing kit на геномном анализаторе Genetic Analyzer 3130 («Applied Biosystems/Hitachi», США). Электрофоретическое разделение продуктов реакции проводили в капиллярах длиной 50 см с использованием полимера POP7.

Анализ последовательностей и выравнивание выполняли с помощью программ CLUSTALW2 (http://www.ebi.ac.uk) и MEGA 6 [7]. Для определения аллельного профиля Achromobacter spp. использовали программную базу сайта PubMLST: Achromobacter MLST Databases [8].

Регистрация последовательностей генов. Последовательности аллелей гена gltB зарегистрировали в GenBank под номерами KC817498-KC817502, KF290958, KF290959, KF297891, KF963246-KF963250, KJ364657, KJ439616, KJ941209, KM262752, KM262753, KP027420, KP765437-KP765444, KP940471. Для гена bla-OXA Accession Numbers: KR869118-KR869142.

Анализ биологических образцов пациентов на наличие Achromobacter spp. с помощью амплификации и секвенирования фрагмента гена gltB показал большое разнообразие аллелей этого гена в выборке. Среди 25 выявленных аллелей преобладали аллели 1 и 2, причем последний встречался у 39% пациентов. Верификация результатов с помощью международной схемы MLST подтвердила установленное разнообразие: 25 генотипов — ST (sequence type) (табл. 2). Коэффициенты дифференциации для схемы с одной мишенью и MLST с семью мишенями оказались равны. Поэтому первое место в протоколе анализа биологических образцов мы сохранили за геном gltB.

Однако верификация данных позволила идентифицировать ведущие генотипы нашей выборки согласно международным стандартам. Аллель 1 гена gltB соответствует новому ST261, а аллель 2 — ST36, определенному ранее у нозокомиальных штаммов Achromobacter spp. в США [8].

В том случае, когда последовательность гена gltB в образце отличается от известных ранее, наступает черед схемы MLST, которую необходимо использовать в полном объеме для определения генотипа.

Кроме того, применение схемы MLST способствовало видовой идентификации Achromobacter spp. В выборке из 25 генотипов мы определили представителей пяти видов: A. ruhlandii, A. xylosoxidans, A. marplatensis, A. dolens и A. pulmonis. Преобладали виды A. ruhlandii (58,5%) и A. xylosoxidans (35,4%). Определенные нами доминирующие генотипы относились к виду A. ruhlandii, в том числе российский эпидемический штамм для больных муковисцидозом A. ruhlandii ST36. Согласно приведенным данным, определение вида может сыграть решающую роль в молекулярно-эпидемиологическом расследовании и важно в экспресс-диагностике новых образцов. Следовательно, второе место в предлагаемом протоколе заняла дополнительная мишень схемы MLST — фрагмент гена nrdA в 765 п.н. Фрагмент nrdA из основной схемы имеет размер 449 п.н. Однако в процессе амплификации и секвенирования мишени nrdA исследователь получает фрагмент в 954 п.н. Более протяженный в 5’ области участок nrdA765 позволяет дифференцировать виды Achromobacter spp. Следует отметить, что коэффициент дифференциации нашей выборки по этой мишени ниже, чем по gltB. Например, 5 генотипам A. ruhlandii соответствует 4 аллеля nrdA765, а 16 генотипам A. xylosoxidans — только 7 аллелей этой мишени. Однако вид Achromobacter spp. — важный диагностический признак для молекулярно-эпидемиологических исследований.

Третья мишень в предлагаемой быстрой схеме анализа — ген bla-OXA. Оксациллиназы — β-лактамазы класса D, которые не снижают активности в присутствии ингибиторов, применяемых в комбинации с антибиотиками: клавулановой кислоты, тазобактама и сульбактама [9]. Одновременное определение вида (группы видов) и потенциальной антибиотикорезистентности расширяет информативность анализа. Как правило, все представители одного вида Achromobacter spp. содержат в геноме одинаковый аллель bla-OXA или его варианты (см. табл. 2). Виды A. xylosoxidans и A. marplatensis не различимы по этой мишени, представители видов A. dolens, A. ruhlandii имеют свои характерные аллели, для малочисленных пока штаммов A. pulmonis ген bla-OXA с праймерами [5] детектировать не удается. Возможно, у представителей данного вида ген bla-OXA отсутствует.

Предлагаемый протокол экспресс-генотипирования Achromobacter spp. в биологических образцах включает выделение тотальной ДНК из образца, полученного от пациента, амплификацию и секвенирование фрагментов трех генов (gltB, nrdA765, bla-OXA), анализ последовательностей и заключение о виде, генотипе Achromobacter spp. в образце и наличии и характеристике варианта гена оксациллиназы. Такой подход удешевляет исследование, сокращает его сроки, позволяет быстро установить наличие эпидемического штамма, следовательно, изолировать пациента и, таким образом, предотвратить распространение инфекции в отделении стационара.