Введение

Современная регенеративная медицина широко использует в клинической практике биодеградируемые скаффолды для совершенствования процесса восстановления кожи в полном объеме после повреждения, а также для коррекции ее возрастных изменений [1–5]. Ответная реакция дермы в зоне введения импланта зависит от таких факторов, как композиция биоматериала, тип полимера, масса вводимого филлера, его структурная организация, размер гранул, объем занимаемой ими площади, а также характер поверхности материала, что и определяет результат взаимодействия биоматериала и кожи. Данные литературы и собственные исследования [6] позволяют считать, что наиболее перспективными филлерами для активации дермы и ее восстановления являются кальцийсодержащие филлеры, которые по классификационной схеме относятся к долгоживущим имплантам с хорошо выраженным эффектом аугментации [7, 8]. Для данного исследования мы выбрали препарат Facetem, так как он отличается от ранее изученных филлеров формой микросфер, имеющих вид Lattice-pore. При этом пространственная структура микросфер и паттерн его деградации характеризуются тем, что Facetem организован по типу «капустного вилка», а это способствует постепенному расщеплению филлера слой за слоем, модуль за модулем, что должно обеспечивать эффект более выраженного и пролонгированного периода аугментации.

Цель исследования — изучение характера влияния инъекционного импланта на основе гидроксиапатита кальция с технологией коллагенстимулирующих микросфер на клеточный компартмент дермы.

Материал и методы

В исследование включены 30 крыс-самцов породы Вистар с массой тела 200–250 г (НИЦ «Курчатовский Институт» — ПЛЖ «Рапполово»). Содержание и дизайн исследований согласованы с Независимым этическим комитетом КубГМУ, протокол №54 от 11.10.17.

Животным опытной группы вводили препарат Facetem (Южная Корея), в группе интактных животных (контроль) использовали стерильный физиологический раствор. Препарат вводили субдермально в объеме 0,05 мл, биологический материал забирали в сроки, соответствующие 1 и 2 нед и 1, 2, 3 и 5 мес. С целью определения экспрессии иммуногистохимических (ИГХ) маркеров использовали моноклональные антитела CD68 (LabVision) для оценки макрофагов, виментин (LabVision) для оценки состояния фибробластов. Эффект ремоделирования внеклеточного матрикса изучали с использованием актина α-SMA с помощью антител Anti-Actin-antibody («Abcam», Англия). Проводку и заливку материала выполняли в процессорах фирмы «Tissue-Tek VIP5Jr» (Япония). Из парафиновых блоков изготавливали срезы толщиной 4 мкм с использованием ротационного микротома HM 340E («MICROM Laborgerate GmbH», Германия). Для количественной оценки уровня экспрессии виментина и актина (α-SMA) использовали метод компьютерной морфометрии. Критерием оценки выбрана площадь, занимаемая виментин-положительным материалом и α-SMA-положительным материалом, визуализируемым в процессе проведения ИГХ-реакции. Результаты измерений выражали в квадратных мегапикселях.

Визуальные исследования, их документирование, а также получение микрофотографий для компьютерной морфометрии проводили с использованием микроскопа Laboval 4 Carl Zeiss Jena и цифровой камеры для микроскопии DCM 310 при увеличении 400´. Подсчет клеток, экспрессирующих рецепторы CD68, проводили в 30 полях зрения при увеличении 200х.

Все цифровые данные статистически обрабатывали с использованием программы Statistika 10 Trial. Проверку характера распределения вариационных рядов производили с помощью критерия Пирсона. Во всех исследованных вариационных рядах значения Аз и Ех мало отличались от нуля, поэтому можно было констатировать, что распределение показателей является нормальным. Учитывая близость распределений значений к нормальному, дополнительно проводили сравнение средних величин по Стьюденту. Влияние фактора на различие значений показателей проводили с помощью однофакторного (фактор препараты) дисперсионного анализа (по критерию Фишера p<0,001). Нулевую гипотезу отвергали при уровне статистической значимости p<0,05.

Результаты и обсуждение

Изучение ИГХ-статуса клеток дермы в ответ на введение препарата Facetem показало наличие различий в ответной реакции. Наиболее спорными представляются результаты окраски на виментин, который в качестве промежуточных филамент выявляется в фибробластах, где он выполняет функцию поддержания целостности дермы путем увеличения секреции белков внеклеточного матрикса. Этот эффект находит подтверждение в результатах выявления виментина уже в срок, соответствующий первой неделе после его введения. Для количественной оценки уровня виментина мы исследовали зоны микропрепаратов, соответствующие расположению импланта, а также участки дермы над и под ним (табл. 1).

Таблица 1. Площадь, занимаемая виментин-положительным материалом (мегапиксели²)

Примечание. Здесь и в табл. 2, 3: p — различие с предыдущим сроком.

Дерма под имплантом характеризуется наличием значительного числа отростчатых клеток с высокой экспрессией виментина. Причем клетки такого типа локализуются в зоне как поверхностного, так и глубокого компартментов. Отдельные виментин-положительные клетки появляются и в самом импланте (рис. 1). В последующие сроки наблюдения уровень экспрессии виментина в клетках дермы и в зоне импланта растет, при этом меняется характер его распределения. В зоне импланта виментин выявляется в составе стенок микросфер, причем в двух видах: с одной стороны, это фибриллярный слой, достаточно четко структурированный по краю микросферы, с другой — это клетки монослоя, окружающего просвет микросфер. Между последними значительное количество мелких отростчатых клеток типа фибробластов с высоким уровнем экспрессии виментина. Спустя 1 мес структурированность участка импланта меняется и в нем появляется много клеток, экспрессирующих виментин. Согласно фазности разыгрывающейся реакции, речь может идти о появлении в импланте и активированных макрофагов. Они располагаются группами по 5–6 клеток, при этом на фоне диффузной интенсивной окраски на виментин цитоплазма таких клеток обнаруживает присутствие округлой формы «перфораций» с четкими краями. В зоне дермы над имплантом появляются скопления фибробластов, заполняющих зону ее поверхностного компартмента. (рис. 2).

Рис. 1. Виментинпозитивные клетки в зоне введения импланта через 1 нед.

Иммуногистохимическая реакция (×400). 1 — микросферы.

Рис. 2. Виментинпозитивные клетки в зоне введения импланта через 1 мес.

Иммуногистохимическая реакция (×400). 1 — микросферы.

С увеличением срока пребывания импланта в дерме от 3 до 5 мес происходит уменьшение числа микросфер и уровня экспрессии виментина. Для зоны дермы над имплантом клетки, содержащие виментин, смещаются в сосочковый слой, отдельные из них мигрируют в эпидермис, где они участвуют в реализации механотрансдукции, это приводит к улучшению в визуальной оценке статуса эпидермиса после введения филлера (рис. 3).

Рис. 3. Зона введения импланта через 3 мес.

1 — виментинпозитивные клетки в сосочковом слое дермы. Иммуногистохимическая реакция (×400).

В зоне под имплантом в первые 2 нед эксперимента динамика отсутствует, достоверное увеличение площади виментин-положительного материала регистрировали к концу первого месяца эксперимента (рис. 4).

Рис. 4. Динамика содержания виментина в различные сроки исследования.

Изучение патоморфологических преобразований в дерме в условиях введения филлера Facetem показало активную роль в этом процессе и макрофагов, при этом уже на ранних этапах ответной реакции, которая разворачивается по типу реакции на инородное тело. Спустя 1 нед после пребывания Facetem в дерме зона его локализации типируется в виде микросфер, окруженных тонкой фибриллярной оболочкой, кнаружи от которой располагаются клетки с умеренной экспрессией CD68, клетки мелкие, окрашены диффузно (табл. 2). Количество клеток, экспрессирующих рецептор CD68, колебалось от 5 до 7 в поле зрения, составляя в среднем 6±1 клетку. Здесь типируются также макрофаги с пенистой структурой цитоплазмы (рис. 5). Через 1 мес клетки макрофагального типа удается типировать и в зоне дермы над имплантом, это мелкие клетки с небольшим количеством отростков и низкой экспрессией рецепторов CD68, их количество варьировало от 9 до 13 в поле зрения, составляя в среднем 11±2 клетки. Местами положительную реакцию обнаруживает и аморфный матрикс дермы. В центре импланта между микросферами большое число клеток с вакуолизированной цитоплазмой и высокой экспрессией CD68, местами эти клетки сливаются.

Таблица 2. Среднее количество клеток, экспрессирующих рецепторы CD68, в одном поле зрения микроскопа (M±m)

Рис. 5. Зона введения импланта через 1 нед.

1 — микросферы; 2 — CD68⁺-макрофаги. Иммуногистохимическая реакция (×400).

Через 2 мес отмечается увеличение общего числа клеток до 17±2 в поле зрения, обнаруживающих реакцию на CD68 в зоне дермы, при этом соотношение мелких и крупных клеток сдвигается в сторону последних. Спустя 2 мес зона импланта уменьшается, снижается и число микросфер. При этом дерма над имплантом содержит большое число макрофагов с высоким уровнем экспрессии CD68. В самом импланте картина меняется таким образом, что клетки становятся крупными, цитоплазма их вакуолизирована, уровень экспрессии CD68 от умеренного до высокого. Здесь появляются и многоядерные клетки, цитоплазма их дает положительную реакцию на CD68. Стенки микросфер типируются по окраске окружающего их монослоя. К третьему месяцу пребывания импланта в дерме в зоне глубокого компартмента выявляются крупные клетки с большим числом отростков, цитоплазма содержит интенсивно окрашенные гранулы, что можно трактовать как факт активации экзоцитоза (рис. 6).

Рис. 6. Зона введения импланта через 3 мес.

1 — CD68⁺-клетки. Иммуногистохимическая реакция (×400).

Не исключено, что макрофаги также секретируют виментин в зону экстрацеллюлярного матрикса дермы (ЭЦМ), что позволяет этим клеткам включаться в процесс пролиферации фибробластов и синтез коллагена.

При избирательном выявлении α-SMA-рецепторов в течение первой недели после введения Facetem в зоне дермы типируются мелкие веретеновидной формы клетки с высоким уровнем их экспрессии (табл. 3).

Таблица 3. Средняя площадь, занимаемая α-SMA-положительным материалом (мегапиксели²)

На границе поверхностного и глубокого компартментов дермы видны единичные стресс-фибриллы. Ко второй неделе наблюдения происходит увеличение общего числа структур, обнаруживающих присутствие α-SMA за счет увеличения общего числа клеток, выявляемых в дерме, за счет увеличения числа кровеносных сосудов с α-SMA-положительными клетками и увеличения числа «волокон стресса» с преимущественной локализацией в зоне сосочкового слоя. В зоне импланта (рис. 7) также появляются мелкие клетки с высоким уровнем экспрессии α-SMA.

Рис. 7. Зона введения импланта через 2 нед, α-SMA-положительные клетки.

1 — микросферы. Иммуногистохимическая реакция (×400).

К первому месяцу пребывания импланта в дерме клетки, экспрессирующие α-SMA-рецепторы, выявляются в капсуле, окружающей имплант, и в самом импланте. При этом в последнем случае в единичных микросферах типируются α-SMA-положительные клетки, видны они и между микросферами (рис. 8).

Рис. 8. Зона введения импланта через 1мес, α-SMA-положительные клетки.

1 — микросферы. Иммуногистохимическая реакция (×400).

Ко 2 мес число клеток с α-SMA-рецепторами увеличивается и в поверхностном, и в глубоком слоях дермы с появлением значительного числа «волокон стресса», а также в результате увеличения числа кровеносных сосудов в зоне поверхностного слоя дермы за счет клеток, формирующих их стенки. «Волокна стресса» приобретают направление перпендикулярное дермо-эпидермальной границе. Спустя 3 мес пребывания импланта в дерме общее число α-SMA-положительных клеток снижается за счет клеток дермы, утративших этот тип рецепторов, а также в результате слияния α-SMA-экспрессирующих клеток в процессе формирования волокон стресса, которые теперь локализуются на границе сосочкового и сетчатого слоев (рис. 9). Положительную экспрессию сохраняют клетки, локализованные по периферии капсулы, окружающей имплант, причем эти клетки выявляются в зоне соединительной ткани, формирующей тяжи, которые ранее ограничивали имплант.

Рис. 9. Зона введения импланта через 3 мес, α-SMA-положительные клетки, 1 — «волокна стресса».

Иммуногистохимическая реакция (×400).

Рис. 10. Реакция дермы на введение Facetem.

Заключение

Полученные данные позволяют считать, что Facetem относится к биодеградируемым филлерам, индуцирующим ответ на его введение по механизму развития воспалительной реакции за счет повреждения дермы в зоне импланта. Стадии развития этого процесса хорошо известны: альтерация — воспаление — пролиферативный период — фаза трансформации [7]. Изучение клеточного состава дермы в различные сроки после введение филлера показало, что воспалительный ответ непродолжителен и ограничен участком импланта и зоной дермы над ним. Ведущими и ключевыми регуляторами здесь выступают макрофаги с рецептором CD68, о чем свидетельствует динамика показателей клеточного компартмента дермы.

Так, в первую неделю после введения импланта наблюдается выход массы моноцитов из циркулирующей крови, последующая их дифференцировка заканчивается образованием макрофагов. Вероятно, макрофаги выступают здесь в качестве главного повреждающего фактора из-за выделения ими биологически активных продуктов, токсичных по отношению к дерме. Подтверждением факта развития асептического воспаления выступают появляющиеся к началу второй недели и типируемые в следующие сроки наблюдения эпителиоидные клетки, являющиеся результатом трансформации макрофагов. Цитоплазма этих клеток («пенистые макрофаги») приобретает вид вакуолизированной массы, что связано с формированием у них секреторной функции (Lin и соавт., 2020). Совокупность активированных макрофагов и эпителиоидных клеток приводит к формированию эпителиоидно-клеточной гранулемы, где плохо фагоцитируемый чужеродный материал остается в виде кристаллов гидроксиапатита, входящего в состав препарата Facetem. В сроки 2, 3 и 4 мес постепенно происходит утилизация материала Facetem со снижением числа микросфер в зоне введения импланта. Поскольку эффект активации макрофагов сопровождается пролиферацией фибробластов с присущим для этих клеток коллагеногенезом [7], это в конечном счете приводит (3–4 мес наблюдения) к фиброзу. Этот период чаще всего определяют как фазу ремоделирования. Она является заключительным этапом в реакции дермы на имплант и может протекать по-разному [9, 10]. В нашем случае процесс ремоделирования проявляется стимуляцией миофибробластов по механизму локального воспаления. Миобластическая модуляция клеток фибробластов оказалась связана с появлением первоначально «волокон стресса», которые трансформируются затем в миофибробласты, меняющие статус ЭЦМ. Это и есть эффект ремоделирования. Сократительная природа миофибробласта приводит к увеличению жесткости и механическому напряжению ЭЦМ по мере регенерации дермы.

Участие авторов:

Разработка концепции, формирование идеи; формулировка и развитие ключевых целей и задач, подготовка и редактирование текста — составление черновика рукописи, утверждение окончательного варианта, участие в научном дизайне; принятие ответственности за все аспекты работы: Г.М. Могильная

Проведение исследования — планирование и проведение эксперимента; анализ и интерпретация полученных данных, подготовка и редактирование текста, утверждение окончательного варианта — участие в научном дизайне; принятие ответственности за все аспекты работы, проведение статистического анализа — применение статистических, математических вычислительных методов для анализа и синтеза данных исследования: Е.В. Фомичева, А.А. Евглевский

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors’ contributions:

Concept development, idea formation; formulation and development of key goals and objectives, Preparation and editing of the text — drafting of the manuscript, approval of the final version, participation in scientific design; taking responsibility for all aspects of the work: G.M. Mogilnaya

Conducting research — planning and conducting an experiment; analysis and interpretation of the data obtained, preparation and editing of the text, approval of the final version — participation in scientific design; taking responsibility for all aspects of the work, conducting statistical analysis — application of statistical, mathematical computational methods for the analysis and synthesis of research data: E.V. Fomicheva, A.A.Evglevskiy