Введение
Проблема диагностики и терапии патологических состояний урогенитальной системы, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, продолжает оставаться актуальной на протяжении последних десятилетий. Одним из наиболее распространенных инфекционно-воспалительных заболеваний мочеполовой сферы у женщин является урогенитальный кандидоз (УГК): до 75% женщин репродуктивного возраста имеют хотя бы один эпизод вульвовагинального кандидоза в течение жизни, при этом у 5–8% из них сохраняется стойкая клиническая картина заболевания с 4 рецидивами и более в течение года [1–3]. По данным зарубежных исследований, УГК ежегодно регистрируется у 10–20% женщин [1, 4], а согласно результатам работ отечественных ученых, вульвовагинальный кандидоз составляет от 30% до 49,4% в структуре воспалительных заболеваний мочеполовых органов у женщин репродуктивного возраста [5–7]. Воспалительные заболевания мочеполовой системы, обусловленные Candida spp., выявляются у 60–70% женщин во время беременности [8], а у 27,6–32% беременных и у 50–53% женщин во время родов наблюдается колонизация слизистых оболочек гениталий грибами рода Candida [9, 10].
В последние годы все больше исследователей обращают внимание на изменение этиологического спектра УГК — на снижение в его структуре удельной доли Candida albicans. Видовая неоднородность возбудителей заболевания проявляется вариабельностью клинической картины инфекционно-воспалительного процесса, что нередко приводит к несвоевременной диагностике и терапии. Наряду с этим актуальной проблемой является рост уровня антимикотической резистентности грибов рода Candida.
Современные представления об этиологическом спектре и патогенетических особенностях урогенитального кандидоза
С начала 2000-х годов во многих научных работах обращается внимание на изменение видовой структуры УГК, заключающееся в выраженной тенденции к увеличению роли non-albicans видов Candida в развитии кандидозных поражений мочеполовой системы. Абсолютное превалирование C. albicans в этиологическом спектре УГК, достигавшее, по данным исследований 1960–1990 гг., 97–98%, постепенно снизилось, и частота выявления данного вида в следующие десятилетия варьировала в диапазоне 79,7–86,0%. Согласно данным научных исследований, проведенных в данный период, в образцах, полученных из урогенитального тракта, нередко идентифицировались C. glabrata (7–22%), C. tropicalis (2–14%), C. parapsilosis (3–8%), C. krusei (5–7%), C. kefyr (2–6%), а в ряде наблюдений описана колонизация урогенитального тракта такими видами, как C. torulopsis, C. guilliermondii, C. rugosa, C. inconspicua, C. norvegensis, C. lusitaniae, C. lipolytica, C. famata, C. zeylanoides [11–13]. В 2000–2010 гг. в США, ряде европейских стран, Китае и Австралии C. glabrata выявляли у 7–16% пациентов с УГК, в Италии — у 28%, а в Турции, Индии и Нигерии у 30–37% [14–18]. По данным отечественных авторов, в общей этиологической структуре заболевания частота выявления C. albicans составляла 80–92%, C. glabrata — 5,6–7,5%, C. krusei — 2,9–19,0%, а ассоциации C. albicans с non-albicans видами наблюдались у 2,4–9,8% пациентов [11, 19].
Среди работ, посвященных анализу видовой структуры и антимикотической резистентности грибов рода Candida, отдельно необходимо выделить широкомасштабное многоцентровое международное исследование ARTEMIS Disk (1997–2007 гг.), по результатам которого установлено, что доминирующими (92–99,7%) в этот период видами Candida во всем мире являлись C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis и C. krusei [20–22]. А.С. Анкирская и соавт. (2006), обобщив исследуемые показатели в России, установили преобладание в видовой структуре грибов C. albicans без выраженной тенденции к росту или снижению за изучаемый период: среди выделенных изолятов как по численности (62,9–70,9%), так и по частоте выявления (83,7–86%) C. albicans была абсолютно доминирующим видом [19]. В то же время исследователи обращали внимание на то, что в общем этиологическом спектре возросла доля других видов дрожжеподобных грибов: C. glabrata — с 10,2 до 11,7%, C. tropicalis — с 5,4 до 8,0%, C. parapsilosis — с 4,8 до 5,6%; также наблюдалось выявление редко идентифицируемых видов: C. rugosa, C. inconspicua, C. norvegensis, проявляющих резистентность к флуконазолу [13, 19, 21–23].
Анализируя данные научных публикаций последних лет, можно утверждать о сохранении тенденции к изменению видовой структуры УГК. Так, исследование L. Sherry и соавт. (2017) позволило установить, что среди 212 обследованных пациенток с кандидозным вульвовагинитом C. albicans выявили лишь у 71%, C. glabrata — у 15%, C. dubliniensis — у 6%, C. parapsilosis — у 3%, у остальных 5% идентифицировали C. tropicalis, C. lusitaniae и C. guillermondii [24]. В работе Е.А. Межевитиновой и соавт. (2018) показано, что non-albicans виды Candida составляли 23,8% от общего количества изолятов, выделенных у пациенток с рецидивирующим УГК [7].
По мнению большинства исследователей, среди non-albicans представителей рода Candida наибольшее клиническое значение имеют C. glabrata, C. krusei и C. parapsilosis, однако в ряде работ обращается внимание на возросшую в последние годы этиологическую роль C. tropicalis, C. kefyr, Cryptococcus neoformans, Sacharomyces cerevisiae и др. [25–29].
Известно, что уникальной особенностью грибов рода Candida является их способность образовывать биопленки. Предполагается, что именно продукция биопленок является одним из основных факторов патогенности и развития резистентности дрожжеподобных грибов и их ассоциантов к лекарственным препаратам.
Биопленки C. albicans представляют собой сообщества микроорганизмов, которые встроены во внеклеточный матрикс, образуют сложную трехмерную архитектуру и по своей природе устойчивы к противогрибковым препаратам, иммунной системе хозяина и другим воздействиям окружающей среды, что делает биопленочные инфекции серьезной клинической проблемой [30, 31].
Создание биопленки Candida начинается с прикрепления дрожжевой формы гриба к биотической поверхности и формирования базального слоя, функционирование которого обеспечивает ее максимальную адгезию. В дальнейшем, оставаясь прикрепленными к «якорному» слою, грибы рода Candida переходят в дрожжевую фазу размножения. Впоследствии из этих делящихся дрожжевых клеток начинают образовываться псевдогифальные и гифальные клетки, которые продолжают удлиняться и пролиферировать на протяжении всего цикла развития до завершения формирования биопленки [32]. В большинстве экспериментальных исследований in vitro установлено, что биопленка созревает около 24 ч и характеризуется структурированной смесью дрожжевых, псевдогифальных и гифальных клеток, которые окружены внеклеточным матриксом, состоящим из белков, углеводов, липидов и нуклеиновой кислоты. Матрица биопленки функционирует как защитный физический барьер от окружающей среды, обеспечивая ее структурную целостность. Это имеет решающее значение для устойчивости зрелых биопленок к механическому разрушению [33]. Наличие матрицы наиболее выражено во время и после стадии созревания биопленки. На этих этапах биопленка имеет толстый (несколько сотен микрометров) структурированный вид с четко выраженными слоями (клетки дрожжевой формы, направленные к твердой поверхности; клетки гифов и псевдогифов, отходящие от поверхности, и внеклеточный матрикс, охватывающий все клетки). Гифы, которые появляются на более поздних стадиях развития биопленки, образуют каркас, поддерживающий ее различные компоненты и способствующий тем самым общей архитектурной стабильности структуры. После полного созревания биопленка медленно диспергирует преимущественно дрожжевые клетки, которые отрываются от гифа, что способствует распространению инфекции [34, 35].
Характеристики биопленки зависят от способности каждого вида дрожжеподобных грибов производить внеклеточные полимерные вещества и демонстрировать диморфный рост, а также от субстрата биопленки, наличия источника углерода и других факторов. Кроме того, транскрипционный контроль над такими процессами, как адгезия, образование биопленки, филаментация и производство полимерных веществ демонстрирует большое разнообразие в зависимости от вида дрожжеподобных грибов. Эти различия влияют не только на постоянство колонизации и развитие инфекционного процесса, но также и на резистентность к противогрибковым препаратам, обычно выявляемую в клетках биопленки Candida, которая функционирует в качестве барьера для диффузии лекарств и избыточной экспрессии переносчиков лекарственной устойчивости и обусловлена сочетанием таких факторов, как повышенная экспрессия лекарственных эффлюксных помп, защитные свойства внеклеточного матрикса и наличие «персистирующих» клеток в биопленке [36].
До недавнего времени основное внимание исследователи уделяли формированию биопленок Candida у постоянно катетеризированных пациентов, т.е. пациентов с повышенным риском развития системных жизнеугрожающих инфекций [37–39]. В 2009 г. на экспериментальной модели показана способность C. albicans к образованию биопленки на слизистой оболочке полости рта, ротоглотки при иммуносупрессивных состояниях [40], а в 2010 г. учеными США проведено исследование, которое впервые установило, что грибы рода Candida способны к образованию абиотических биопленок не только при системных инфекциях, но и локально, например на слизистой оболочке влагалища [41–43].
Способность Candida взаимодействовать с различными видами других микроорганизмов в биопленках также является ключевым фактором «горизонтального» распространения генов резистентности, что необходимо учитывать при решении этой проблемы [32, 44].
Резистентность грибов рода Candida к антимикотическим препаратам и анализ ее современных показателей
Одними из наиболее часто применяемых в клинической практике антимикотическими лекарственными средствами являются препараты группы азолов (флуконазол, клотримазол, миконазол и др.), которые действуют путем ингибирования синтеза фермента стерол-14-α-деметилазы, участвующего в превращении ланостерола в эргостерол — важный компонент мембраны грибковых клеток.
К настоящему времени описаны три основных механизма устойчивости к азолам у грибов рода Candida [45–47]:
1) индукция эффлюксных помп, которая приводит к снижению концентрации лекарственного средства в ферментной мишени стерол-14-α-деметилазе в клетке гриба: повышенное регулирование работы помп (CDR и MDR) потенцирует образование резистентности к азолам у C. albicans (MDR1, CDR1, CDR2), C. glabrata (CgCDR1, CgCDR2) и C. dubliniensis (CdMDR1, CdCDR1);
2) изменение или повышение регуляции стерол-14-α-деметилазы, которая кодируется геном ERG11: мутации в ERG11 связывают с предотвращением взаимодействия азолов с ферментативным участком;
3) создание «обходных путей» метаболизма: мутации в гене ERG3 препятствуют образованию 14-α-метил-3,6-диола из 14-α-метилфекостерола. Замена эргостерола на последний стерол приводит к появлению функциональных мембран клеток гриба и, следовательно, предотвращает разрушительный эффект азолов.
Полиены (амфотерицин B, нистатин, леворин, натамицин) также используются в качестве основных фунгицидных агентов против нескольких видов грибов Candida. Ранее предполагалось, что эффект полиенов обусловлен внедрением в эргостеролсодержащие мембраны с образованием мембранных каналов, которые вызывают «утечку» клеточных компонентов и в конечном итоге гибель клеток. Однако недавно проведенные подробные структурные и биофизические исследования показали, что полиены связывают и извлекают из клеточных мембран главный грибковый мембранный стерол — эргостерол, препятствуя выполнению эргостеролом важных клеточных функций, что лишает гриб энергетических субстратов и способности к размножению [48, 49]. В связи с тем, что полиены непосредственно воздействуют на этот центральный молекулярный узел в клеточной физиологии дрожжей, клинически значимая резистентность к препаратам данной группы наблюдается редко.
Новейший класс противогрибковых препаратов — эхинокандины (микафунгин, каспофунгин, анидулафунгин) представляют собой большие полусинтетические липопептидные молекулы, которые неконкурентно ингибируют фермент (1,3)-β-d-глюкансинтазу, кодируемую геном FKS1. Таргетирование FKS1 нарушает синтез основного биополимера (1,3)-β-d-глюкана клеточной стенки, что приводит к потере целостности клеточной стенки и возникновению выраженного стрессового воздействия на клеточную стенку гриба. Эхинокандины обладают фунгицидным действием против большинства видов Candida. Хотя общая распространенность резистентности к эхинокандину остается низкой, их широкое использование для профилактики кандидоза и применение пролонгированных схем лечения привело к увеличению частоты клинически значимой резистентности. Количество устойчивых к эхинокандину штаммов C. glabrata в последние годы резко возросло, что с учетом проявления у них перекрестной резистентности к азолам представляет серьезную проблему [50].
Предполагают, что в отличие от многих других комменсалов грибы рода Candida способны для своей жизнедеятельности использовать несколько различных источников углерода. При этом рост C. albicans на альтернативных источниках (например, молочной кислоте) может вызывать значительные изменения в свойствах грибковой клеточной стенки, делая ее гораздо более устойчивой к таким стрессам, как осмотическое давление, воздействие противогрибковых препаратов и другим, по сравнению с клетками, выращенными на более традиционных источниках углерода (например, глюкозе) [30].
Как указано ранее, резистентность к лекарственным препаратам может быть связана со способностью Candida образовывать биопленки. По данным нескольких исследований, защиту биопленок от воздействия противогрибковых препаратов определяет ряд факторов:
1) внеклеточный матрикс: имеются данные, свидетельствующие о том, что β-1,3-глюканы матрикса могут специфически связываться с амфотерицином B, не позволяя тем самым ему оказывать свое действие на грибковые клетки матрикса в биопленке, а обработка биопленок β-1,3-глюканазой повышает их восприимчивость к флуконазолу [30];
2) работа эффлюксных помп, кодируемых генами CDR1, CDR2 и MDR1;
3) персистирующие клетки метаболически неактивных грибов, которые могут возвращаться к метаболически активным формам и способствовать реформированию биопленки после прекращения действия противогрибкового препарата [31, 51].
Исследование, проведенное в Centre of Biological Engineering, установило роль матрикса C. tropicalis в формировании резистентности к амфотерицину B, заключающуюся в его неспособности полностью предотвратить образование и уничтожить биопленки данного вида грибов. Интересно отметить, что амфотерицин B привел к значительному увеличению производства биопленки за счет увеличения общего содержания белка и углеводов в матрице [52]. В исследовании T. Fernandes и соавт. (2016) установлено, что и вориконазол не оказывал влияния на предварительно сформированные биопленки C. tropicalis. Примечательно, что при обработке вориконазолом предварительно сформированных биопленок также наблюдалось увеличение общей биомассы грибов [53]. Вероятно, это явление связано с реакцией клеток биопленки C. tropicalis на стресс, вызванный присутствием препарата, что привело к усилению продукции матриц биопленки. E. Fonseca и соавт. (2014) выявили подобное явление в матриксе биопленок, обработанных флуконазолом [54].
Во многих клинических исследованиях, проведенных в различных странах в 2000–2005 гг., показано отсутствие резистентности C. albicans к флуконазолу [55, 56] либо ее наличие у небольшой доли штаммов (2,1–3,6%) [16, 57]. Так, в приводившемся ранее исследовании ARTEMIS Disk чувствительность к флуконазолу зарегистрирована у 90,2% изолятов C. albicans. Пониженную чувствительность к флуконазолу (<75% чувствительных штаммов) продемонстрировали C. glabrata (68,7%), C. krusei (8,6%), C. guilliermondii (73,5%), C. inconspicua (22,6%), C. rugosa (49,9%), C. norvegensis (41,9%), C. valida (23,8%), C. humicola (50%), C. lambica (0%), C. ciferrii (50%), C. marina (0%) [20–23, 27]. Однако в исследовании, проведенном в тот же период времени в Бельгии, наблюдалось достаточно частое (23%) выделение резистентных к флуконазолу штаммов C. albicans. Наиболее высокая устойчивость к данному препарату отмечена у non-albicans изолятов [58]. В 2006 г. А.С. Анкирская и соавт. в своем исследовании установили, что за 6-летний период наблюдения количество изолятов, чувствительных ко всем изучаемым антимикотическим препаратам (флуцитозин, амфотерицин B, миконазол, кетоконазол, итраконазол, флуконазол), среди non-albicans видов C. albicans снизилось с 60 до 19,2% [19].
Актуальность проблемы резистентности дрожжеподобных грибов подтверждается докладом Всемирной организации здравоохранения (2014), в котором отмечено, что Candida spp. (включая non-albicans виды) повсеместно проявляют резистентность к флуконазолу. Однако в современных научных работах представлены данные как о высокой чувствительности Candida к препаратам азолового ряда [7, 26], так и о значительном росте устойчивости к ним дрожжеподобных грибов, в особенности среди non-albicans представителей рода Candida [59, 60]. В.Г. Арзуманян и соавт. (2015) при изучении вагинальных изолятов Candida spp., выделенных в 1999–2000 и 2008–2010 гг., установили, что за этот период чувствительность к флуконазолу снизилась в 2,2 раза, к кетоконазолу — в 2,7 раза, к клотримазолу — в 1,9 раза, к итраконазолу — в 1,7 раза. По данным G. Sadeghi и соавт. (2018), 96,5% изолятов C. parapsilosis, 88,9% — C. orthopsilosis, 85,7% — C. tropicalis и 50,0% — C. guilliermondii были чувствительны к флуконазолу, а C. glabrata и C. krusei демонстрировали высокий (до 100%) уровень резистентности [61, 62]. Многие авторы в последние годы обращают внимание на низкую (43,7–48%) чувствительность грибов рода Candida к итраконазолу [63, 64].
В исследовании A. Rezaei-Matehkolaei и соавт. (2016) все выделенные изоляты C. albicans были чувствительны к флуконазолу в диапазоне минимальной подавляющей концентрации (МПК) 1–0,25 мкг/мл, в то время как C. glabrata и C. kefyr — при МПК 0,25 мкг/мл; МПК для клотримазола у 88,2% изолятов составила 0,25 мкг/мл, 3 изолята оказались дозозависимыми при концентрации 0,5 мкг/мл и только 1 (2,9%) изолят ингибирован при 1 мкг/мл клотримазола и расценен авторами как устойчивый к препарату [65]. А в работе В.В. Новиковой и соавт. (2017) отмечено, что чувствительность C. albicans к производным азолов была существенно ниже: к клотримазолу — 33,3%, к кетоконазолу — 11,1%, к флуконазолу — 9,3% [66]. Несмотря на то что в обсуждении результатов своего исследования авторы связывают такие низкие показатели чувствительности с особенностями используемого ими диско-диффузионного метода, в своей более поздней работе они подтверждают полученные данные и демонстрируют, что у C. albicans наиболее часто выявляется резистентность к кетоконазолу (87,8%) и флуконазолу (92,3%), а наиболее чувствительны представители данного вида к нистатину (75,5%) и амфотерицину (77,5%). В том же исследовании авторы установили, что доля штаммов C. glabrata и C. krusei, чувствительных к амфотерицину, составила 79,5 и 62,5% соответственно, к нистатину — 70,5 и 79,2%, к клотримазолу — 61,4 и 83,3%, а к флуконазолу — лишь 13,6 и 40,3% [67]. Результаты исследования еще одной группы отечественных ученых также демонстрируют невысокий уровень чувствительности дрожжеподобных грибов к препаратам азолового ряда: в исследовании О.А. Пашининой и соавт. (2016) только 54,0% изолятов C. albicans оказались чувствительными к клотримазолу, 46,0% — к итраконазолу, 38,0% — к флуконазолу и 31,0% — к кетоконазолу. Штаммы non-albicans видов Candida еще реже проявляли чувствительность к изученным антимикотическим препаратам: все выделенные культуры C. glabrata и C. krusei были резистентны к кетоконазолу и итраконазолу, а к клотримазолу и флуконазолу проявляли чувствительность только 16,5% выделенных культур [68].
Исследователи обращают внимание на возможность формирования перекрестной устойчивости возбудителей УГК к антимикотическим препаратам. В научной работе Y. Wu и соавт. (2018) сообщалось, что изоляты Candida, устойчивые к флуконазолу, были в 100% наблюдений устойчивы и к итраконазолу, в 76,7% — к вориконазолу, а 53,5% изолятов имели перекрестную устойчивость к флуконазолу, итраконазолу и вориконазолу [47].
Заключение
Урогенитальный кандидоз продолжает оставаться одной из наиболее частых причин воспалительных процессов мочеполовой системы у женщин. Исследования последних лет демонстрируют изменение видовой структуры возбудителей заболевания и выраженную тенденцию к увеличению выявляемости non-albicans видов Candida при вульвовагинитах грибковой этиологии, что обусловливает необходимость оптимизации тактики ведения пациенток с данной патологией и проведения видовой идентификации Candida, особенно в случаях рецидивирующего течения заболевания. Кроме того, в современных условиях невозможно игнорировать неоднородную чувствительность различных видов Candida к антимикотическим препаратам, особенно учитывая тот факт, что C. krusei и некоторые другие non-albicans виды Candida обладают природной устойчивостью к препаратам азолового ряда, наиболее широко применяющимся в терапии урогенитального кандидоза. Присутствие non-albicans штаммов Candida и других оппортунистических грибов является важным фактором, влияющим на выбор схемы лечения и представляющим основную трудность для стратегии эмпирической терапии.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.