Введение

Отрубевидный (разноцветный) лишай — хроническое рецидивирующее заболевание кожи, распространенное повсеместно, но чаще оно встречается в тех странах, где повышены температура и влажность воздуха. Болеют лица как молодого, так и пожилого возраста, заболевание регистрируется и у детей [1, 2].

Возбудителем заболевания является условно-патогенный дрожжеподобный гриб, который существует в трех формах: округлой — Pityrosporum orbiculare, овальной — Pityrosporum ovale и мицелиальной — Malassezia (способны изменяться друг в друга). Условно-патогенными грибы рода Malassezia считаются потому, что постоянно присутствуют на коже человека, на коже здоровых лиц их выявляют в небольших количествах (3–6%). Из них M. sympodialis, M. globosa, M. furfur, M. restricta являются основными возбудителями заболевания отрубевидным лишаем. При иммунодефицитных состояниях микоз попадает в разряд патологий, требующих незамедлительного лечения [3].

Таким образом, отрубевидный лишай в строгом смысле представляет собой количественный и качественный дисбиоз кожи. В норме M. furfur встречается в небольших количествах, а при заболевании отрубевидным лишаем становится на коже преобладающим. Меняется и соотношение мицелиальных и споровых форм грибов [4].

В последние десятилетия на фармацевтическом рынке представлен широкий выбор антифунгальных средств для наружного применения. Разработано уже более 200 различных препаратов, наиболее перспективными из них являются средства, оказывающие фунгистатическое и фунгицидное действие одновременно. Этим требованиям отвечает активное действующее вещество тербинафина гидрохлорид, синтетическое производное аллиламина. Его активность в отношении дрожжеподобных грибов в зависимости от вида может быть фунгицидной и фунгистатической [5].

Лекарственные препараты на основе тербинафина гидрохлорида при грибковых поражениях кожи и ногтей применяют уже более 25 лет под разными торговыми названиями в различных странах — Швейцарии, Франции, Бразилии, Венгрии, Индии и т.д.

Наиболее полная информация о клинических исследованиях и постклиническом опыте применения о препарате данного типа собрана на примере препарата ламизил производства компании «Новартис Фарма С.А.С.», Франция. Результаты многочисленных клинических исследований свидетельствуют об его высокой эффективности и хорошей переносимости пациентами при лечении онихомикозов ногтей пальцев кистей и стоп.

Данный препарат представляет собой раствор активного вещества тербинафина в концентрации 1% в растворе этилового спирта, применяется наружно для обработки пораженных грибковой инфекцией поверхностей кожи, ногтей и волос. Содержит вспомогательные вещества: пропиленгликоль, макрогола цетостеарат, этанол 96%. Данные вещества хорошо изучены, информация о них представлена во всех справочниках и соответствующих монографиях Европейской фармакопеи [6–10].

Полный аналог лекарственного препарата ламизил, спрей для наружного применения 1%, содержащий активное синтетическое производное аллиламина — тербинафина гидрохлорид, зарегистрирован на территории Российской Федерации под названием ЭКО-Тербин, спрей для наружного применения 1%. Препарат активен в отношении дерматофитов (Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, T. verrucosum, T. violaccum, T. tonsurans, Microsporum canis, Epidermophiton floccosum), дрожжевых грибов рода Candida (в основном C. albicans) и определенных диморфных грибов (Pityrosporum (Malassezia) orbiculare). Активность в отношении дрожжевых грибов в зависимости от их вида может быть фунгицидной или фунгистатической [11].

Для регистрации данного препарата предприятие АО «ЭКОлаб» своими силами и с привлечением сторонних организаций, таких как РУДН им. Патриса Лумумбы Испытательный центр ЦКП (НОЦ), Институт токсикологии ФМБА России, ООО «Смуз Клиникал Трайлз», Санкт-Петербургское ГБУЗ «Городская Мариинская больница», страховая компания ОАО СК «Альянс», провело все необходимые процедуры по разработке, подтверждению эффективности, безопасности и качества и формированию регистрационного досье на препарат для подачи в Минздрав России на регистрацию.

Материал и методы

Для подготовки всего комплекта документов и формирования регистрационного досье для государственной регистрации препарата АО «ЭКОлаб» выполнило комплексную поэтапную работу от разработки технологии получения препарата до проведения клинических испытаний и подтверждения эффективности противогрибкового лекарственного препарата.

На этапе I работ проведены: оценка состава препарата, доступности и стоимости сырья и материалов на рынке, закупка сырья и материалов; разработка лабораторной технологии; составление проекта нормативного документа (НД), макета упаковки, инструкции по медицинскому применению; разработка аналитических методик для контроля показателей качества полученного продукта; подтверждение стабильности и определение срока годности методом «ускоренного старения» и его подтверждение долгосрочными испытаниями; валидация аналитических методик определения действующего вещества и примесей; трансфер технологии на опытно-промышленное производство, валидация технологического процесса.

Этап II заключался в проведении доклинических исследований и сравнительного изучения токсичности препарата ЭКО-Тербин, спрей для наружного применения 1%, производитель АО «ЭКОлаб» (далее — ЭКО-Тербин) и зарегистрированного препарата-аналога ламизил, спрей для наружного применения 1%, производитель «Новартис Фарма С.А.С.», Франция (далее — ламизил).

Этап III включил:

— получение разрешения Минздрава России на проведение открытого, рандомизированного исследования по изучению эффективности и безопасности препаратов ЭКО-Тербин и ламизил у пациентов с разноцветным лишаем;

— проведение открытого, рандомизированного исследования по изучению эффективности и безопасности препаратов ЭКО-Тербин и ламизил у пациентов с разноцветным лишаем;

— составление технического задания, заявки и закупку оборудования для производства лекарственного препарата в форме спрея;

— подачу заявки в Минпромторг России на проведение внеплановой инспекции производства АО «ЭКОлаб» с целью внесения в лицензию на фармацевтическую деятельность лекарственной формы спрей;

— регистрацию в Минздрав России лекарственного препарата ЭКО-Тербин;

— выпуск 3 последовательных серий препарата и проведение ревалидации технологического процесса.

Этап I

Сбор документов и все необходимые исследования проведены в соответствии с требованиями ФЗ от 12.04.10 №61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств» и Правил надлежащей производственной практики, утвержденных Приказом Министерства промышленности и торговли РФ от 14.06.13 №916 [12, 13].

Определение стабильности и установление сроков годности проведено согласно ОФС.1.1.0009.15 «Сроки годности лекарственных средств» [14].

Проект НД, макета упаковки, инструкции по медицинскому применению созданы согласно Методическим рекомендациям по содержанию и оформлению необходимых документов, из которых формируется регистрационное досье на лекарственный препарат для медицинского применения в целях его государственной регистрации [15].

Валидация аналитических методик по показателям «количественное определение» и «родственные примеси» проведена на базе РУДН им. Патриса Лумумбы Испытательный центр ЦКП (НОЦ) с предоставлением отчета о проведенной работе. Валидация аналитических методик количественного определения тербинафина гидрохлорида методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в лекарственном препарате ЭКО-Тербин и количественного определения родственных примесей методом ВЭЖХ проведена по следующим параметрам: «специфичность», «пригодность хроматографической системы», «линейность», «предел обнаружения», «предел количественного определения», «правильность», «повторяемость», «устойчивость». Работа выполнена на следующем оборудовании:

— высокоэффективный жидкостной хроматограф Agilent1260 с автосамплером и диодноматричным детектором;

— весы аналитические ACCULAB ATILON ATL-220d4-1, США, 0,1 мг;

— весы аналитические MettlerToledoMX5, Швейцария, 0,001 мг;

— pH-метр лабораторный Metrohm pH Lab 827.

Использовали стандартные образцы:

— тербинафина гидрохлорид, USP RS, кат. №1643496.

— тербинафин примесь B, USP RS, кат. №164532.

Разработка технологии получения лекарственного препарата и составление лабораторного, опытно-промышленного и промышленного регламента проведены в соответствии со стандартом отрасли [16]. Валидация технологического процесса и упаковки лекарственного препарата выполнена в соответствии с Руководством PIC/S [17].

Этап II

Проведены исследования общей токсичности, острой токсичности, подострой токсичности, аллергенного действия на белых нелинейных крысах, мышах. Крысы массой 160–180 г, возраст 13–14 нед; мыши — соответственно 18–20 г, 8–9 нед. Животных содержали в соответствии с правилами, принятыми в Европейской конвенции по защите позвоночных животных. Крысы и мыши по 10 особей находились в пластиковых клетках на подстилке из мелкой древесной стружки. Температура воздуха в виварии 20–22 °C, влажность не более 50%, объем воздухообмена (вытяжка/приток) 8:10, световой режим (день/ночь) 1:1. Кормление животных дважды в день. Условия содержания животных соответствовали правилам лабораторной практики (GLP) и Приказу Минздрава России №267 от 19.06.03 «Об утверждении правил лабораторной практики» [18, 19]. Изучение раздражающего действия проведено на кроликах-самцах породы Шиншилла массой в среднем 3,2 кг.

Этап III

Проведено проспективное открытое сравнительное рандомизированное параллельно-групповое исследование терапевтической эквивалентности, эффективности и безопасности препаратов ЭКО-Тербин и ламизил у пациентов с разноцветным лишаем на базе клинического центра Санкт-Петербургского ГБУЗ «Городская Мариинская больница» по протоколу исследования и разрешения на проведение клинического испытания, выданного Минздравом России. Страхование жизни и здоровья пациентов осуществила компания ОАО СК «Альянс».

Исследование проводилось в соответствии с ФЗ РФ №61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств», ГОСТ Р52379–2005 «Надлежащая клиническая практика», этическими принципами Хельсинкской декларации и Правилами обязательного страхования жизни и здоровья пациента, участвующего в клинических исследованиях лекарственного препарата [12, 20, 21].

Участие в исследовании приняли 64 пациента (мужчины и женщины) с диагнозом «разноцветный лишай» (код по МКБ-10 В36.0), 4 — выбыли на этапе скрининга. Данные 60 пациентов использовались для анализа параметров безопасности и переносимости исследуемого препарата/препарата сравнения, данные 58 пациентов (закончивших исследование по протоколу) — для анализа параметров эффективности исследуемого препарата и препарата сравнения.

Исследование полностью проведено в условиях амбулаторного приема пациентов врачом. Длительность терапии 7 сут.

Проведены следующие визиты.

Скрининг (Визит 0) (–14...–1-й день от начала терапии) — предварительное обследование пациентов, оценка соответствия пациентов критериям включения/невключения.

Визит 1 (1-й день терапии) — рандомизация, назначение исследуемой терапии. Визит не позднее 24 ч от визита скрининга.

На визите 1 пациенты, соответствующие критериям включения и не имеющие критериев невключения, случайным образом были распределены в 2 группы в соотношении 1:1. Пациенты 1-й группы получали препарат ЭКО-Тербин наружно в дозе, достаточной для увлажнения элементов, 2 раза в сутки с интервалом 12 ч в течение 7 дней. Пациенты 2-й группы получали препарат ламизил наружно в дозе, достаточной для увлажнения элементов, 2 раза в сутки с интервалом 12 ч в течение 7 дней.

Визит 2 (8-й день от начала терапии) — окончание терапевтического курса. Визит на следующий день после последнего применения препарата.

Визит 3 (21-й день от начала терапии; 14-й день после отмены препарата) — последующее наблюдение пациента, включал оценку окончательной клинической эффективности исследуемой антимикотической терапии.

Клиническое излечение — отсутствие гиперпигментированных пятен, шелушения.

Микологическое излечение — отсутствие дрожжевой и мицелиальной формы Malassezia spp.

Полное излечение — отсутствие клинической симптоматики и грибов рода Malassezia spp. в кожных чешуйках, полученных с поверхности кожи на месте разрешившихся очагов поражения.

Исследуемые препараты признаются эффективными при достижении пациентами полного (клинического и микологического) выздоровления и терапевтически эквивалентными при отсутствии статистически значимых различий по показателям клинической и антимикотической эффективности, при достижении статистически значимого различия частоты случаев эффективного лечения 30% между исследуемым препаратом и препаратом сравнения.

Оценку безопасности проводили на протяжении всего исследования (с момента первого приема препарата) по следующим параметрам:

— частота возникновения и развития нежелательных явлений, регистрируемых по данным спонтанных сообщений пациентов, а также по данным осмотра, клинически значимым изменениям жизненно важных показателей (артериальное давление (АД), частота сердечных сокращений (ЧСС), частота дыхательных движений (ЧДД), температура тела), клинически значимым отклонениям показателей лабораторных анализов от референсных значений;

— изменения жизненно важных показателей (АД, ЧСС, ЧДД, температура тела) относительно исходного уровня;

— изменения показателей лабораторных анализов относительно исходного уровня.

Статистический анализ выполнен с применением языка программирования для статистической обработки данных R. Использовали базовое программное обеспечение Statistika 7.0 («Statsoft Ins.», США). Для оценки эффективности и безопасности статистические тесты проведены для двусторонней гипотезы, уровень статистической значимости принят равным 0,05.

Для сравнения интервальных данных, распределенных по нормальному закону распределения, использовали двухвыборочный t-критерий Стьюдента, по отличному от нормального — критерий Манна—Уитни. Проверку на нормальность осуществляли с помощью критерия Шапиро—Уилка.

Для описания количественных переменных и при оценке безопасности для описания количественных переменных использовали следующие характеристики: среднее, среднее геометрическое значение, минимальное и максимальное значения, стандартное отклонение, медиана, квартили, коэффициент вариации.

Обработка категориальных данных проведена с использованием таблиц частот, точного критерия Фишера, отношения шансов, 95% доверительного интервала. Для описания категориальных данных было запланировано использование процентов.

Для интервальных данных после проверки на соответствие нормальному закону распределения (критерий Шапиро—Уилка) проведено сравнение на основании дисперсионного анализа (при нормальном распределении данных) или с помощью критерия Фридмана для зависимых переменных (при распределении данных, отличном от нормального).

Для сравнения независимых выборок было запланировано использование критерия Манна—Уитни (при распределении, отличном от нормального) и t-критерия Стьюдента (в случае нормального распределения данных).

Сравнение категориальных данных проводили с использованием критерия χ² или точного критерия Фишера. Для описания категориальных данных планировали использование частот и процентов.

Сравнение интервальных результатов обследования пациентов разных групп, полученных на одном из этапов исследования, было запланировано провести с помощью t-критерия Стьюдента (для нормально распределенных данных) или непараметрического критерия Манна—Уитни (для данных с распределением, отличным от нормального). Проверку данных на соответствие нормальному закону распределения осуществляли с помощью критерия Шапиро—Уилка.

Сравнение интервальных результатов обследования пациентов в рамках одной группы, но полученных на разных этапах исследования проводили с помощью t-критерия Стьюдента для зависимых выборок (для нормально распределенных данных) или непараметрического критерия Вилкоксона (для данных с распределением, отличным от нормального). Проверку данных на соответствие нормальному закону распределения осуществляли с помощью критерия Шапиро—Уилка.

В анализе применяли только непараметрические методы, поскольку гипотеза о нормальности, проверенная с помощью критерия Шапиро—Уилка, нигде не подтвердилась.

Результаты и обсуждение

Этап I

Практика проведения валидационных работ по методикам количественного определения содержания основного вещества, родственных примесей и вспомогательных веществ, наличие которых должно контролироваться, дает понимание сути методик и осознание необходимости строгого соблюдения всех параметров и условий. В результате при последующей эксплуатации валидированных методик значительно снижается вероятность получения недостоверных результатов.

Экспериментально доказано, что разработанные аналитические методики количественного определения тербинафина гидрохлорида, примесей и этанола в лекарственном препарате ЭКО-Тербин:

— обеспечивают получение достоверных результатов. Достоверность результатов доказана путем установления специфичности, линейности, предела обнаружения, предела количественного определения, правильности, повторяемости и устойчивости;

— параметры аналитических методик, влияющие на достоверность результатов, достаточны и установлены правильно;

— внесение изменений и дополнений в методики не требуется. Методики пригодны для анализа.

Этап II

Экспериментальные исследования острой и подострой токсичности препарата ЭКО-Тербин проведены в сравнении с зарегистрированным препаратом-аналогом ламизил. При исследовании острой токсичности на грызунах при внутрижелудочном пути введения значения ЛД₅₀ исследуемого препарата составили 10,75±0,3 г/кг (мыши) и 9,9±0,5 г/кг (крысы) и практически не отличались от значений для препарата сравнения — соответственно 9,9±0,4 и 10,15±0,6 г/кг.

Клиническая картина интоксикации обоих препаратов характеризовалась оцепенением животных, прерываемым спорадическими метаниями; гибель наступала в течение 12–24 ч при явлениях паралича. Состояние животных, переживших интоксикацию, нормализовалось в течение 2–3 сут. Вскрытие животных спустя 14 дней после острого введения препаратов не показало наличия каких-либо остаточных явлений, связанных с перенесенной интоксикацией. У животных, получивших внутрижелудочно высокие дозы препарата, последствия перенесенной интоксикации проявлялись в достоверном снижении динамики массы тела по отношению к контролю, различий между сравниваемыми препаратами не выявлено. При накожном нанесении летальных эффектов не удалось достичь при максимально технически возможных дозах, признаков интоксикации не отмечено.

Результаты токсикологических исследований, некропсии и данные наблюдений за экспериментальными животными на протяжении 14 дней после острого введения позволяют отнести препарат ЭКО-Тербин, а также препарат сравнения ламизил к IV классу малотоксичных лекарственных веществ [22].

Проведенные исследования свидетельствуют об отсутствии различий по показателям острой токсичности между препаратом ЭКО-Тербин в сравнении с зарегистрированным препаратом-аналогом ламизил.

Результаты исследований подострой токсичности препарата ЭКО-Тербин при накожном применении 1 раз в сутки в течение 30 дней в дозах 500 и 5000 мг/кг у крыс обоих полов показали, что препарат не приводит к каким-либо заметным негативным эффектам. Проведенные исследования не выявили сколько-нибудь значимого влияния препарата на основные витальные показатели животных. Патоморфологические исследования также не выявили каких-либо изменений внутренних органов, свидетельствующих о негативном побочном действии.

Полученные результаты исследований свидетельствуют о хорошей переносимости и безвредности препарата ЭКО-Тербин. При накожном применении препарат не оказывает никакого заметного негативного действия на организм подопытных животных и в этом отношении не отличается от зарегистрированного препарата-аналога. Он не обладает аллергенными свойствами, выявляемыми в реакции общей анафилаксии, непрямой дегрануляции тучных клеток и конъюнктивальной пробе.

На основании результатов подострого эксперимента можно рассчитать индекс безопасности (ИБ 8,4), что в соответствии с классификацией опасности лекарственных препаратов для клинического применения (ИБ >5) относится к III классу малотоксичных (малоопасных) лекарственных препаратов.

Этап III

Изучение эффективности и безопасности, а также терапевтической эквивалентности препаратов ЭКО-Тербин и ламизил у пациентов с разноцветным лишаем проведено как проспективное открытое сравнительное рандомизированное параллельно-групповое клиническое исследование.

Всего в исследование вошли 64 пациента, 4 из них выбыли на этапе скрининга и 60 пациентов были разделены на 2 терапевтические группы и приняли хотя бы одну дозу препарата. Данные по всем пациентам (n=60) использованы в анализе безопасности. По протоколу закончили исследование 58 пациентов, данные которых использовали для анализа эффективности проводимой терапии.

На основании анализа результатов исследования, относящихся к параметрам эффективности, можно заключить, что при применении препаратов ЭКО-Тербин и ламизил у пациентов, страдающих разноцветным лишаем, наблюдалось полное (клиническое и микологическое) выздоровление; 95% доверительный интервал для разности частот выявления эффективного лечения обоими препаратами соответствовал требованию протокола относительно параметров терапевтической эквивалентности между исследуемым препаратом и препаратом сравнения (достижение статистически значимого различия частоты случаев эффективного лечения в 30% между исследуемым препаратом и препаратом сравнения). Препараты ЭКО-Тербин и ламизил признаны эффективными и терапевтически эквивалентными.

В ходе клинического исследования с участием пациентов, страдающих разноцветным лишаем, оценена безопасность препарата ЭКО-Тербин по сравнению с препаратом ламизил. Оба препарата продемонстрировали благоприятный профиль безопасности. За время исследования не зарегистрировано ни одного серьезного нежелательного явления или летального исхода. Ни один из пациентов не выбыл из исследования досрочно по причине развития нежелательного явления или серьезного нежелательного явления. Отклонений жизненно важных показателей на протяжении всего исследования не наблюдалось.

Во время проведения исследования зарегистрировано одно нежелательное явление (острое респираторное заболевание) после приема препарата сравнения ламизил, не отвечавшее критериям серьезности, не потребовавшее медикаментозного лечения и, по мнению исследователей, не имевшее связь с препаратом сравнения.

Заключение

Разработана промышленная технология получения российского лекарственного препарата с подтвержденным сроком годности, валидированными методиками количественного определения действующего вещества, родственных примесей и этанола.

При доклиническом изучении общей токсичности (острой и подострой), раздражающих свойств и аллергенности препарата ЭКО-Тербин в сравнении с зарегистрированным препаратом-аналогом ламизил определены параметры токсичности в остром эксперименте в условиях его внутрижелудочного введения (мыши и крысы) и нанесения на скарифицированную кожу спины у крыс. В подостром эксперименте изучено влияние раствора в дозах 500 и 5000 мг/кг при аппликации на регулярно скарифицируемую кожу на крысах в течение 30 дней.

В остром эксперименте при накожном нанесении летальных эффектов не зарегистрировано. Результаты подострого эксперимента показали, что у животных в целом не наблюдали развития патологических сдвигов со стороны функций изученных органов и систем, а также дистрофических, деструктивных, очаговых склеротических изменений в паренхиматозных клетках и строме изучаемых органов. Местно раздражающего действия не выявлено.

По показателям острой токсичности и влиянию на физиологические, биохимические и гематологические показатели экспериментальных животных в условиях подострого эксперимента исследуемый препарат ЭКО-Тербин является биоэквивалентным препарату ламизил.

Изучение аллергенных свойств на основе реакции общей анафилаксии, реакции иммунных комплексов, конъюнктивальной пробы и непрямой реакции дегрануляции тучных клеток показало, что оба препарата не оказывают аллергизирующего действия.

Проведенное клиническое исследование показало, что исследуемый препарат ЭКО-Тербин и препарат сравнения ламизил являются эффективными и терапевтически эквивалентными в отношении лечения разноцветного лишая.

В ходе исследования доказано, что препараты ЭКО-Тербин и ламизил обладают аналогичными характеристиками переносимости и безопасности. Профили безопасности обоих препаратов благоприятные. За время исследования не зарегистрировано ни одного серьезного нежелательного явления или летального исхода. Ни один из пациентов не выбыл в связи с нежелательным явлением/серьезным нежелательным явлением.

В результате выполнения всех этапов разработки, трансфера технологии, доклинических и клинических исследований, подготовки регистрационного досье АО «ЭКОлаб» зарегистрировало и выпускает лекарственный препарат ЭКО-Тербин, спрей для наружного применения 1% с доказанной эффективностью и безопасностью применения в отношении лечения микозов.

В современном мире, когда многие иностранные фармацевтические компании ушли с российского рынка, актуальным становится выпуск собственных препаратов, не уступающих по эффективности и безопасности оригинальным препаратам-аналогам.

Препарат ЭКО-Тербин хорошо зарекомендовал себя в отношении лечения микозов, за время применения препарата не выявлено нежелательных, серьезных нежелательных явлений или летального исхода.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — С.Г. Марданлы, Е.П. Рогожникова

Сбор и обработка материалов — С.Г. Марданлы, Е.П. Рогожникова

Написание текста — Е.П. Рогожникова, Я.А. Рогожников

Редактирование — Е.П. Рогожникова, Я.А. Рогожников

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors’ contributions:

The concept and design of the study — S.G. Mardanly, E.P. Rogozhnikova

Collecting and interpreting the data — S.G. Mardanly, E.P. Rogozhnikova

Drafting the manuscript — E.P. Rogozhnikova, J.A. Rogozhnikov

Revising the manuscript — E.P. Rogozhnikova, J.A. Rogozhnikov