Старение кожи, как частный случай старения всего организма, можно рассматривать как изменение стационарного состояния, при котором сложные соединения, например, коллаген, эластин, гликозаминогликаны (ГАГ), в том числе гиалуроновая кислота (ГК) непрерывно синтезируются в ходе одних процессов и распадаются в ходе других [1].

С увеличением возраста скорость образования подобных биомолекул уменьшается, а скорость распада - возрастает [2]. В связи с этим терапия возрастных изменений кожи должна быть направлена на создание физиологически благоприятной среды для усиления метаболической активности клеток кожи [3]. Для этого используется введение монопрепаратов на основе нативной и частично стабилизированной ГК [4]. Первоначально в дерматологии и косметологии ей отводилась роль наполнителя межклеточного пространства, однако в последнее время ГК стала рассматриваться как природный регулятор ряда биологических процессов - миграции фибробластов и пролиферации эпителиальных клеток, стимуляции ангиогенеза, активации компонентов гомеостаза и прочих [5]. Кроме того, определена значимость ГК как транспортного средства для доставки и контролируемого освобождения лекарственных средств [6]. Благодаря развитию новых технологий, в частности инновационной технологии твердофазной модификации биополимерной смеси при совместном воздействии сверхвысоких давлений и сдвиговой деформации, появилась возможность создания новых эффективных препаратов ГК, модифицированной витаминами, микроэлементами, аминокислотами и олигопептидами с геропротекторным, в том числе антиоксидантным, действием. В результате появились препараты для терапии инволюционных изменений кожи с ГК и витамином С, глицином, пролином, лизином, валином, цистеином, метионином, глутатионом, в составе которых ГК не только проявляет свои собственные полезные свойства, но и служит матрицей для включения биологически активных компонентов, наиболее значимых для метаболизма кожи. В литературе имеются данные о способности витамина С влиять на образование ГАГ, в частности ГК и хондроитинсульфата, и стимулировать пролиферацию фибробластов [7]. Физиологическое действие витамина С связывают не только со стимулированием продукции коллагена, но также и с уменьшением синтеза металлопротеиназ - ферментов, разрушающих коллаген дермы. В многочисленных работах подтверждена способность аскорбиновой кислоты улучшать состояние кожи, в том числе эффективно бороться с признаками старения [8]. Аминокислоты (глицин, пролин, лизин, валин) входят в состав основных белков межклеточного матрикса дермы. Их присутствие в инъекционных препаратах наряду с другими низкомолекулярными биорегуляторами и микроэлементами необходимо для запуска синтеза собственного коллагена и эластина, что чрезвычайно важно для достижения устойчивого, пролонгированного во времени эффекта. Серосодержащие аминокислоты цистеин, метионин и трипептид глутатион - это антиоксиданты, действующие на различных стадиях свободнорадикального цепного процесса окисления биомолекул [9].

Таким образом, в результате применения технологии твердофазной модификации был создан ряд препаратов с научно обоснованным составом, потенциально обладающих более высокой эффективностью в терапии возрастных изменений кожи, чем препараты нативной ГК, и при этом экологически безопасных за счет отсутствия сшивающих химических агентов. В связи с вышеизложенным цель настоящего исследования - изучение влияния внутрикожного и подкожного введения ГК, модифицированной биологически активными веществами, на морфофункциональное состояние кожи лабораторных животных и пациентов с возрастными изменениями.

Экспериментальные исследования были выполнены с целью изучения особенностей резорбции (сроки, полнота, тканевая реакция) гелей немодифицированной (нативной) и модифицированной ГК при подкожном (I серия экспериментов) и внутрикожном (II серия) введении.

В I серии экспериментов изучены пять вариантов гидрогелей ГК разных степеней структурирования, содержащих различные включения (витамины, аминокислоты, олигопептиды, вспомогательные вещества):

1. гель №1 - нативная ГК без добавок;

2. гель №2 - ГК, модифицированная витамином С;

3. гель №3 - ГК, модифицированная глутати­оном;

4. гель №4 - ГК, модифицированная фолиевой кислотой;

5. гель №5 - ГК, модифицированная витамином С, пролином, глицином, лизином.

Содержание ГК во всех гелях составляло 1,4%, добавок - 0,4%.

Эксперимент выполнен на 180 белых лабораторных крысах-самцах с массой тела 120-140 г. Наркотизированным животным в межлопаточной области спины слева от средней линии стерильной иглой подкожно вводили по 1,5 мл изучаемых образцов гелей. Справа аналогично вводили 5% раствор нативной ГК.

Животных выводили из эксперимента в течение 1, 3, 7-х и 14-х суток. Визуально оценивали макроскопическую картину места введения гелей: их сохранность и внешний вид, наличие капсулы, состояние окружающих тканей и прочие характеристики. После этого остатки геля вместе с капсулой отбирали для последующего гистологического изучения. Отобранный материал фиксировали в 10% растворе нейтрального (забуференного) формалина. После фиксации в течение 3 сут из биоптата вырезали образец размером 0,3-0,8 см и заливали в парафиновые блоки по стандартной методике. Парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону для выявления зрелых коллагеновых волокон, серебром по Гомори для выявления коллагеновых волокон различной степени зрелости, толуидиновым синим - на кислые ГАГ. Полученные микропрепараты изучали с использованием светового микроскопа Olympus BX51 (Япония), оснащенного цифровой видеокамерой SDU-252 («Спецтелетехника», Россия). Микрофотографирование гистологических препаратов осуществлялось с помощью этой камеры и программы Launch Cam_View. Полученные изображения сохраняли в формате Tiff (16 bit).

Во II серии экспериментов изучали резорбцию и тканевую реакцию при внутрикожном введении гелей ГК. Эксперимент выполнен в Центре биомедицинских технологий РАМН на трех мини-свиньях породы светлогорская, с массой тела 16-20 кг.

Изучены 3 варианта гелей ГК:

1. нативная ГК (контроль);

2. гидрогель ГК, модифицированной витамином С, глицином, пролином и лизином;

3. гидрогель ГК, модифицированной витамином С и глутатионом.

Изучаемые гели вводили на депилированных участках заднебоковой поверхности спины внутрикожно через три вкола, отстоящих друг от друга на 1,5 см. Места вколов отмечали маркером.

Сроки наблюдения - 1, 3 и 5 сут. В указанные сроки под местной анестезией иссекали полоску кожи в зоне введения гелей. Образовавшуюся рану ушивали наглухо. Из всей толщи кожи на местах вколов (через центр вкола) вырезали по 2 образца размером 5×8 мм для гистологического изучения и электронно-микроскопического исследования. Фиксация образцов, изготовление срезов и их окрашивание для гистологического изучения проводились по обычной методике.

На 3-и сутки после введения гелей ГК биоптаты, изъятые от всех трех животных, были подвергнуты электронно-микроскопическому исследованию по стандартной методике, включающей фиксацию глутаровым альдегидом, заливку в эпон-аралдит, просмотр полутонких (толщиной 1-1,5 мкм) срезов при помощи светового микроскопа, просмотр ультратонких срезов (толщиной 25 нм) на электронном микроскопе JEOL JEM-2000 FXII (Япония).

В клинической части исследования приняли участие 90 лиц женского пола зрелого (от 35 до 50 лет) и пожилого возраста (от 60 лет). Средний возраст пациенток, участвующих в исследовании, составил 47,4 года (минимальный возраст - 35 лет, максимальный - 62 года).

По степени выраженности проявлений фото- и хроностарения (согласно шкале Глогау) пациентки были распределены на 3 группы: в 1-ю группу во­шли женщины в возрасте от 35 до 40 лет с двумя или тремя признаками II типа; во 2-ю - от 41 года до 55 лет с преобладанием признаков II типа; в 3-ю - в возрасте от 56 до 62 лет с преобладанием признаков III типа.

Были изучены анамнестические данные, результаты анкетирования до и после процедур, а также результаты клинического осмотра. Для оценки динамики морфофункциональных параметров кожи пациентов использованы неинвазивные методы диагностики функций и морфологии кожи (табл. 1).

Для коррекции инволюционных изменений кожи пациенткам вводили препарат, содержащий магниевую соль ГК (14 мг/мл), модифицированную витамином С и аминокислотами (пролин, лизин, глицин). Препарат вводили внутрикожно на глубину 1,5-3 мм по всей поверхности лица, с расстоянием между точками инъекций 1 см. Общий объем вводимого однократно препарата составлял 1,5 мл, количество процедур - 3, межпроцедурный интервал - 3 нед. Измерения проводили до начала курса лечения (исходное состояние кожи) и через 3-4 нед после завершения процедур.

Статистическая обработка материала проводилась с помощью программного обеспечения Statistica 6.0 for Windows. Для сравнения количественных показателей до и после лечения использовали критерий Стьюдента. Критерием статистической достоверности был уровень р<0,05.

Экспериментальные исследования. При гистологическом исследовании микроимплантатов после подкожного введения ГК установлено, что все виды гелей равномерно распределяются в местах инъекций, пропитывая близлежащие подкожно-жировую клетчатку и соединительную ткань, начиная с 1-х суток после введения. К 7-м суткам этот процесс усиливался, а к 14-м суткам обнаруживались остатки гелей в виде отдельных небольших фрагментов в тканях или в гиперплазированных лимфатических узлах и в макрофагах, фагоцитировавших гель (рис. 1).

В зависимости от иммобилизированного с ГК вещества, определяющего физико-химические и биологические свойства препарата, гель либо быстрее выводился через лимфатическую систему, либо дольше оставался в клетчатке в виде отдельных рыхлых конгломератов. Наибольшая длительность существования отмечалась у гелей ГК, модифицированной либо одним витамином С, либо его комплексом с аминокислотами. Гель немодифицированной ГК подвергался практически полной резорбции уже на 3-и сутки после введения (рис. 2).

Нами было отмечено развитие умеренного асептического воспаления на границе между гелями и окружающими тканями. Наблюдалась умеренная нейтрофильная инфильтрация с максимумом на 1-е сутки, которая сменилась лимфоцитарно-макрофагальной инфильтрацией на более поздних сроках, что могло быть проявлением ответа кожи на повреждение в результате инъекции и введения препарата (рис. 3).

Проведенные эксперименты показали, что инвазивность самих инъекций провоцирует процессы, подобные таковым при ранениях кожи, но с меньшей глубиной и в меньших масштабах. Повреждение различных типов клеток в эпидермисе и дерме запускает каскад межклеточных взаимодействий, развиваются процессы репаративной регенерации, препятствующие разрушению и направленные на восстановление структуры межклеточного матрикса. В итоге репаративные процессы в клетках не только восстанавливают повреждения, но и приводят к обновлению, т.е. «омоложению» структур клеток и внеклеточного вещества и способствуют выходу на более высокий стационарный уровень, где сбалансированные процессы синтеза-распада протекают на повышенных скоростях.

Результаты экспериментальных исследований подтвердили способность препаратов модифицированной ГК усиливать процессы регенерации. На границе между гелем и жировой клетчаткой, начиная с 3-х суток эксперимента, постепенно усиливались пролиферация фибробластов и новообразование капилляров. Эти процессы были наиболее выражены при введении препарата ГК, модифицированной витамином С (рис. 4).

Внутрикожное введение препаратов ГК, модифицированной веществами с антиоксидантными и геропротекторными свойствами (витамин С, глицин, пролин, лизин и глутатион), мини-свиньям также приводило к выраженной пролиферации фибробластов и неоангиогенезу, а при введении гелей, в состав которых, кроме аскорбиновой кислоты, входил аминокислотный комплекс или олигопептид глутатион, активация пролиферативной активности клеток сопровождалась, по данным электронной микроскопии, повышением синтеза и фибриллогенеза коллагена и эластина.

Наши гистологические исследования показали, что при введении всех изучаемых образцов модифицированной ГК происходило врастание фибробластов и капилляров в гель. Однако на всех сроках экспериментов по подкожному и внутрикожному введению гелей признаков образования соединительнотканной капсулы вокруг имплантата не обнаружено (рис. 5).

Сравнительное изучение разных образцов гидрогелей ГК показало специфичность тканевого ответа на низкомолекулярные регуляторы. В исследованиях использовались препараты ГК, модифицированной витамином С, фолиевой кислотой, аминокислотами (глицин, пролин, лизин) и глутатионом. Установлено, что эти низкомолекулярные вещества обладают геропротекторными свойствами, являясь факторами антиоксидантной защиты и антигипоксантами, а также улучшают обмен веществ в коже. Среди них более выраженным действием на регенерацию кожи обладали препараты ГК, модифицированные витамином С и аминокислотами. По сравнению с другими образцами гидрогель немодифицированной ГК не проявил столь существенного влияния на структуру и функции кожи.

Клинические исследования. Большинство испытуемых с инволюционными изменениями кожи и ее придатков субъективно отметили значительный положительный эффект после курса терапии: улучшение тонуса и цвета кожи, уменьшение выраженности морщин, повышение увлажненности кожи. Последний эффект имел тенденцию к нарастанию и пролонгации по мере увеличения количества процедур. Нежелательные явления и осложнения отсутствовали.

Исследование функциональных параметров кожи выявило возрастные особенности. В 1-й группе пациенток все изучаемые показатели до процедуры находились в пределах нормы. У пациенток 2-й и 3-й групп наблюдались возрастные отклонения от нормальных значений. Особенно выраженной была дегидратация кожи.

После курса терапии модифицированной ГК отмечено улучшение всех функциональных параметров кожи. Наиболее существенно повысилась эластичность кожи - достоверное повышение тонуса кожи было отмечено для всех пациенток (рис. 6).

При этом интенсивность ответа на терапию была разной в различных возрастных группах. Так, у пациенток 35-40 лет, у которых все параметры показателей кожи до курса процедур находились в пределах нормы, после терапии параметры приближались к верхней границе нормы. В группе женщин от 41 года до 55 лет отмечено более существенное улучшение всех исследованных параметров после курса терапии. В группе пациенток в возрасте 56-62 лет (с преобладанием признаков III типа старения по Глогау) проведенный курс привел к наибольшему приросту показателей, в особенности увлажненности и жирности кожи, по сравнению с пациентками более молодого возраста: показатель увлажненности вырос на 87%, а жирности - на 46%. Влажность, жирность и рН кожи характеризуют ее барьерные свойства. Поскольку известно, что у женщин старшей возрастной группы наиболее выражен дефицит антиоксидантов в крови и коже, введение ГК, модифицированной витамином С, способствовало снижению интенсивности перекисного окисления липидов в коже, стабилизации клеточных мембран, нормализации рН кожи, а в результате - улучшению ее барьерных свойств и повышению гидратации. Однако, по данным объективной оценки морфофункционального состояния тканей, в результате терапии не произошло компенсации имеющихся возрастных изменений кожи у пациенток 3-й группы, поскольку после процедур показатели, несмотря на улучшения, не соответствовали физиологически нормальным. По субъективным оценкам самих пациенток трех процедур было недостаточно для компенсации имеющихся возрастных изменений кожи.

При исследовании микротопографии кожи методом ультразвукового сканирования были выявлены различия в структуре кожи у лиц разных возрастных групп. Во 2-й и 3-й возрастных группах отмечались меньшие толщина эпидермиса, плотность сосочкового и сетчатого слоя дермы, особенно в суб­эпидермальном слое, по сравнению с этими показателями для более молодых пациенток 1-й группы.

После проведенной терапии показатели, по данным ультразвукового сканирования, имели положительную динамику (табл. 2).

При оценке рельефа кожи методом визиосканирования положительная динамика отмечена по всем исследуемым показателям. Наилучшие показатели после курса терапии были получены в 1-й группе, где пациентки имели изначально менее выраженные изменения по сравнению с исследуемыми в других группах. Во 2-й группе также отмечалась положительная динамика показателей - они приближались к средним значениям параметров микрорельефа 1-й группы. У пациенток 3-й группы также было отмечено улучшение микрорельефа кожи, при этом наилучшие результаты среди всех исследованных показателей были получены при тестировании параметра «гладкость»: он возрос на 81% по отношению к начальному значению (р<0,05) и приблизился к значениям «гладкости» у 1-й группы лиц, что явилось следствием высокой увлажняющей способности препарата модифицированной ГК.

КЛСМ выявила основные признаки инволюционных изменений кожи. На уровне рогового слоя у всех пациенток определялись наряду с характерными безъядерными полигональными клетками высокорефрактерные включения белого цвета (чешуйки), количество которых соответствовало степени выраженности ксероза кожи, а также отмечалось уменьшение высоты сосочкового слоя дермы. У пациенток старшей возрастной группы в ходе визуализации структур кожи на уровне верхних слоев дермы отмечалась фиксация сосочковых капилляров в меньшем количестве, чем у более молодых исследуемых. В более глубоких слоях дермы встречались участки с перекрещивающимися нитевидными структурами неодинаковой толщины с различной степенью архитектурного хаоса, что отражает выраженность деградации межклеточного каркаса дермы.

Общая тенденция КЛСМ-картины кожи после трех процедур введения модифицированной ГК сводилась к общему улучшению степени рефрактерности слоев, т.е. улучшению оптических свойств ткани, что было обусловлено восстановлением уровня гидратации и оптимизацией механизмов гидрорезерва тканей.

В 1-й группе, по данным КЛСМ, отмечалось полное нивелирование проявлений ксероза (уменьшение вплоть до полного исчезновения чешуек - белых ярко окрашенных полигональных структур на поверхности рогового слоя). Архитектоника дермального слоя кожи не претерпела значительных изменений, что укладывается в возрастные морфологические особенности изменений в данной группе.

Во 2-й группе, где изначально отмечались более выраженные проявления сухости кожи, большая степень рефрактерности структур на всех уровнях сканирования, структура эпидермиса, клеточное строение каждого слоя по данным КЛСМ после курса терапии сохраняли свои морфологические особенности без тенденции к каким-либо изменениям, что говорит о безопасности проводимой методики.

В 3-й группе после введения модифицированной ГК значительно уменьшились явления ксероза поверхностных слоев кожи. У пациенток этой группы отмечались наибольшие проявления компенсации имеющегося ксероза кожи, как наиболее выраженного симптомокомплекса среди всех наблюдаемых пациенток. На уровне дермы отмечалось улучшение качественных характеристик сетчатой структуры: волокна имели более упорядоченное расположение с тенденцией к более равномерной структуре.

Для объективной оценки данных КЛСМ-сканирования были изучены параметры средней толщины эпидермиса, так как они косвенно отражают состояние гидрорезерва и метаболической активности более глубоких слоев кожи (табл. 3).

После проведенной терапии отмечалось улучшение изучаемого параметра во всех трех группах наблюдения.

Изучение влияния разных образцов гидрогелей ГК на кожу лабораторных животных выявило улучшение ее структурно-функционального состояния в области введения (повышение количества и активности фибробластов, ангиогенез и неоколлагеногенез) и высокую биосовместимость препаратов с тканями. По сравнению с другими образцами гидрогель немодифицированной ГК не проявил столь существенного влияния на структуру и функции кожи. Динамика резорбции препаратов модифицированной ГК доказала достаточную длительность нахождения их в тканях, что позволяет создавать депо биологически активных веществ в коже.

Результаты клинических исследований модифицированной ГК показали ее безопасность, хорошую переносимость и клиническую эффективность при коррекции возрастных изменений кожи у пациентов разных возрастных групп. Это выражалось в повышении тонуса и улучшении структуры кожи лица, уменьшении выраженности мимических и статических морщин, восстановлении равномерности цвета кожи, а также нивелировании проявлений ксероза у пациентов с инволюционными изменениями.